Imunoblotting (detekcia protilátok v sére pacienta proti určitým antigénom patogénov). Ako sa diagnostikuje AIDS imunoblottingom pre HIV III. Imunochemické farbenie proteínov imobilizovaných na nitrocelulózovej membráne

Čo je imunoblot? Toto je bežná metóda laboratórna diagnostika vírusové infekcie osoba. Považuje sa za jeden z najpresnejších a najspoľahlivejších spôsobov na zistenie prítomnosti HIV. Vo svojej spoľahlivosti predčí aj výsledky imunoblotu sú považované za nevyvrátiteľné a konečné.

všeobecné informácie

Imunoblot - čo to je? Aby bolo možné u človeka rozpoznať infekciu HIV, je potrebné podstúpiť laboratórny test krvného séra na prítomnosť protilátok. Technika imunoblotovania sa tiež nazýva Western blot. Používa sa na detekciu ľudských vírusových infekcií ako doplnková expertná metóda. Je potrebné potvrdiť ELISA - laboratórny test, ktorý umožňuje určiť prítomnosť HIV protilátok v krvi. Znova skontrolujte imunoblotovaním pozitívny test ELISA. Považuje sa za najcitlivejšie, komplexné a drahé.

Účel

Čo je imunoblot? Ide o laboratórnu metódu testovania krvného séra na prítomnosť protilátok proti vírusu. Počas štúdie špecialista najprv oddelí vírusové proteíny v géli a prenesie ich na nitrocelulózovú membránu. Postup imunoblotovania je určený na detekciu HIV rôzne štádiá. V prvej fáze sa purifikovaný vírus z jeho zložiek podrobí elektroforéze a antigény obsiahnuté v jeho zložení sa oddelia podľa molekulovej hmotnosti.

Rozmnožuje sa v živej bunke a vkladá do nej svoju genetickú informáciu. V tomto štádiu sa človek stáva nosičom vírusu HIV, ak bol infikovaný. Špecifikom choroby je, že to na dlhú dobu sa nemusí vôbec prejaviť. Vírus ničí lymfocyty, takže imunita človeka klesá a telo sa stáva neschopným odolávať infekciám. Ak sa HIV lieči správne a včas, pacient sa dožije vysokého veku. Nedostatok terapie nevyhnutne vedie k smrteľný výsledok. Od okamihu infekcie, ale bez liečby, maximálna životnosť nie je dlhšia ako desať rokov.

Zvláštnosti

Imunoblotová analýza je spoľahlivá metóda, ktorá vám umožňuje určiť prítomnosť protilátok proti HIV antigénom prvého a druhého typu. Ak je človek infikovaný, do dvoch týždňov sa objavia protilátky, ktoré sa dajú zistiť oveľa neskôr. Zvláštnosťou HIV je, že množstvo protilátok sa rýchlo zvyšuje a zostáva v krvi pacienta. Aj keď sú prítomné, ochorenie sa nemusí prejaviť skôr ako dva a viac rokov. Metóda ELISA nie vždy presne určí prítomnosť ochorenia, preto je potrebné potvrdenie výsledkov pomocou imunoblottingu a PCR, ak enzýmový imunotest ukazuje pozitívny výsledok.

Indikácie na použitie

Čo je „imunoblot“ už bolo zistené, ale komu je táto štúdia predpísaná? Dôvodom na testovanie pomocou imunoblotingu je pozitívny výsledok testu ELISA. U pacientov, ktorí podstúpia operáciu, je potrebné podstúpiť enzýmový imunotest. Okrem toho by sa mali testovať ženy plánujúce tehotenstvo, ako aj každý, kto je neusporiadaný. sexuálny život. Imunoblotting je predpísaný pacientom s HIV, ak sú výsledky ELISA pochybné. Nasledujúce dôvody môžu byť dôvodom na konzultáciu s lekárom: alarmujúce príznaky:

náhla strata hmotnosti;
slabosť, strata výkonu;
črevná nevoľnosť (hnačka), ktorá trvá tri týždne;
dehydratácia tela;
horúčka;
zvýšiť lymfatické uzliny na tele;
rozvoj kandidózy, tuberkulózy, pneumónie, toxoplazmózy, exacerbácie herpesu.

Pacient sa pred testom nemusí pripravovať žilovej krvi. 8-10 hodín pred testom by ste nemali jesť jedlo. Deň pred darovaním krvi sa neodporúča piť alkoholické alebo kávové nápoje, venovať sa namáhavému fyzickému cvičeniu alebo prežívať úzkosť.

Kde urobiť analýzu?

Kde sa môžem otestovať na HIV? ELISA a imunoblotové štúdie sa vykonávajú na mestských súkromných klinikách, výsledky sa poskytujú do 24 hodín. Je možná aj urgentná diagnóza. Vo verejných zdravotníckych zariadeniach sa testy ELISA a imunoblotting vykonávajú bezplatne v súlade s právnymi predpismi Ruskej federácie. Je povinné kontrolovať infekčné choroby tehotné ženy, ako aj pacienti podstupujúci hospitalizáciu alebo operáciu.

Ako prebieha výskum?

Ako sa vykonáva analýza ELISA? Pozitívny/negatívny imunoblot potvrdzuje alebo vyvracia výsledky enzýmového imunotestu. Postup výskumu je pomerne jednoduchý. Špecialista odoberie venóznu krv, čo netrvá dlhšie ako päť minút. Po odbere vzoriek treba miesto vpichu dezinfikovať a prelepiť leukoplastom. Odber vzoriek sa vykonáva nalačno, takže po zákroku nezaškodí zjesť tabuľku tmavej čokolády alebo vypiť sladký horúci nápoj.

Aby ste dostali odporúčanie na bezplatný test vo verejnom zdravotníckom zariadení, musíte navštíviť praktického lekára. Vo všeobecnosti sa imunoblotting nelíši od iných krvných testov, pokiaľ ide o metódu odberu vzoriek. Metodológia výskumu je jednoduchá. Ak je v krvi človeka vírus, telo začne produkovať protilátky na jeho zničenie. Každý vírus má svoju vlastnú sadu antigénnych proteínov. Detekcia týchto protilátok je základom imunoblotovacej techniky.

cena

Koľko stojí analýza? Imunoblot na HIV nie je lacný test. V priemere stojí skríningové vyšetrenie pomocou metód enzýmovej imunoanalýzy od 500 do 900 rubľov. Imunoblotting je overovacia štúdia, ktorej náklady sú od troch do piatich tisíc rubľov. Viac komplexné metódy sú oveľa drahšie. Napríklad budete musieť zaplatiť asi 12 000 rubľov.

Interpretácia výsledku

Najbežnejšími metódami diagnostiky infekcie HIV sú enzýmové imunosorbentné testy a imunobloty. Používajú sa na stanovenie protilátok proti vírusu imunodeficiencie v krvnom sére. Prítomnosť infekcie je zvyčajne potvrdená dvoma testami: skríningovým a potvrdzujúcim. Interpretáciu výsledkov štúdie by mal vykonať lekár, ktorý tiež stanoví diagnózu a predpíše liečbu. Ak je imunoblot pozitívny, znamená to, že v ľudskom tele je prítomný vírus.

Pozitívny výsledok by nemal byť dôvodom samoliečba, keďže každý pacient môže mať o chorobe iný obraz. Kvalitatívna analýza zahŕňa skríning a overovanie. Ak pacient nemá vírus, výsledok je označený ako „negatívny“. Ak sa zistí skríning, vykoná sa dodatočná overovacia štúdia. Imunoblot je test, ktorý potvrdzuje alebo vyvracia skríning. Ak sa na testovacom prúžku v určitých oblastiach (umiestnenia proteínov) objaví stmavnutie, vykoná sa diagnóza HIV. Ak sú výsledky pochybné, testy sa vykonajú do troch mesiacov.

Môžete zabrániť infekcii vírusom imunodeficiencie, ak budete postupovať určité pravidlá: vyhýbajte sa príležitostnému sexu, pri kontakte používajte kondóm, neberte drogy. Ak sa ochorenie zistí u tehotnej ženy, je dôležité prísne dodržiavať odporúčania ošetrujúceho lekára a nezabúdať na vyšetrenia na prítomnosť vírusu.

Krv sa odoberá zo žily. Potom štúdia pokračuje podľa pokynov:

vzorka sa umiestni do gélu na elektroforetickú separáciu, výsledkom čoho sú špecifické proteíny, ktoré sú citlivé na vírus;
na ošetrený gél sa aplikuje nitrocelulózový papier;
pripravená vzorka sa umiestni do blotovacieho zariadenia.

Na identifikáciu konkrétnych enzýmov je potrebné správne pripraviť papier na laboratórne vyšetrenie. Na tento účel sa naň aplikujú protilátky a značený rádioaktívny konjugát. Výsledok štúdie sa hodnotí vizuálne, skúmajú sa skonštruované enzýmové reťazce.

Dekódovanie výsledkov

Po manipulácii zostanú na papieri pruhy. Nachádzajú sa tam, kde došlo ku konjugácii, to znamená, že aplikovaný liek reagoval s vírusovým proteínom. Týmto spôsobom môžete zistiť časti proteínu:

z jadra HIV-1 – p17, p24, p55;
patogén HIV-2 – p16, p26, p56.

Výsledky imunoblottingu sa považujú za pozitívne, ak sa zistia 2 z 3 proteínov HIV-1 alebo HIV-2. Keďže Western blot (druhý názov štúdie) sa často používa na potvrdenie pozitívny test ELISA Potom sa reakcia skontroluje na špecifické proteíny: gp120/160, gp41 alebo p24. Sú súčasťou troch hlavných génov AIDS - gag, pol a env. Počas počiatočnej diagnózy sa test vykonáva len na proteíny p25, gp110/120 a gp160, ak je výsledok pozitívny, potom sa test vykoná na p24. Táto časť proteínu umožňuje detekciu vírusu v počiatočnom štádiu.

Pozitívny výsledok je dôvodom na hľadanie komplexnejšej diagnostiky. Je nepravdivá iba v 3 prípadoch:

u pacientov s vysoký stupeň bilirubín;
pri kontakte s vírusovými antigénmi;
pre patológie spojivového tkaniva.

Ak pacient nemá línie zodpovedajúce AIDS proteínom, potom je výsledok hodnotený ako negatívny. To znamená, že osoba nie je infikovaná HIV alebo je v období okna. To posledné znamená, že vírus sa mohol dostať do tela, ale ešte sa v ňom nerozvinul. Na zvýšenie presnosti diagnózy sa používajú testovacie systémy:

rekombinantný-HIV;
antigén;
Peptoscreen.

Po ich kontrole sa výsledok považuje za negatívny, ak sa vo vzorke nenachádzajú proteíny gp120, gp160, Sp4.

Existuje ďalšia možnosť interpretácie - neutrálny alebo pochybný výsledok. Vyskytuje sa u tých, ktorí majú sexuálny kontakt s partnerom infikovaným HIV. V ich krvi sa nachádzajú protilátky proti proteínom gp120 a gp160. Tiež pochybná odpoveď počas blotovania je daná, keď je infekcia asymptomatická, to znamená, že je v kľudovom stave.

Je dôležité dôkladne skontrolovať pochybný výsledok. Na tento účel sa používa dynamická štúdia krvného séra, to znamená pravidelné kontroly pomocou metód imunoblotingu a ELISA počas šiestich mesiacov. Tiež menovaný dodatočné vyšetrenia, pretože prítomnosť autoprotilátok a imunitných komplexov v krvi môže byť spôsobená:

infekčné choroby;
prítomnosť rakovinových nádorov;
alergie.

Imunoblotovanie (imunoblot, western blot, western blot)- kombinuje enzýmovú imunoanalýzu (ELISA) s predbežným elektroforetickým prenosom vírusových antigénov na nitrocelulózový prúžok (prúžok).

V tomto krásnom vedeckom názve sa „blot“ s najväčšou pravdepodobnosťou prekladá ako „škvrna“ a „západný“ ako „západný“ odráža smer šírenia tejto „škvrny“ po papieri zľava doprava, teda do geografická mapa to zodpovedá smeru zo západu na východ.“ Podstatou metódy „imunitného blotu“ je, že imunoenzýmová reakcia sa neuskutočňuje so zmesou antigénov, ale s antigénmi HIV, ktoré sa predtým rozdelili imunoforézou do frakcií umiestnených podľa molekulovej hmotnosti na povrchu nitrocelulózovej membrány. Výsledkom je, že hlavné proteíny HIV, nosiče antigénnych determinantov, sú distribuované po povrchu vo forme oddelených prúžkov, ktoré sa objavujú počas enzýmovo viazanej imunosorbentnej reakcie.

Imunoblot zahŕňa niekoľko fáz:

Príprava pásu. Vírus imunodeficiencie (HIV), predtým purifikovaný a zničený na svoje základné zložky, sa podrobí elektroforéze a antigény, ktoré tvoria HIV, sa oddelia podľa molekulovej hmotnosti. Potom sa pomocou metódy blotovania (podobne ako vytlačenie prebytočného atramentu na pijavicu) antigény prenesú na prúžok nitrocelulózy, ktorý teraz obsahuje spektrum antigénových pásov charakteristických pre HIV, ktoré je okom stále neviditeľné.

Ukážkové vyšetrenie. Testovaný materiál (sérum, krvná plazma pacienta a pod.) sa nanesie na prúžok nitrocelulózy a ak sú vo vzorke špecifické protilátky, naviažu sa na striktne zodpovedajúce (komplementárne) antigénne pásy. V dôsledku následných manipulácií sa výsledok tejto interakcie vizualizuje – zviditeľní.

Interpretácia výsledku. Prítomnosť pásov v určitých oblastiach nitrocelulózovej platne potvrdzuje prítomnosť protilátok proti presne definovaným HIV antigénom v testovanom sére.

Prúžok A - Pozitívna kontrola

Prúžok B - Slabá pozitívna kontrola

Dráha C - Negatívna kontrola

Dráha D – Pozitívna vzorka (detegované protilátky proti HIV-1)

V súčasnosti je hlavnou metódou na potvrdenie prítomnosti vírusovo špecifických protilátok v testovacom sére imunoblotovanie (imunoblot). V niektorých prípadoch infekcie HIV, skôr než dôjde k sérokonverzii, sú špecifické protilátky účinnejšie detekované imunoblotovanie ako ELISA. Pri štúdiu metódou imunoblotovania sa zistilo, že protilátky proti gp 41 sa najčastejšie detegujú v sére pacientov s AIDS a detekcia p24 u ľudí vyšetrených na preventívne účely si vyžaduje ďalší výskum, aby sa zistilo, či majú infekciu HIV. Imunoblotovacie testovacie systémy založené na geneticky upravených rekombinantných proteínoch sa ukázali byť špecifickejšie ako konvenčné systémy založené na purifikovanom vírusovom lyzáte. Pri použití rekombinantného antigénu sa nevytvorí difúzny, ale jasne definovaný úzky prúžok antigénu, ktorý je ľahko dostupný pre záznam a vyhodnotenie.

Séra jedincov infikovaných HIV-1 odhalili protilátky proti nasledujúcim hlavným proteínom a glykoproteínom - štruktúrne obalové proteíny (env) - gp160, gp120, gp41; jadro (gag) - p17, p24, p55, ako aj vírusové enzýmy (pol) - p31, p51, p66. Protilátky proti env sú typické pre HIV-2 - gp140, gp105, gp36; gag - p16, p25, p56; pol - p68.

Spomedzi laboratórnych metód potrebných na stanovenie špecifickosti reakcie je najrozšírenejšia detekcia protilátok proti obalovým proteínom HIV-1 - gp41, gp120, gp160 a HIV-2 - gp36, gp105, gp140.

WHO považuje za pozitívne séra, v ktorých sa imunoblotovaním detegujú protilátky proti ktorýmkoľvek dvom HIV glykoproteínom. Podľa týchto odporúčaní, ak dôjde k reakcii iba s jedným z obalových proteínov (gp 160, gp 120, gp 41) v kombinácii alebo bez reakcie s inými proteínmi, výsledok sa považuje za pochybný a odporúča sa opätovné testovanie pomocou súprava z inej série alebo od inej spoločnosti. Ak aj potom zostane výsledok pochybný, odporúča sa pozorovanie 6 mesiacov (výskum po 3 mesiacoch).

Dostupnosť pozitívna reakcia s antigénom p24 môže naznačovať obdobie sérokonverzie, pretože protilátky proti tomuto proteínu sa niekedy objavia ako prvé. V tomto prípade sa odporúča, v závislosti od klinických a epidemiologických údajov, zopakovať štúdiu so vzorkou séra odobratou aspoň o 2 týždne neskôr, a to je presne ten prípad, keď je testovanie párových sér potrebné pri infekcii HIV.

Pozitívne reakcie s proteínmi gag a pol bez reakcie s proteínmi env môžu odrážať skorú sérokonverziu a môžu tiež naznačovať infekciu HIV-2 alebo nešpecifickú reakciu. Jedinci s týmito výsledkami po testovaní na HIV-2 sú opätovne testovaní po 3 mesiacoch (do 6 mesiacov).

V tomto krásnom vedeckom názve sa „blot“ s najväčšou pravdepodobnosťou prekladá ako „škvrna“ a „západný“ - ako „západný“ odráža smer distribúcie tejto „škvrny“ na papieri zľava doprava, to znamená na geografická mapa to zodpovedá smeru zo západu na východ." Podstatou metódy „imunitného blotu“ je, že imunoenzýmová reakcia sa neuskutočňuje so zmesou antigénov, ale s antigénmi HIV, ktoré sa predtým rozdelili imunoforézou do frakcií umiestnených podľa molekulovej hmotnosti na povrchu nitrocelulózovej membrány. Výsledkom je, že hlavné proteíny HIV, nosiče antigénnych determinantov, sú distribuované po povrchu vo forme oddelených prúžkov, ktoré sa objavujú počas enzýmovo viazanej imunosorbentnej reakcie.

Imunoblot zahŕňa niekoľko fáz:

Interpretácia výsledku. Prítomnosť pásov v určitých oblastiach nitrocelulózovej platne potvrdzuje prítomnosť protilátok proti presne definovaným HIV antigénom v testovanom sére.

Prúžok A - Pozitívna kontrola

Prúžok B - Slabá pozitívna kontrola

Dráha C - Negatívna kontrola

Dráha D – Pozitívna vzorka (detegované protilátky proti HIV-1)

V súčasnosti je hlavnou metódou na potvrdenie prítomnosti vírusovo špecifických protilátok v testovacom sére imunoblotovanie (imunoblot). V niektorých prípadoch infekcie HIV, skôr ako dôjde k sérokonverzii, sú špecifické protilátky účinnejšie detegované imunoblotovaním ako testom ELISA. Pri štúdiu metódou imunoblotovania sa zistilo, že protilátky proti gp 41 sa najčastejšie detegujú v sére pacientov s AIDS a detekcia p24 u ľudí vyšetrených na preventívne účely si vyžaduje ďalší výskum, aby sa zistilo, či majú infekciu HIV. Imunoblotovacie testovacie systémy založené na geneticky upravených rekombinantných proteínoch sa ukázali byť špecifickejšie ako konvenčné systémy založené na purifikovanom vírusovom lyzáte. Pri použití rekombinantného antigénu sa nevytvorí difúzny, ale jasne definovaný úzky prúžok antigénu, ktorý je ľahko dostupný pre záznam a vyhodnotenie.

Prítomnosť pozitívnej reakcie s antigénom p24 môže naznačovať obdobie sérokonverzie, pretože protilátky proti tomuto proteínu sa niekedy objavia ako prvé. V tomto prípade sa odporúča, v závislosti od klinických a epidemiologických údajov, zopakovať štúdiu so vzorkou séra odobratou aspoň o 2 týždne neskôr, a to je presne ten prípad, keď je testovanie párových sér potrebné pri infekcii HIV.

Imunoblotting -(z anglického „blot“ - spot) - metóda identifikácie antigénov (alebo protilátok) pomocou známych sér (alebo antigénov). Ide o kombináciu gélovej elektroforézy a ELISA. Najprv sa bakteriálne bunky alebo virióny zničia pomocou ultrazvuku a potom sa všetky antigény vírusu alebo bakteriálnych buniek oddelia elektroforézou a na špeciálnom nitrocelulózovom filme sa získa komerčné činidlo. Pri vykonávaní imunoblotingu sa skúmané sérum pacienta aplikuje na film so známymi antigénmi. Po inkubácii a premytí nenaviazaných protilátok pristúpime k ELISA - antisérum na ľudské imunoglobulíny značené enzýmom a na film sa nanesie chromogénny substrát, ktorý pri interakcii s enzýmom mení farbu. V prítomnosti komplexov antigén-protilátka-antisérum až imunoglobulín-enzým sa na nosiči objavujú farebné škvrny. Metóda imunoblotovania vám umožňuje samostatne detegovať protilátky na rôzne antigény patogén (napríklad pri infekcii HIV imunoblotting deteguje protilátky proti gp120, gp24 a iným antigénom vírusu).

Rádioimunoanalýza (RIA)

Spôsob je založený na reakcii antigén-protilátka s použitím rádionuklidom značeného antigénu alebo protilátky. Ako značky sa používajú 125I, 14C, 3H, 51Cr a ďalšie rádionuklidy. Vzniknuté imunitné komplexy sa izolujú zo systému a ich rádioaktivita sa stanoví na počítadlách (β-žiarenie). Intenzita žiarenia je priamo úmerná počtu naviazaných molekúl antigénu a protilátky.

Verzia RIA na pevnej fáze využívajúca značené protilátky alebo antigény sorbované v jamkách polystyrénových panelov je rozšírená.

RIA sa používa na detekciu antigénov mikróbov, vírusov, rôzne hormóny, enzýmy, liečivých látok imunoglobulíny, ako aj iné látky obsiahnuté v testovanom materiáli v malých koncentráciách 10-12-10-15 g/l.

Kontrolné otázky

Reakcia imunitnej bakteriolýzy: o aký druh reakcie ide; čo je to antigén, čo je to protilátka, mechanizmus reakcie, výrobné metódy, praktické využitie. Imunitná hemolytická reakcia: potrebné zložky, postup; ovládanie, praktická aplikácia. Lokálna hemolytická reakcia v géli (Jerneova reakcia): princíp reakcie, spôsob formulácie, praktická aplikácia. Reakcia fixácie komplementu: princíp reakcie; čo sa tvorí, keď imunitné sérum interaguje so špecifickým antigénom; čo sa stane s doplnkom, ak je prítomný počas tejto interakcie? Aký je osud komplementu, ak medzi antigénom a protilátkami neexistuje špecifická afinita? Akú reakciu možno použiť na určenie toho, čo sa stalo s doplnkom; prečo sa používa táto konkrétna reakcia; Aký je viditeľný pozitívny výsledok RSC? prečo? Aká vlastnosť komplementu sa využíva v prvej fáze RSC? V druhej fáze? Ak konečný výsledok RSC je hemolýza, čo to znamená - pozitívna resp negatívny výsledok? Vysvetlite výsledky: RSK+ + + +, RSK+ + +, RSK+ +, RSK+. Vymenujte zložky prvého systému RSK a zložky druhého systému RSK. Prečo je potrebné testovacie sérum inaktivovať? Ako sa titruje komplement? Hemolytické sérum: čo obsahuje, ako sa získava, aký je titer a ako sa určuje? Aké zvieratá sa používajú na získanie komponentov RSC? Metodika nastavenia RSC v chlade. Pri stagingu, ktorá z nasledujúcich reakcií vyžaduje účasť komplementu: precipitácia, flokulácia, aglutinácia, detekcia nekompletných protilátok, imunitná bakteriolýza, imunitná hemolýza, Jerne, RSC? Imunofluorescenčná reakcia (RIF) - označujú sled udalostí v priamej Koonsovej reakcii; potrebné prísady. Čo je to antigén, čo je to protilátka, čím sa označujú protilátky, ako sa zohľadňuje výsledok reakcie, ako vyzerá pozitívny výsledok? Praktická aplikácia - čo možno pomocou tejto reakcie určiť? Nepriama imunofluorescenčná reakcia - uveďte sled udalostí počas tejto reakcie, potrebné zložky, aký je antigén, aké imunitné séra sa používajú; praktické využitie; výhoda nepriameho RIF v porovnaní s priamou reakciou. Prepojený imunosorbentový test(ELISA) – princíp reakcie; potrebné zložky; uveďte postupnosť udalostí pri vykonávaní reakcie na detekciu antigénu v testovanom materiáli; potrebné zložky; Čo sa stane, keď je výsledok pozitívny, ako to vyzerá? Uveďte postupnosť činností pri vykonávaní testu ELISA na detekciu protilátok v testovacom sére; potrebné zložky; čo sa stane, ak bude výsledok pozitívny? Imunoblotting – princíp reakcie; hlavné etapy; potrebné zložky; ako sa berie do úvahy výsledok; výhody reakcie. Rádioimunoanalýza (RIA) - aké sú hlavné štádiá reakcie; Čím sú označené protilátky alebo antigény, ako sa berie do úvahy výsledok? Imunoelektrónová mikroskopia - princíp metódy; hlavné etapy; potrebné zložky; čím sú protilátky označené? ako sa berie do úvahy výsledok reakcie. Imobilizačné reakcie – princíp metódy, technika nastavenia, komponenty, záznam výsledkov.

Úlohy, ktoré treba splniť počas samoštúdia.

Vyplňte tabuľku „Imunitné reakcie“ v súvislosti s reakciami diskutovanými v rámci tejto témy.

Imunitné reakcie

Práca študentov počas praktickej hodiny

Okamžite začnite pracovať s nastavením fázy 1 RSK, ale zapíšte si to do poznámkového bloku neskôr (pozri nižšie).

1. Imunitná hemolytická reakcia. Pozrite si demonštračnú reakciu imunitnej hemolýzy, načrtnite ju vo forme diagramu, vysvetlite výsledok v experimentálnej a kontrolnej skúmavke.

2. Reakcia fixácie komplementu

a) analyzovať RSK podľa tabuľky;

b) nakreslite do notebooku schému nastavenia RSC vo forme tabuľky;

c) dať druhú fázu RSK (prvá fáza je umiestnená na začiatku hodiny);

d) analyzovať diagnostické prípravky potrebné pre RSC;

d) vziať do úvahy výsledok. Formulujte záver o prítomnosti špecifických protilátok v testovacom sére.

3. Imunofluorescenčná reakcia. Preštudujte si tabuľku, vytvorte si schému reakcie do zošita; pozrite sa na diagnostické séra; určiť, čo sérum obsahuje, ako sa pripravuje, na akú reakciu (priama alebo nepriama RIF) sa používa. Pozrite sa na demonštračný výsledok RIF vo fluorescenčnom mikroskope.

4. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Vo svojom notebooku si vytvorte schému na nastavenie reakcie v dvoch verziách: na detekciu antigénu v skúmanom materiáli a na detekciu protilátok v sére. Prezrite si súpravu zložiek HIV a hepatitídy B. Identifikujte, čo každá zložka obsahuje a na čo sa používa.

5. Imunoblotting. Urobte si diagram reakcie v notebooku; pozrite si ukážku - výsledok reakcie.

6. Rádioimunoanalýza (RIA). Vytvorte si schému reakcie do zošita.

7. Imunitná elektrónová mikroskopia (IEM). Pozrite si ukážku - výsledok reakcie, vytvorte si schému reakcie do zošita, označte šípkami antigén (vírus) a označené protilátky.

Imunoblotting je vysoko citlivá metóda na detekciu proteínov, založená na kombinácii elektroforézy a ELISA alebo RIA. Imunoblotting sa používa ako diagnostická metóda na infekciu HIV atď.

Vo všeobecnom zmysle sa imunoblotovanie týka analýzy zmesi proteínov prenesených na pevný membránový nosič, ku ktorému sú viazané kovalentnými väzbami, po ktorej nasleduje imunodetekcia.

Môžete analyzovať zmes proteínov priamo nanesených na substrát - dot blot analýza - alebo po jej predbežnej frakcionácii elektrofokusáciou, diskovou elektroforézou alebo dvojrozmernou elektroforézou - Western blot analýzou.

Patogénne antigény sa separujú pomocou elektroforézy na polyakrylamidovom géli, potom sa prenesú z gélu na aktivovaný papier alebo nitrocelulózovú membránu a vyvinú sa pomocou ELISA.

Spoločnosti vyrábajú takéto prúžky s „škvrnami“ antigénov. Na tieto prúžky sa aplikuje pacientovo sérum. . Potom sa po inkubácii pacient umyje od nenaviazaných protilátok a aplikuje sa sérum proti ľudským imunoglobulínom značené enzýmom . Komplex vytvorený na prúžku (antigén + protilátka pacienta + protilátka proti ľudskému Ig) sa deteguje pridaním chromogénneho substrátu, ktorý pôsobením enzýmu mení farbu.

Táto metodológia sa tiež používa na selekciu klonov baktérií, fágov alebo vírusov, ktoré exprimujú cieľové klonované génové produkty.

Prenos proteínov na membránu sa uskutočňuje buď pasívne alebo pomocou elektrotransferového zariadenia. Účinnosť prenosu proteínov na membránu je ovplyvnená mnohými faktormi, ako je molekulová hmotnosť proteínov, pórovitosť gélu, čas prenosu a zloženie použitého tlmivého roztoku (trans-pufru).

V závislosti od cieľov a podmienok experimentu sa vyberajú podmienky prenosu, aby sa zabezpečilo najlepšie výsledky. Ako substráty sa bežne používajú nitrocelulózové, polyvinylidéndifluorid (PVDF) alebo kladne nabité nylonové membrány. Nitrocelulóza dokáže viazať až 80 - 100 μg bielkovín na 1 cm2.

Proteíny s nízkou molekulovou hmotnosťou (s molekulovou hmotnosťou menšou ako 20 kDa) sa môžu v dôsledku premývania stratiť, čo umožňuje predbežne študovať polymorfizmus určitých genetických lokusov na základe dĺžok zodpovedajúcich reštrikčných fragmentov DNA.

Pomocou Southern hybridizácie navyše ľahko zistíte, či cieľový gén má vo svojej vnútornej časti miesto hydrolýzy určitým reštrikčným enzýmom, čo umožňuje zvoliť optimálnu stratégiu klonovania študovanej oblasti genómu.

Pomocou podobnej schémy môžu byť molekuly RNA prenesené z agarózového gélu na nitrocelulózový filter. Táto metóda sa nazývala Northern blotting, na rozdiel od Southern blotting, keďže priezvisko Southern v r anglický jazyk znamená „južný“.

Prenos proteínov na filtre z gélu sa preto nazýval Western blotting. Veľké proteíny (>100 kDa) denaturované v roztoku dodecylsulfátu sodného (SDS) sa môžu zle preniesť na membránu, ak je v trans pufri prítomný etanol. Alkohol výrazne zlepšuje prenos bielkovín z SDS-polyakrylamidového gélu, ale zužuje póry v géli, čo vedie k zadržiavaniu veľkých bielkovín.

PVDF membrána je optimalizovaná na imunodetekciu a je schopná zadržať až 160 μg/cm2 špecificky viazaných proteínov s veľmi nízkou úrovňou nešpecifickej väzby.

Imunoblotting

Dôležitou vlastnosťou tejto membrány je možnosť jej opakovaného použitia. Nylonové membrány Zeta-Probe účinne viažu proteíny SDS v neprítomnosti alkoholu a táto väzba je odolná voči následným úpravám. Proteíny s nízkou molekulovou hmotnosťou sú tiež účinne zadržané. S vysokou väzbovou kapacitou približne 480 μg proteínu na cm2 umožňujú membrány Zeta-Probe detekciu stopových množstiev proteínu v testovacích zmesiach.

Akonáhle je antigén imobilizovaný na membráne, zostávajúce väzbové miesta sú blokované roztokmi želatíny, hovädzieho sérového albumínu alebo odstredeného mlieka.

Potom sa membrána inkubuje v roztoku polyklonálnych alebo monoklonálnych protilátok proti študovanému antigénu. Po umytí nenaviazaných protilátok sa membrána inkubuje v roztoku sekundárnych protilátok, ktoré sú konjugátom enzýmov alkalická fosfatáza (AP) alebo chrenová peroxidáza (HRP) s protidruhovými protilátkami (kozie protilátky proti králičím, myším alebo ľudským imunoglobulínom ) alebo proteíny A (proteín Staphylococcus aureus) alebo G (proteín Streptococcus sp.), ktoré majú vysokú afinitu k Fc oblasti imunoglobulínov.

Detekcia vytvorených imunitných komplexov sa uskutočňuje chemicky alebo chemiluminiscenčne. Substráty pre chemická reakcia Pri použití konjugátov alkalickej fosfatázy použite 5-bróm-4-chlór-3-indolylfosfát (BCIP) alebo modré tetrazólium (NBT) a pri použití konjugátov chrenovej peroxidázy použite 4-chlór-1-naftol a peroxid vodíka.

V dôsledku enzymatických reakcií sa na membráne v mieste lokalizácie komplexu antigén-protilátka vytvorí farebný pás alebo škvrna.

Citlivosť tejto metódy je 100 pg proteínu pri použití AP konjugátov a 100-500 pg pri použití HRP konjugátov. Chemiluminiscenčná detekcia imunitných komplexov umožňuje detekciu menej ako 5 pg antigénu. Princíp tejto metódy spočíva v tom, že pri reakcii HRP s peroxidom vodíka a cyklickým diacylhydrazínluminolom sa vyžaruje svetlo s vlnovou dĺžkou 428 nm, ktoré je možné zaznamenať na fotocitlivý film.

Reakcia imunoblotovania (IB) bola vyvinutá na základe ELISA. Je to najšpecifickejšia a najcitlivejšia metóda imunochemickej analýzy. Imunoblotting (z anglického blot - blot, stain) kombinuje ELISA s elektroforézou. Používa sa na detekciu nie komplexných protilátok proti HIV, ale protilátok proti jeho jednotlivým štruktúrnym proteínom (proteíny p24, glykoproteíny gp120, gp 41 a pod.). Vzťahuje sa na odborné (potvrdzujúce) reakcie na diagnostiku infekcie HIV.

Reakcia sa uskutočňuje v niekoľkých fázach:

Vírus sa deštruuje na zložky - antigény (p24, gp120, gp 41 atď.), ktoré sa podrobia elektroforéze v polyakrylamidovom géli, to znamená separácii antigénov do frakcií podľa molekulovej hmotnosti.

2. Gél sa prekryje nitrocelulózovou membránou a pomocou elektroforézy sa naň prenesú antigénové frakcie. Nitrocelulóza sa správa ako pijavý papier. Membrána je narezaná na pásy. Spoločnosti vyrábajú takéto prúžky s „škvrnami“ antigénov.

Imunoblotting - dodatočná nepriama metóda

Prúžky potiahnuté antigénmi HIV sa ponoria do séra subjektu a potom sa premyjú, aby sa odstránil nenaviazaný materiál.

4. Prúžky sa inkubujú s antiglobulínovým sérom označeným peroxidázou a premyjú sa.

Pridá sa substrát a zaznamená sa počet farebných frakcií (škvŕn), ktoré zodpovedajú lokalizačnej zóne komplexu AG-AT.

Prítomnosť prúžkov v určitých oblastiach prúžku potvrdzuje prítomnosť protilátok proti presne definovaným antigénom HIV v testovanom sére. Výsledok imunoblottingu sa považuje za pozitívny, ak sú na membráne viditeľné pásy zodpovedajúce ktorýmkoľvek dvom z troch HIV antigénov - p24, gp41 a gp 120 (obr. 37).

VÝKRESY

ZOZNAM POUŽITÝCH REFERENCIÍ

Hlavná literatúra

Lekárska mikrobiológia, virológia a imunológia: učebnica pre študentov medicíny. univerzity 2. vyd., rev. a dodatočné — 702 s. Ed. A.A. Vorobyová. M.: MIA, 2012.

2. Mikrobiológia, virológia a imunológia: príručka pre laboratórne hodiny: učebnica/(V.B. Sboychakov a ďalší); upravil V.B. Sboychakova, M.M. Karapats. – M.: GEOTAR-Media, 2014.- 320 s.: ill.

3. Lekárska mikrobiológia, imunológia a virológia [Elektronický zdroj]: učebnica pre med.

univerzity - 760 s. — Režim prístupu: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN9785299004250.html Korotyaev A.I., Babichev S.A. Petrohrad: Spetslit, 2010.

4. Lekárska mikrobiológia, virológia a imunológia [Elektronický zdroj]: učebnica: v 2 zväzkoch / zväzok 1. - 448 s. — Režim prístupu: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142241.html Zverev V.V., Boychenko M.N.

M.: Geotar Media, 2010. .

5. Lekárska mikrobiológia, virológia a imunológia [Elektronický zdroj]: učebnica: v 2 zväzkoch T. 2. - 480 s. Režim prístupu: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142242.html Zverev V.V., Boychenko M.N. M.: Geotar Media, 2010.

doplnková literatúra

1. Imunodiagnostické reakcie: tutoriál/ zostavili: G.K.Davletshina, Z.G.Gabidullin, A.A.Akhtarieva, M.M.Tuigunov, A.K.Bulgakov, T.A.Savchenko, R.F.

Khusnarizanova, Yu.Z. Gabidullin, M.M. Alsynbaev - Ufa: Vydavateľstvo Štátnej rozpočtovej vzdelávacej inštitúcie vyššieho odborného vzdelávania BSMU Ministerstva zdravotníctva Ruska, 2016. - 86 s.

2. Vlastnosti niektorých vlastností, ktoré určujú patogénny potenciál kokultivovaných variácií baktérií Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E.coli, Proteus: vedecká publikácia / Yu. Z. Gabidullin, R. S. Sufiyarov, I. I. Dolgushin - Ufa, 2015. - 250 s.

Úvod » Immunoblot – čo to je? Imunoblot v diagnostike infekčných chorôb

Imunoblot - čo to je? Imunoblot v diagnostike infekčných chorôb

Čo je imunoblot? Toto je bežná metóda laboratórnej diagnostiky ľudských vírusových infekcií. Je to jeden z najpresnejších a najspoľahlivejších spôsobov, ako zistiť prítomnosť HIV.

Kvôli spoľahlivosti je dokonca väčšia ako enzýmová imunoanalýza (elisa). Výsledky imunoblotu sa považujú za presvedčivé a presvedčivé Všeobecné informácie

Imunoblot - čo to je? Ak chcete rozpoznať osobu s HIV, musíte prejsť laboratórna metóda krvné sérové testy na prítomnosť protilátok.

Sekcie Western blot sa tiež nazývajú Western bloty. Používa sa na detekciu ľudských vírusových infekcií ako doplnková expertná metóda. To je potrebné na potvrdenie ELISA - laboratórneho testu, ktorý umožňuje určiť prítomnosť protilátok proti HIV v krvi. Imunoblot znova skontrolujte pozitívny test ELISA.

Považuje sa za najcitlivejšie, komplexné a drahé.

Cieľ

Čo je imunoblot? Táto technika laboratórny výskum krvné sérum na prítomnosť protilátok proti vírusu.

Počas špeciálny výskum celkové vírusové proteíny v géli a na nitrocelulózovej membráne.

Imunoblotting (detekcia protilátok v sére pacienta proti určitým antigénom patogénov)

Postup sekcie Western blot je určený na určenie infekcie HIV v rôznych štádiách. V prvej fáze sa purifikovaný vírus z jeho zložiek podrobí elektroforéze a antigény v ňom obsiahnuté sa rozdelia podľa molekulovej hmotnosti.

Vírus ľudskej imunodeficiencie sa rozmnožuje v živých bunkách uložených v jeho genetickej informácii. V tomto štádiu sa človek stáva nosičom vírusu HIV, ak ste boli infikovaní.

Špecifikom tejto choroby je, že sa dlho neprejavuje. Vírus ničí lymfocyty, čím sa znižuje imunita človeka a telo sa stáva neschopným bojovať s infekciami.

Ak sa HIV lieči správne a rýchlo, pacient sa dožije vysokého veku. Nedostatok liečby nevyhnutne vedie k smrti. Od okamihu infekcie, ale bez liečby, maximálne obdobie nie je dlhšie ako desať rokov.

Zvláštnosti

Imunoblotová analýza je spoľahlivá metóda, ktorá vám umožňuje určiť prítomnosť protilátok proti HIV antigénom prvého a druhého typu.

Ak je osoba infikovaná, po dvoch týždňoch môžu byť protilátky detegované oveľa neskôr. Zvláštnosťou HIV je, že množstvo protilátok sa rýchlo zvyšuje a zostáva v krvi pacienta. Aj keď sú prítomné, ochorenie sa nemusí prejaviť skôr ako dva a viac rokov. Metóda ELISA nie vždy presne indikuje prítomnosť ochorenia a vyžaduje potvrdenie výsledkov z PCR a Western blot rezov, ak enzýmový imunotest ukázal pozitívny výsledok.

Indikácie pre

Aký druh „imunoblotu“ už bol zistený, ale ktorý sa v štúdii zavádza?

Dôvodom testovania na vírus ľudskej imunodeficiencie (HIV) je imunoblot. pozitívny výsledok ELISA. U pacientov, ktorí sa chystajú podstúpiť operáciu, je potrebné prejsť enzýmovou imunoanalýzou. Okrem toho by ste mali urobiť analýzu žien plánujúcich tehotenstvo, ako aj tých, ktoré sú promiskuitné. Rezy Western blot sa predpisujú pacientom s infekciou HIV, ak sú výsledky Elisy nejednoznačné.

Nasledujúce alarmujúce príznaky môžu byť dôvodom na kontaktovanie lekára: rýchla strata hmotnosti; slabosť, strata funkcie; črevné poruchy (hnačka), ktorá trvá tri týždne; dehydratácia; horúčka; zväčšené lymfatické uzliny v tele; rozvoj kandidózy, tuberkulóza , zápal pľúc, toxoplazmóza, exacerbácia herpesu.

Pacient sa pred darovaním venóznej krvi nemusí pripravovať.

8-10 hodín pred testom nejedzte. Deň pred darovaním krvi sa neodporúča piť alkohol ani ťažké kávové nápoje. fyzické cvičenie, cítiť vzrušenie.

Kde urobiť analýzu?

Kde sa môžem otestovať na HIV?

ELISA, imunoblotová analýza, vykonaná na mestských súkromných klinikách, poskytuje výsledky do jedného dňa. Je možná aj urgentná diagnóza. Vo verejných inštitúciách sú lekárske testy Elisa a Western blot v súlade s legislatívou Ruskej federácie bezplatné.

Povinný skríning infekčných chorôb u tehotných žien a pacientov vyžadujúcich hospitalizáciu alebo operáciu Ako sa tento test vykonáva?

Ako vykonať ELISA? Imunoblot pozitívny/negatívny potvrdzuje alebo vyvracia výsledky testu elisa. Postup je celkom jednoduchý. Špecialista odoberie venóznu krv, čo trvá menej ako päť minút.

Po odbere vzoriek treba miesto vpichu dezinfikovať a prekryť obväzom. Odber vzoriek sa vykonáva nalačno, takže po zákroku nezaškodí zjesť tabuľku horkej čokolády alebo sladký horúci nápoj.

Ak chcete získať odporúčanie na bezplatný test vo verejnej zdravotníckej inštitúcii, musíte navštíviť terapeuta.

Vo všeobecnosti sa imunoblot nelíši od iných krvných testov odberom. Metodológia výskumu je jednoduchá. Ak je vírus prítomný v krvi človeka, telo začne produkovať protilátky na jeho zničenie. Pre každý vírus existuje veľa proteínových antigénov. Detekcia týchto protilátok je základom metódy Western blot section. cena

Ako dlho trvá analýza? HIV imunoblot je jedným z najlacnejších testov.

V priemere sa skríningové metódy imunotestov pohybujú od 500 do 900 rubľov. Sekcie Western blot sú štúdiom testov, ktorých náklady sa pohybujú od troch do piatich tisíc rubľov. Zložitejšie metódy sú oveľa drahšie. Napríklad na analýzu polymerázy reťazová reakcia(PCR) budete musieť zaplatiť asi 12 000 rubľov.

Interpretácia výsledkov

Najbežnejšími metódami diagnostiky infekcie HIV sú enzýmová imunoanalýza a imunoblot.

Používajú sa na stanovenie protilátok proti vírusu ľudskej imunodeficiencie v sére. Infekcia je zvyčajne potvrdená dvoma testami: skríningovým a potvrdzujúcim. Výsledky musí interpretovať lekár, ktorý diagnostikuje a predpíše liečbu. Ak je imunoblot pozitívny, znamená to, že v ľudskom tele je vírus.

Pozitívny výsledok by nemal byť dôvodom na nezávislú liečbu, pretože každý pacient môže mať svoj vlastný obraz choroby.

Kvalitatívna analýza zahŕňa skríning a certifikáciu. Ak sa vírus u pacienta nezistí, výsledok je „negatívny“. Keď sa tento certifikát zistí, vykonajú sa dodatočné skríningové štúdie. Imunoblotová analýza, ktorá potvrdí alebo vyvráti skríning. Ak sa testovacie prúžky objavia v určitých tmavých oblastiach (lokalizácia proteínov), vykoná sa diagnóza HIV.

Ak sú výsledky pochybné, testy sa vykonajú do troch mesiacov.

Aby sa zabránilo infekcii vírusom ľudskej imunodeficiencie, je to možné, ak budete dodržiavať určité pravidlá: vyhýbajte sa náhodnému sexuálnemu kontaktu, počas kontaktu používajte kondómy, nepoužívajte drogy.

Ak sa ochorenie zistí u tehotnej ženy, je dôležité dodržiavať odporúčania ošetrujúceho lekára a nezabudnúť na test na prítomnosť vírusu.

Čo je Western blotting?

Identifikácia proteínov v komplexných zmesiach alebo extraktoch rôznych tkanív je jedným z často sa vyskytujúcich problémov. Pomocou nástroja, akým sú špecifické protilátky, je možné určiť skúmaný proteín s minimálnymi časovými a finančnými nákladmi.

Pri metóde Western blotting sa v prvom stupni zmes proteínov oddelí elektroforézou v prítomnosti dodecylsulfátu sodného (SDS), potom sa prenesie na nitrocelulózovú membránu elektroblotovaním.

Podstatou tejto metódy je, že po elektroforéze sa gél umiestni na nitrocelulózovú membránu medzi vrstvy filtračného papiera. Takto zostavený „sendvič“ sa umiestni do elektrického poľa, takže komplexy proteín-SDS sa pohybujú cez gélovú platňu a sú imobilizované (v dôsledku nešpecifickej sorpcie) na povrchu nitrocelulózovej membrány.

Väzbové sily komplexu proteín-SDS k nitrocelulózovej membráne sú hlavne elektrický charakter a táto interakcia je viacbodová a vedie k „šíreniu“ proteínov na povrchu membrány. Po elektrotransfere tak získame repliku gélu na nitrocelulóze s proteínmi umiestnenými rovnako ako v polyakrylamidovom géli.

Po SDS elektroforéze, elektrotransfere a sorpcii proteínov z gélu na nitrocelulózovú membránu sa terciárna konformácia proteínu výrazne zmení, ak je vo všeobecnosti správne hovoriť o existencii terciárnej štruktúry proteínu po takomto tvrdom zaobchádzaní. Preto sa na imunochemickú detekciu študovaného proteínu zvyčajne používajú iba mono- alebo polyklonálne protilátky špecifické pre lineárne oblasti molekuly proteínu.

51. Enzýmová imunoanalýza, imunoblotovanie. Mechanizmus, komponenty, aplikácia.

Protilátky špecifické pre konformačné epitopy (alebo oblasti zahŕňajúce medzipodjednotkové kontakty) nie sú všeobecne vhodné na použitie pri Western blottingu.

Po prenose proteínu sa membrána postupne inkubuje s protilátkami špecifickými pre študovaný proteín a potom so sekundárnymi protilátkami špecifickými pre Fc fragmenty primárnych protilátok, konjugované s enzýmovou (alebo inou) značkou (obr.

1A). V prípade, že primárne protilátky špecifické pre študovaný antigén sú priamo konjugované so značkou, sekundárne protilátky nie sú potrebné (obr. 1 B). Imunitné komplexy vytvorené v mieste lokalizácie skúmaného proteínu sa „prejavujú“ pomocou chromogénneho substrátu (v závislosti od typu značky).

Citlivosť a špecifickosť metódy značne závisí od toho, aké protilátky sa pri výskume používajú.

Použité protilátky musia byť špecifické pre jedinečnú aminokyselinovú sekvenciu charakteristickú len pre študovaný proteín. V opačnom prípade je možná interakcia (najmä v prípade surových proteínových extraktov) protilátok s niekoľkými proteínovými molekulami, čo následne povedie k objaveniu sa niekoľkých farebných pásov na membráne.

Identifikácia skúmaného proteínu je v tomto prípade často ťažká alebo dokonca nemožná.

Druhým dôležitým faktorom, ktorý treba mať na pamäti pri výbere protilátok, je afinita. Čím vyššia je afinita použitých protilátok, tým jasnejšie a jasnejšie sú zafarbené proteínové pásy, tým vyššia je citlivosť metódy. Pri použití vysokoafinitných protilátok možno dosiahnuť citlivosť 1 ng alebo aj vyššiu.

Na vizualizáciu výsledku interakcie medzi membránovo viazaným antigénom a protilátkami sa používajú sekundárne protilátky, konjugované s činidlami schopnými produkovať určitý signál za určitých podmienok.

Typicky sa ako také činidlo používa enzým (peroxidáza alebo fosfatáza), ktorého reakčný produkt je zafarbený a vyzráža sa na membráne vo forme nerozpustnej zrazeniny.

aj v túto metódu je možné použiť fluorescenčné značky.

Ryža. 1. Schéma imunochemického farbenia študovaného proteínu: A - použitie sekundárnych protilátok konjugovaných s enzýmovou značkou; B - primárna protilátka je priamo konjugovaná s enzýmovou značkou.

Protokol:

I. Príprava gélu a membrány a elektrotransfer proteínov

Po elektroforéze sa polyakrylamidový gél umiestni do kúpeľa s blotovacím pufrom (25 mM Tris, pH 8,3, 192 mM glycín, 10 % etanol).

Dva listy filtračného papiera, narezané do tvaru sacej kazety a navlhčené savým pufrom, sa umiestnia na časť kazety, ktorá bude obrátená k anóde. Potom sa na filtračný papier umiestni nitrocelulózová membrána vopred navlhčená rovnakým pufrom, aby sa zabezpečilo, že medzi membránou a papierom nie sú žiadne vzduchové bubliny.

Potom by sa mal gél opatrne umiestniť na membránu a znova sa otočiť Osobitná pozornosť pre absenciu vzduchových bublín medzi gélom a membránou. Formovanie sendviča je ukončené dvoma vrstvami navlhčeného filtračného papiera, ktoré sú umiestnené na povrchu gélu (obr. 2). Výsledný sendvič je upnutý v kazete a umiestnený medzi elektródy tak, aby membrána smerovala k anóde.

Ryža. 2. Schéma elektroprenosu proteínov na membránu.

II. Elektrický prenos

Elektrotransfer proteínov na nitrocelulózovú membránu sa uskutočňuje v pufri obsahujúcom 25 mM Tris, pH 8,3, 192 mM glycín, 10 % etanol počas 30-50 minút pri konštantnom napätí 100 V.

Čas elektrotransferu závisí od veľkosti prenášaných proteínov, čím väčší je proteín, tým dlhšie trvá elektrotransfer. Kvalita elektrotransferu a umiestnenie proteínových pásov sa hodnotí farbením nitrocelulózovej membrány 0,3 % roztokom Ponceau S v 1 % octová kyselina. Pred imunochemickým farbením je potrebné membránu niekoľkokrát premyť slabo alkalickým roztokom vodný roztok Tris na odstránenie farbiva naviazaného na bielkoviny.

III. Imunochemické farbenie proteínov imobilizovaných na nitrocelulózovej membráne

Na blokovanie miest nešpecifickej väzby protilátky sa membrána inkubuje za stáleho miešania pri teplote miestnosti počas 30 minút v PBST (napr. lepšie blokovanie možno použiť roztok PBST obsahujúci 10 % sušeného odstredeného mlieka).

Po zablokovaní sa membrána inkubuje hodinu pri teplote miestnosti za stáleho miešania v PBST obsahujúcom 1-10 ug/ml špecifických protilátok.

Optimálna koncentrácia protilátok sa vyberie empiricky a závisí od afinity interakcie protilátok s antigénom.

Na konci inkubácie membránu 5-krát premyte PBST a preneste ju do roztoku sekundárnych protilátok konjugovaných s chrenovou peroxidázou. Riedenie konjugátu je zvyčajne uvedené výrobcom na obale alebo je empiricky vybrané výskumníkom. Membránu inkubujte v roztoku sekundárnej protilátky 1 hodinu za stáleho miešania.

Po dôkladnom premytí (zmena pufor aspoň 5-6 krát) sa membrána PBST prenesie do roztoku chromogénneho substrátu obsahujúceho 3 mg diaminobenzidínu (DAB) a 10 μl 30% peroxidu vodíka v 10 ml 0,1 M Tris-HCl. pH 7,6.

Inkubácia sa uskutočňuje za miešania počas 5 až 10 minút. Po dokončení inkubácie so substrátom by sa membrána mala premyť PBST, vysušiť saním filtračným papierom a ihneď elektronická kópia, farebné skenovanie. Ak membrána úplne vyschne, maľované proteínové pruhy vyblednú a obraz sa ukáže ako menej jasný a kontrastný.

Poznámka: DAB je toxický a potenciálny karcinogén. Pracujte len s gumenými rukavicami!