INN: Interferón alfa 2b
Výrobca: Sikor Biotech JSC
Anatomicko-terapeuticko-chemická klasifikácia: Interferón alfa-2b
Registračné číslo v RK: Č. RK-BP-5 č. 012842
Obdobie registrácie: 18.06.2014 - 18.06.2019
KNF (lieky sú zahrnuté v Kazašskom národnom vzorci liekov)
ALO (zahrnutý v zozname poskytovania bezplatných ambulantných liekov)
JEDNOTKA (Zahrnutá v zozname liekov pod garantovaným objemom lekárskej starostlivosti zakúpenej od jedného distribútora)
Maximálna nákupná cena v Kazašskej republike: 33 116,64 KZT
Inštrukcie
Obchodné meno
Realdiron
Medzinárodný nechránený názov
Interferón alfa
Dávková forma
Lyofilizovaný prášok na prípravu injekčného roztoku, 1 000 000 IU, 3 000 000 IU, 6 000 000 IU, 9 000 000 IU a 18 000 000 IU.
Štruktúra
Jedna fľaša obsahuje
účinná látka : interferón alfa-2b ľudská rekombi-
1 milión IU, 3 milióny IU, 6 miliónov IU, 18 miliónov IU
pomocné látky: dextrán 60, chlorid sodný, dodekahydrát hydrogénfosforečnanu sodného, \u200b\u200bdihydrát dihydrogenfosforečnanu sodného
Popis
Biely prášok alebo pórovitá hmota
Farmakoterapeutická skupina
Imunomodulátory. Interferóny. Interferón alfa
ATX kód L03AB05
Farmakologické vlastnosti
Farmakokinetika
Čas nástupu maximálnej koncentrácie interferónu-alfa 2b po intramuskulárnom podaní je 2 hodiny a trvá až 12 hodín, po subkutánnom podaní - 7,3 hodiny, po 20 hodinách sa liek nezistí.
T1 / 2 (polčas) s intramuskulárnou injekciou je asi 2 - 3 hodiny. Biologická dostupnosť je 80%.
Liek je rovnomerne distribuovaný do orgánov a tkanív. Biotransformuje sa v obličkách a v malej miere v pečeni. Čiastočne sa vylučuje nezmenený, hlavne obličkami.
Farmakodynamika
Interferón alfa-2b je vysoko purifikovaný proteín získaný pomocou rekombinantnej DNA. Polypeptidová štruktúra molekuly, biologická aktivita a farmakologické vlastnosti sú identické s ľudskými leukocytovými interferónmi alfa-2b. Má antivírusové, antiproliferatívne, protinádorové a imunomodulačné účinky.
Liek interakciou s príbuznými receptormi na povrchu bunky iniciuje komplexný reťazec zmien v bunke. Predpokladá sa, že tieto procesy súvisia s prevenciou vírusovej replikácie v bunke, inhibíciou bunkovej proliferácie a imunomodulačným účinkom interferónu. Interferón alfa-2b má schopnosť stimulovať fagocytárnu aktivitu makrofágov, ako aj cytotoxickú aktivitu T buniek a NK (Natural Killers). Tieto vlastnosti interferónu sú zodpovedné za terapeutický účinok lieku.
Indikácie pre použitie
Ako súčasť kombinovanej liečby u dospelých. Vírusové choroby
- chronická aktívna hepatitída B, ak ju nemožno použiť
pegylované interferóny
- chronická hepatitída C, ak ju nemožno použiť
pegylované interferóny
Onkologické ochorenia - vlasatobunková leukémia - chronická myeloidná leukémia - rakovina obličiek - malígny melanóm.
Spôsob podávania a dávkovanie
Roztok Realdironu sa podáva intramuskulárne alebo subkutánne. Pred použitím sa obsah fľaše rozpustí v 1 ml vody na injekciu. Roztok lieku by mal byť transparentný, bez cudzích inklúzií. Pri chronickej aktívnej hepatitíde B sa Realdiron podáva v dávke 3 milióny IU trikrát týždenne počas 6 mesiacov. Ak po liečbe nebude do 3 mesiacov pozorované klinické, biochemické zlepšenie a / alebo vymiznutie HBsAg, liek sa vysadí.
Pri chronickej hepatitíde C sa Realdiron predpisuje 3 milióny IU trikrát týždenne počas 6 mesiacov. Ak po podaní lieku do jedného mesiaca po liečbe nedôjde k 50% zníženiu aktivity ALT v krvnej plazme, dávka lieku sa zvýši na 6 miliónov IU trikrát týždenne. Ak po 3 mesiacoch liečby nedôjde k žiadnemu klinickému, biochemickému zlepšeniu, je potrebné liek zrušiť.
Pri vlasatobunkovej leukémii sa podávajú 3 milióny IU denne počas 2 mesiacov; po dosiahnutí hematologickej remisie - 3 milióny IU 3-krát týždenne.
Pri chronickej myeloidnej leukémii sa podáva úvodná dávka 3 milióny IU denne intramuskulárne alebo subkutánne. Pri dobrej znášanlivosti sa dávka lieku zvyšuje každý týždeň na maximálnu dávku 9 miliónov IU denne. Po stabilizácii počtu bielych krviniek sa táto dávka môže podávať trikrát týždenne. Priebeh liečby sa vykonáva neurčito, s výnimkou prípadov, keď je potrebné liečbu prerušiť (napríklad pri rýchlom progresii ochorenia alebo intolerancii lieku).
Pri rakovine obličiek sa Realdiron užíva v množstve 3 milióny IU denne počas 10 dní. Pri dobrej znášanlivosti sa dávka lieku zvyšuje každý týždeň na maximálnu dávku 18 miliónov IU denne. Po 3 mesiacoch liečby sa začne s podpornou liečbou 18 miliónmi IU trikrát týždenne počas 6 mesiacov.
Pri malígnom melanóme sa podáva intramuskulárne alebo subkutánne úvodná dávka 3 milióny IU denne. Pri dobrej znášanlivosti sa dávka lieku zvyšuje každý týždeň na maximálnu dávku 9-18 miliónov IU denne. Po dosiahnutí klinického účinku prechádzajú na udržiavaciu liečbu v dávke 9-18 miliónov IU trikrát týždenne. Adjuvantná liečba liekom Realdiron po chirurgickom odstránení malígneho melanómu štádia I-II môže predĺžiť čas do relapsu.
Vedľajšie účinky
často
Horúčka, únava, malátnosť, bolesti hlavy, myalgia, zimnica, tras, príznaky podobné chrípke
Anorexia, nevoľnosť
menej často
Zmena chuti, stomatitída, sucho v ústach, poškodenie povrchu zubov a ústnej sliznice, zvracanie, hnačka, zápcha, riedka stolica, bolesti brucha
Alopécia, svrbenie, suchá pokožka, vyrážky
Bolesť chrbta, muskuloskeletálna bolesť, bolesť na hrudníku, myozitída, artralgia
Depresia, samovražedné myšlienky a činy, samovražda
Nadmerné potenie, najmä v noci
Podráždenosť, nespavosť, ospalosť, úzkosť, znížená koncentrácia, emočná labilita, závraty
Arteriálna hypotenzia, hypertenzia
zriedka
Zápal, začervenanie, podráždenie v mieste vpichu
Vzrušenie, nervozita, psychózy vrátane halucinácií, agresívne správanie, vzrušenie, porucha vedomia, neuropatia, polyneuropatia, periférna neuropatia, parestézia, hypostézia, kŕče, strata vedomia
Vírusová infekcia vrátane herpes simplex
Erytém
Konjunktivitída, bolesť očí, rozmazané videnie, krvácanie do sietnice, retinopatie, ložiskové zmeny sietnice, upchatie tepny alebo sietnicovej žily, znížená ostrosť zraku alebo obmedzené zorné polia, neuritida optiky, edém optických diskov
Dysfunkcia slznej žľazy
Epistaxa, upchatý nos, sínusitída, rinitída
Migréna
Kašeľ, faryngitída, pľúcne infiltráty, zápal pľúc, dyspnoe, poruchy dýchania
Strata váhy
Tachykardia, palpitácie
Znížené libido, menštruačné nepravidelnosti (amenorea, menorágia)
Zvýšená chuť do jedla, glositída, krvácanie z ďasien
Rabdomyolýza (niekedy závažná)
Poškodenie alebo strata sluchu
Edém tváre, porucha funkcie obličiek, nefrotický syndróm, obličky
zlyhanie, hyperurikémia
Hyper- a hypotyreóza, hepatotoxicita (vrátane úmrtí)
Leukopénia
Poruchy zubov a parodontu (vrátane tých, ktoré vedú k strate zubov)
veľmi zriedka
Zvýšená chuť do jedla, diabetes mellitus, hyperglykémia, hypertriglyceridémia, kolitída, hepatomegália, pankreatitída
Cerebrovaskulárna ischémia, cerebrovaskulárne krvácania
Sarkoidóza alebo exacerbácia sarkoidózy
Alergické reakcie, multiformný erytém, Stevensov-Johnsonov syndróm, toxická epidermálna nekrolýza
Trombocytopénia, lymfocytopénia, aplastická anémia
Lymfadenopatia
Ospalosť
Nekróza v mieste vpichu
Autoimunitné a imunitne sprostredkované poruchy, vč. idiopatická trombocytopenická purpura, reumatoidná artritída, systémový lupus erythematosus, vaskulitída a Vogtov-Kayanagi-Haradov syndróm
Hluk v ušiach
Infarkt myokardu, arytmia (zvyčajne u pacientov s anamnézou kardiovaskulárnych ochorení alebo s predchádzajúcou liečbou kardiotoxickými liekmi), reverzibilná prechodná kardiomyopatia (zaznamenané u pacientov bez anamnézy kardiovaskulárneho systému)
Zápal pľúc
veľmi zriedka (pri monoterapii alebo v kombinácii s ribavirínom)
Úplná aplázia červenej kostnej drene
Zmeny laboratórnych parametrov (častejšie sa zaznamenávajú pri predpisovaní
viac ako 10 miliónov IU za deň): pokles počtu granulocytov,
zníženie hladiny hemoglobínu, zvýšenie aktivity ALT, AST (pozorované pri všetkých indikáciách, s výnimkou chronickej vírusovej hepatitídy), alkalickej fosfatázy, LDH, hladiny kreatinínu a dusíka v sére
U detí vrátane kombinovanej liečby s ribavirínom (≥ 1% pacientov dostávajúcich kombinovanú liečbu s ribavirínom)
Často
Anémia, neutropénia
Hypotyreóza
Depresia, emočná labilita, nespavosť, podráždenosť, bolesti hlavy, závraty
Anorexia, nevoľnosť, zvracanie, bolesti brucha, hnačky
Alopécia, vyrážka
Artralgia, myalgia
Zápalové reakcie v mieste vpichu: bolesť, hyperémia
Slabosť, horúčka, zimnica, príznaky podobné chrípke, malátnosť, vírusová infekcia, faryngitída
Oneskorený fyzický vývoj (oneskorený rast a / alebo telesná hmotnosť v porovnaní s vekom)
často
Bledosť
Krvácanie z nosa
Bakteriálna infekcia, zápal pľúc, plesňové infekcie, herpes simplex
Novotvary nezaradené
Trombocytopénia, lymfadenopatia
Hypertyreóza, virilizmus
Hypertriglyceridémia, hyperurikémia
Agitácia, tremor, ospalosť, agresívna reakcia, úzkosť, apatia, nervozita, porucha správania, somnambulizmus, samovražedné myšlienky, zmätenosť, abnormálne sny, poruchy spánku, hyperkinéza, dysfónia, parestézia, hyperestézia, hypostézia, znížená koncentrácia pozornosti
Konjunktivitída, bolesť očí, rozmazané videnie, dysfunkcia slznej žľazy
Raynaudova choroba
Kašeľ, dyspnoe, zápal stredného ucha, upchatie nosa, podráždenie nosovej sliznice, výtok z nosa, kýchanie, tachypnoe
Poruchy gastrointestinálneho traktu, zvýšená chuť do jedla, zápcha, riedka stolica, poruchy konečníka, dyspepsia, gastroezofageálny reflux, gastroenteritída, glositída, stomatitída vč. ulceratívny, bolesť zubov, dysfunkcia pečene
Bolesť v hrudníku, v pravom hornom kvadrante brucha
Akné, ekzémy, zmeny nechtov, suchá pokožka, praskliny na koži, fotocitlivé reakcie, makulopapulárna vyrážka, zmeny pigmentácie kože, erytém, potenie, hematóm, svrbenie
Infekcie močových ciest, poruchy močenia, enuréza
Menštruačné nepravidelnosti, amenorea, menorágia, vaginálne poruchy, vaginitída, bolesť v semenníckej oblasti (u chlapcov)
Kontraindikácie
Precitlivenosť na liečivo alebo na ktorúkoľvek z pomocných látok
Závažné srdcové choroby vrátane anamnézy (nekontrolované poruchy srdca, nedávny infarkt myokardu, závažné poruchy srdcového rytmu)
Závažné ochorenie obličiek alebo pečene, vrátane nádorových metastáz, zlyhanie obličiek s klírensom kreatinínu pod 50 ml / min, ak sa podáva v kombinácii s ribavirínom.
Dekompenzovaná cirhóza pečene
Chronická hepatitída s ťažkou cirhózou alebo zlyhaním pečene
Chronická hepatitída liečená v minulosti imunosupresívami alebo glukokortikosteroidmi
Autoimunitné choroby, vč. prítomná alebo v anamnéze autoimunitná hepatitída
Poruchy štítnej žľazy nie sú kontrolované štandardnou liečbou
Predbežná psychická alebo anamnéza u detí a dospievajúcich
Deti do 3 rokov s chronickou hepatitídou C.
Gravidita a laktácia, ak sa podáva v kombinácii s ribavirínom
Ak sa podáva v kombinácii s ribavirínom, mali by sa vziať do úvahy aj kontraindikácie uvedené v návode na použitie ribavirínu.
Liekové interakcie
Interferón alfa inhibuje pečeňové mikrozomálne enzýmy (cytochróm P-450), preto môže narušiť metabolizmus mnohých liekov (teofylín atď.) A zvýšiť ich koncentráciu v krvi.
Z dôvodu rizika nežiaducich reakcií z centrálneho nervového systému sa majú narkotiká, hypnotiká a sedatíva používať spolu s interferónom alfa veľmi opatrne.
Liekové interakcie medzi Realdironom a inými liekmi neboli úplne študované. Realdiron sa má používať opatrne v kombinácii s liekmi, ktoré majú potenciálne myelosupresívny účinok.
Pri súčasnom použití Realdironu a zidovudínu je možné pozorovať synergický účinok na zníženie počtu leukocytov. U pacientov liečených takouto terapiou sa vyskytli častejšie prípady neutropénie závislé od dávky, ako sa očakávalo pri monoterapii zidovudínom. Pacienti, ktorí dostávajú Realdiron v rámci kombinovanej liečby s ribavirínom alebo zidovudínom, majú zvýšené riziko anémie.
Účinky použitia Realdironu v kombinácii s antiretrovírusovými liekmi nie sú známe.
Interferóny môžu ovplyvňovať oxidačné metabolické procesy. Toto je potrebné vziať do úvahy pri súčasnom užívaní s liekmi metabolizovanými oxidáciou (vrátane derivátov xantínu - aminofylínu a teofylínu). Pri súčasnom použití Realdironu s teofylínom je potrebné kontrolovať jeho koncentráciu v krvnom sére a v prípade potreby upraviť dávkovací režim.
Farmaceutické interakcie
Realdiron sa nemá miešať s inými liečivými látkami okrem 0,9% roztoku chloridu sodného.
špeciálne pokyny
Žltačka typu B
Pred začatím liečby pacientov s hepatitídou B sa odporúča vykonať biopsiu pečene na potvrdenie chronickej hepatitídy a na stanovenie rozsahu lézie, ako aj na zabezpečenie, aby v súčasnosti alebo v anamnéze nedošlo k encefalopatii, krvácaniu z pažerákových varixov, ascitu alebo iným klinickým príznakom dekompenzácie.
Pred začatím liečby Realdironom je potrebné zamerať sa na nasledujúce ukazovatele:
norma bilirubínu
protrombínový čas dospelí - predĺženie najviac o 3 sekundy
deti - predĺženie nie dlhšie ako 2 sekundy
leukocyty ≥ 4 000 / mm3
krvné doštičky dospelí ≥ 100 000 / mm3
deti ≥ 150 000 / mm3
Hepatitída C.
Optimálnym spôsobom liečby je kombinovaná liečba s ribavirínom. Monoterapia liekom Realdiron sa vykonáva hlavne v prípade intolerancie alebo pri kontraindikáciách pri používaní ribavirínu.
Ak používate Realdiron ako súčasť kombinovanej liečby s ribavirínom pri chronickej hepatitíde C, prečítajte si tiež pokyny na lekárske použitie ribavirínu.
U všetkých pacientov s chronickou hepatitídou C sa odporúča vykonať biopsiu pečene. V určitých prípadoch (napríklad u pacientov s vírusovými genotypmi 2 a 3) je však liečba možná bez histologického potvrdenia.
Dospelých. Pred začatím liečby Realdironom je potrebné sa ubezpečiť, že v súčasnosti alebo v anamnéze nie je encefalopatia, krvácanie z varixov pažeráka, ascites alebo iné klinické príznaky dekompenzácie, a to so zameraním na tieto ukazovatele:
bilirubín ≤ 2 mg / dl
stabilný voči albumínu a v normálnych medziach
predĺženie protrombínového času o nie viac ako 3 sekundy u dospelých, o 2 sekundy u detí
leukocyty ≥ 3 000 / mm3
trombocyty ≥ 70 000 / mm3
sérový kreatinín je normálny alebo takmer normálny
Pri použití Realdironu v kombinácii s ribavirínom u pacientov s poškodením funkcie obličiek (klírens kreatinínu\u003e 50 ml / min) je potrebné sledovať kompletný krvný obraz, kreatinín v krvi a moči, berúc do úvahy možnosť anémie. U pacientov starších ako 50 rokov by sa toto sledovanie malo vykonávať raz týždenne.
Monoterapia.
Počas liečby Realdironom je možná dysfunkcia štítnej žľazy - hypotyreóza alebo hypertyreóza. Pred začatím užívania Realdironu je potrebné stanoviť hladinu hormónu stimulujúceho štítnu žľazu (TSH) v krvnom sére a vykonať ultrazvuk štítnej žľazy. Ak sa zistia akékoľvek abnormality, má sa vykonať vhodná terapia.
Žiadosť o súčasnú infekciu HIV a vírusom hepatitídy C.
Pacienti, ktorí sú navyše infikovaní HIV a dostávajú vysoko aktívnu antiretrovírusovú liečbu (HAART), môžu mať zvýšené riziko laktátovej acidózy. Pri pridávaní liečby Realdironom a ribavirínom k \u200b\u200bHAART je potrebná opatrnosť.
U pacientov s cirhózou, ktorí sú navyše infikovaní vírusom HIV a vírusom hepatitídy C a dostávajú HAART, môže byť zvýšené riziko dekompenzácie a smrti pečene.
Dodatočné použitie alfa interferónov samotných alebo v kombinácii s ribavirínom zvyšuje vyššie riziko u tejto kategórie pacientov.
Poruchy zubov a parodontu
Laboratórny výskum
Pred začatím liečby Realdironom a pravidelne počas liečby sa u všetkých pacientov sleduje obraz periférnej krvi (so stanovením leukocytového vzorca a počtu krvných doštičiek), biochemické parametre krvi (stanovenie hladiny elektrolytov, pečeňových enzýmov vrátane ALT, bilirubínu, celkového proteínu a frakcie vrátane albumínu a kreatinínu). Pred a počas liečby Realdironom by hladina krvného obrazu mala byť v normálnych hodnotách.
Počas liečby pacientov s chronickou hepatitídou sa odporúča nasledujúca schéma monitorovania laboratórnych parametrov: 1, 2, 4, 8, 12, 16 týždňov a potom raz mesačne, počas celej liečby. Ak ALT stúpne na hodnotu, ktorá je dvakrát alebo viac ako hodnota pred začiatkom liečby, v liečbe Realdironom je možné pokračovať, s výnimkou prípadov, keď sa objavia príznaky zlyhania pečene. V takom prípade by sa malo stanovenie ALT, protrombínového času, alkalickej fosfatázy, albumínu a bilirubínu vykonať každé 2 týždne.
U pacientov s malígnym melanómom sa má funkcia pečene a počet leukocytov (podľa vzorca) monitorovať týždenne počas indukcie remisie a mesačne počas udržiavacej liečby.
Okamžitá precitlivenosť
Výskyt prechodnej kožnej vyrážky si nevyžaduje prerušenie liečby.
Sprievodné choroby
Realdiron sa predpisuje opatrne pacientom s anamnézou závažných chronických ochorení: chronická obštrukčná choroba pľúc, diabetes mellitus so sklonom k \u200b\u200bketoacidóze. Pri používaní lieku u pacientov s poruchami krvácania je potrebná osobitná opatrnosť
(tromboflebitída, pľúcna embólia) alebo s ťažkou myelosupresiou.
Simultánna chemoterapia
Užívanie Realdironu v kombinácii s inými chemoterapeutickými liekmi (napríklad cytarabín, cyklofosfamid, doxorubicín, tenipozid) zvyšuje riziko toxických účinkov (ich závažnosť a trvanie), ktoré v dôsledku kombinovaného použitia môžu byť život ohrozujúce alebo spôsobiť smrť. Z dôvodu rizika zvýšenej toxicity je potrebné starostlivo zvoliť dávku Realdironu a súčasne podávaných chemoterapeutických liekov.
Autoprotilátky a autoimunitné choroby
Liečba Realdironom môže viesť k vzniku autoprotilátok a k rozvoju autoimunitných chorôb. Pacienti s dedičnou predispozíciou alebo s podozrením na vývoj príznakov autoimunitných ochorení by mali byť neustále sledovaní kvôli včasnej diagnostike. Ak je podozrenie na Vogtov-Koyanagiho-Haradov syndróm u pacientov s chronickou hepatitídou C, je potrebné prerušiť antivírusovú liečbu a prediskutovať potrebu liečby kortikosteroidmi.
Horúčka
Horúčka môže byť prejavom chrípkového syndrómu, ktorý je bežný pri liečbe interferónom, je však potrebné vylúčiť ďalšie príčiny.
Na zníženie telesnej teploty a zníženie bolesti hlavy so syndrómom podobným chrípke, ktorý sa môže vyskytnúť počas liečby Realdironom, sa odporúča použitie antipyretickej liečby.
Žiadosť o poškodenie funkcie pečene
Smrteľné následky toxickej hepatitídy boli zriedkavé. Ak sa na pozadí použitia Realdironu objavia príznaky pečeňovej dysfunkcie, je potrebné pacienta pozorne sledovať a s progresiou príznakov je potrebné liečbu vysadiť.
Pacienti s chronickou hepatitídou B, ktorí majú zníženú syntetickú funkciu pečene (napr. Znížený albumín alebo predĺžený protrombínový čas), ale ktorí spĺňajú kritériá vhodnosti pre začatie liečby, môžu mať zvýšené riziko rozvoja klinickej dekompenzácie, ak sa počas liečby zvýšia hladiny aminotransferáz. Pred liečbou takýchto pacientov je potrebné zistiť výhody použitia Realdironu pred možným rizikom.
Zamietnutie aloštepov
Predbežné dôkazy naznačujú, že liečba interferónom alfa môže zvýšiť riziko odmietnutia transplantátu obličky. Bolo tiež hlásené odmietnutie transplantátu pečene, aj keď príčinná súvislosť s liečbou alfa interferónom nebola stanovená.
Hydratácia
Pri liečbe Realdironom je potrebné zabezpečiť primeranú hydratáciu tela, pretože v niektorých prípadoch bola pozorovaná arteriálna hypotenzia spôsobená dehydratáciou (ktorá si môže vyžadovať ďalšie podanie tekutín).
Kardiovaskulárny systém
Pacienti s anamnézou kardiovaskulárnych ochorení (chronické srdcové zlyhanie, infarkt myokardu a / alebo arytmie) vyžadujú pri predpisovaní Realdironu starostlivý lekársky dohľad. Hlásené izolované prípady kardiomyopatie, niekedy s reverzibilným vývojom po ukončení liečby Realdironom. Pacientom s ochorením srdca v anamnéze sa odporúča vykonať výkon
EKG pred a počas liečby Realdironom. Arytmie, hlavne supraventrikulárne, sa vyskytli zriedkavo a hlavne u pacientov s kardiovaskulárnymi ochoreniami v anamnéze alebo pri predchádzajúcej liečbe kardiotoxickými liekmi. Takéto poruchy rytmu spravidla reagujú na štandardnú liečbu, môžu si však vyžadovať úpravu dávky alebo prerušenie liečby Realdironom.
Dýchací systém
Každý pacient s horúčkou, kašľom, dýchavičnosťou alebo inými respiračnými príznakmi by mal podstúpiť röntgen hrudníka. Ak sa zistia infiltráty alebo dôjde k narušeniu funkcie pľúc, je potrebné pacienta starostlivo sledovať a v prípade potreby prerušiť liečbu Realdironom. Takéto zmeny sa častejšie vyskytovali u pacientov s chronickou hepatitídou C, ktorí dostávali liečbu interferónom alfa, ale boli hlásené prípady ich vývoja u pacientov s rakovinou, ktorí tiež dostávali liečbu interferónom alfa. Včasné zrušenie liečby interferónom alfa a použitie kortikosteroidov vedie k vymiznutiu nežiaducich pľúcnych reakcií. Okrem toho bol častejší výskyt týchto príznakov hlásený pri súčasnom užívaní Shosaikota (čínsky bylinný liek) s alfa interferónom.
Duševné poruchy a centrálny nervový systém (CNS). Počas liečby Realdironom a dokonca aj po jeho ukončení, hlavne do 6 mesiacov, sa u niektorých pacientov pozorovali závažné poruchy centrálneho nervového systému, najmä depresia, samovražedné myšlienky a pokusy o samovraždu. U detí a dospievajúcich užívajúcich Realdiron v kombinácii s ribavirínom boli samovražedné myšlienky a pokusy o samovraždu pozorované častejšie v porovnaní s dospelými pacientmi (2,4% oproti 1%). U dospelých pacientov, detí a dospievajúcich boli pozorované aj iné duševné poruchy, napríklad depresia, emočná labilita a ospalosť. Keď sa tieto príznaky objavia, je potrebné vziať do úvahy potenciálnu závažnosť týchto nežiaducich udalostí. Ak príznaky pretrvávajú alebo sa zhoršujú, alebo ak sa zistia samovražedné myšlienky alebo agresívne správanie, odporúča sa prerušiť liečbu a poskytnúť pacientovi primeranú psychiatrickú starostlivosť.
Pacienti s anamnézou duševných alebo duševných problémov. Použitie interferónu alfa-2b u detí a dospievajúcich s existujúcimi duševnými poruchami alebo poruchami v anamnéze je kontraindikované (pozri časť „Kontraindikácie“).
Ak sa rozhodne, že liečba Realdironom je nevyhnutná u dospelých pacientov s existujúcimi duševnými poruchami alebo poruchami v anamnéze, ako aj so závislosťou od alkoholu a drog, mala by sa začať až po príslušnej individuálnej diagnóze a pod neustálym sledovaním duševného stavu.
Liečba interferónom môže zhoršiť príznaky duševných porúch u pacientov infikovaných vírusom hepatitídy C s existujúcimi alebo predchádzajúcimi duševnými poruchami, ako aj závislosť od alkoholu a drog. Ak je u pacientov s takýmito poruchami nevyhnutná liečba interferónom, potom sa na zabezpečenie úspešnej liečby interferónom uskutoční vhodná liečba psychických symptómov. Okrem toho je povinné vyžadovať individuálny skríning správania pacienta a frekvencie prejavov duševných porúch. U týchto pacientov sa odporúča predbežná liečba pred vznikom alebo vývojom psychiatrických príznakov.
Očné poruchy
Všetci pacienti musia pred začatím liečby podstúpiť oftalmologické vyšetrenie. Prerušte liečbu Realdironom, keď sa objavia nové alebo zhoršia existujúce oftalmologické poruchy.
Zmeny štítnej žľazy
V prípade poškodenia štítnej žľazy je možné zahájiť alebo pokračovať v liečbe Realdironom, ak je možné pomocou liekovej terapie udržať obsah TSH na normálnej úrovni. Zastavenie používania Realdironu nevedie k normalizácii funkcie štítnej žľazy, narušenej počas liečby.
Poruchy metabolizmu
V súvislosti s prípadmi vývoja alebo progresie hypertriglyceridémie do ťažkých foriem sa odporúča kontrolovať hladinu krvných lipidov.
Ostatné
Vzhľadom na opísané prípady exacerbácie psoriázy a sarkoidózy počas liečby interferónom alfa sa má Realdiron u týchto pacientov používať, iba ak očakávaný prínos preváži možné riziko.
Aplikácia v pediatrii
Rozhodnutie o začatí kombinovanej liečby u detí by malo byť urobené individuálne, berúc do úvahy obidva príznaky progresie ochorenia (aktivita zápalového procesu v pečeni a fibróza) a prognostické faktory rozvoja virologickej odpovede, genotypu HCV a vírusovej záťaže. Je dôležité mať na pamäti, že kombinovaná liečba môže u niektorých detí, ktoré sa liečili rok, spôsobiť spomalený rast a prírastok hmotnosti, ktorého reverzibilita nie je úplne objasnená. V tejto súvislosti sa odporúča sledovať fyzický vývoj detí počas liečby a ešte 6 mesiacov po ukončení liečby.
Aby sa znížilo riziko spomaleného rastu, malo by sa dieťa, pokiaľ je to možné, liečiť po rýchlom raste počas puberty. Nie sú dôkazy o účinku dlhodobej liečby na pubertu.
Vplyv na reprodukčnú funkciu
Bolo hlásené zníženie koncentrácií estradiolu a progesterónu v sére žien užívajúcich Realdiron. Preto sa Realdiron môže používať u žien v reprodukčnom veku, ak používajú účinnú antikoncepciu počas celého obdobia liečby. Realdiron sa tiež používa s opatrnosťou u mužov v reprodukčnom veku.
Gravidita a laktácia
Nie sú k dispozícii dostatočné údaje o použití Realdironu počas tehotenstva. Realdiron sa má používať počas tehotenstva, ak potenciálny prínos pre matku preváži nad potenciálnou hrozbou pre plod.
Kvôli možným nepriaznivým účinkom na dojča by sa malo ukončiť dojčenie alebo prerušiť užívanie lieku brať do úvahy stupeň potreby tejto liečby pre matku.
Vlastnosti vplyvu lieku na schopnosť viesť vozidlá alebo potenciálne nebezpečné stroje.
Počas liečby je potrebné pacienta varovať pred možným rozvojom slabosti, ospalosti, poruchy vedomia a odporučiť mu vyhnúť sa vedeniu vozidla alebo obsluhe zložitých prístrojov.
Predávkovanie
V súčasnosti nie sú hlásené žiadne prípady predávkovania drogami.
V prípade predávkovania je indikovaná symptomatická liečba.
Táto časť predstavuje návod na použitie interferónov alfa 2b a alfa 2aprvá generácia, ktoré sa tiež nazývajú lineárne, jednoduché alebo krátkodobé. Jedinou výhodou týchto výrobkov je ich relatívne nízka cena.
V roku 1943 W. a J. Heyle objavili takzvaný fenomén interferencie. Pôvodná myšlienka interferónu bola táto: faktor, ktorý zabraňuje množeniu vírusov. V roku 1957 anglický vedec Alik Isaacs a švajčiarsky vedec Jean Lindenman identifikovali tento faktor, jasne ho opísali a pomenovali interferón.
Interferón (IFN) je molekula proteínu, ktorý sa produkuje v ľudskom tele. „Recept“ na jeho syntézu (interferónový gén) je zakódovaný v ľudskom genetickom prístroji. Interferón je jedným z cytokínov, signalizujúcich molekuly, ktoré zohrávajú dôležitú úlohu vo fungovaní imunitného systému.
Od objavu IFN po polstoročí boli študované desiatky vlastností tohto proteínu. Z lekárskeho hľadiska sú hlavnými antivírusové a protinádorové funkcie.
Ľudské telo produkuje asi 20 druhov - celú rodinu - interferónov. IFN sú rozdelené do dvoch typov: I a II.
IFN typu I - alfa, beta, omega, theta - sú produkované a vylučované väčšinou buniek tela ako reakcia na vírusy a niektoré ďalšie látky. Medzi IFN typu II patrí interferón gama, ktorý je produkovaný bunkami imunitného systému v reakcii na pôsobenie cudzích látok.
Spočiatku sa interferónové prípravky získavali iba z krvných buniek darcu; volali sa leukocytové interferóny. V roku 1980 sa začala éra rekombinantných alebo geneticky upravených interferónov. Výroba rekombinantných liekov sa stala oveľa lacnejšou ako výroba podobných liekov z krvi darcov alebo iných biologických surovín; nepoužívajú darovanú krv, ktorá môže slúžiť ako zdroj infekcie. Rekombinantné lieky neobsahujú cudzie nečistoty, a preto majú menej vedľajších účinkov. Ich terapeutický potenciál je vyšší ako u podobných prírodných prípravkov.
Na liečenie vírusových ochorení, najmä hepatitídy C, sa používa hlavne interferón alfa (IFN-α). Rozlišujte medzi „jednoduchými“ („krátkodobými“) interferónmi alfa 2b a alfa 2a a pegylovanými (peginterferón alfa-2a a peginterferón alfa-2b). „Jednoduché“ interferóny sa v EÚ a USA prakticky nepoužívajú, ale u nás sa pre svoju relatívne lacnosť používajú pomerne často. Pri liečbe hepatitídy C sa používajú obe formy „krátkeho“ IFN-α: interferón alfa-2a a interferón alfa-2b (líšia sa jednou aminokyselinou). Injekcie s jednoduchými interferónmi sa zvyčajne podávajú každý druhý deň (s peginterferónmi - raz týždenne). Účinnosť liečby krátkodobými IFN, ak sa podávajú každý druhý deň, je nižšia ako účinnosť peginterferónov. Niektorí odborníci odporúčajú denné injekcie „jednoduchých“ IFN, pretože účinnosť AVT je o niečo vyššia.
Rozsah „krátkych“ IFN je dosť široký. Vyrábajú ich rôzni výrobcovia pod rôznymi názvami: Roferon-A, Intron A, Laferon, Reaferon-EC, Realdiron, Eberon, Interal, Altevir, Alfarona a ďalšie.
Najskúmanejšie (respektíve drahé) sú Roferon-A a Intron-A. Účinnosť liečby údajmi IFN v kombinácii s ribavirínom sa v závislosti od genotypu vírusu a ďalších faktorov pohybuje od 30% do 60%. Zoznam hlavných značiek výrobcov jednoduchých interferónov a ich popis sú uvedené v tabuľke.
Všetky interferóny by sa mali uchovávať v chlade (+2 až +8 stupňov Celzia). Nesmú sa ohrievať ani mraziť. Netraste liekom ani ho nevystavujte priamemu slnečnému žiareniu. Lieky je potrebné prepravovať v špeciálnych kontajneroch.
Vynález sa týka genetického inžinierstva, biotechnológie, medicíny, farmakológie. Nový rekombinantný multikópiový plazmid DNA pSX50 kódujúci syntézu ľudského leukocytového alfa-2b interferónu, ktorého expresia je pod kontrolou promótorov laktózy a tryptofánu a terminátora transkripcie. V dôsledku transformácie buniek recipientného kmeňa E. coli BL21 rekombinantnou plazmidovou DNA pSX50 bol získaný kmeň E. coli SX50 - producent rekombinantného ľudského leukocytového interferónu alfa-2b s produktivitou až 0,9 - 1,0 g interferónu alfa-2b z 1 litra kultivačného média. Metóda získavania rekombinantného alfa-2b interferónu je založená na použití vytvoreného rekombinantného kmeňa E. coli SX50 a zabezpečení jeho hlbokej kultivácie na živnom médiu so zníženým obsahom tryptofánu s kontinuálnym pridávaním výživných substrátov počas biosyntézy, mechanickým ničením buniek mikroorganizmov pri vysokom tlaku, rozpúšťaním agregovaného proteínu koncentrovaný roztok hydrochloridu guanidínu, po ktorom nasleduje renaturácia interferónu vo fyziologických tlmivých roztokoch za prítomnosti chaotropných látok a jeho čistenie pomocou trojstupňovej chromatografickej purifikácie interferónu na živiciach, ako je chelatačná sefaróza Fast Flow imobilizovaná iónmi Cu +2, iónomeničová chromatografia na iónomeničových živiciach, ako sú CM Flow a Seph gél filtračná chromatografia na živiciach typu Superdex 75. Táto metóda umožňuje získať interferónovú látku s čistotou viac ako 99% podľa údajov z elektroforézy za redukčných a neredukčných podmienok pri farbení gélov striebrom a viac ako 98% podľa RF HPLC a bez pyrogénov (LAL-test) v množstve najmenej 400-800 mg z 1 litra kultivačného média. 3 n. a 3 c.p f-kryštály, 6 chor.
Výkresy pre RF patent 2242516
Vynález sa týka geneticky modifikovaných liekov získaných biotechnologickými prostriedkami, konkrétne spôsobov priemyselnej výroby rekombinantného ľudského leukocytového interferónu alfa-2b na lekárske účely (ďalej len interferón), ako aj rekombinantných kmeňov produkujúcich Escherichia coli (E. coli) a plazmidovej DNA, kódujúci syntézu interferónu.
Interferóny sú proteínové molekuly s molekulovou hmotnosťou od 15 000 do 21 000 daltonov produkované a vylučované bunkami v reakcii na vírusovú infekciu alebo iné patogény. Existujú tri hlavné skupiny interferónov: alfa, beta a gama. Samotné tieto skupiny nie sú homogénne a môžu obsahovať niekoľko rôznych molekulárnych druhov interferónu. Takže bolo identifikovaných viac ako 14 genetických odrôd interferónu alfa, ktoré sú zaujímavé a ktoré sa v medicíne široko používajú ako antivírusové, antiproliferatívne a imunomodulačné látky.
Známe spôsoby výroby humánneho leukocytového interferónu z leukocytov darcu v krvi človeka indukované vírusmi a inými induktormi (SU1713591, RU 2066188, RU 2080873).
Hlavnou nevýhodou týchto spôsobov výroby interferónov je pravdepodobnosť kontaminácie konečného produktu ľudskými vírusmi, ako je vírus hepatitídy B a C, vírus imunodeficiencie atď.
V súčasnosti je metóda získania interferónu mikrobiologickou syntézou považovaná za sľubnejšiu, čo umožňuje získať cieľový produkt s výrazne vyšším výťažkom z relatívne lacnej suroviny. Prístupy použité v tomto prípade umožňujú vytvoriť varianty štrukturálneho génu, ktoré sú optimálne pre bakteriálnu expresiu, ako aj regulačné prvky, ktoré riadia jeho expresiu.
Ako východiskové mikroorganizmy sa používajú rôzne konštrukty kmeňov Pichia pastoris, Pseudomonas putida a Escherichia coli.
Nevýhoda použitia P. pastoris ako producenta interferónu (JN Garcia, JA Aguiar et. Al. // Vysoká expresia ľudského IFN-2b v Pichia pastoris. //Biotecnologia Aplicada, 12 (3), 152-155, 1995), sú mimoriadne ťažké podmienky pre fermentáciu tohto typu kvasiniek, je potrebné dôsledne udržiavať koncentráciu induktora, najmä metanolu, v procese biosyntézy. Nevýhodou použitia Ps. putida (SU1364343, SU1640996, SU1591484, RU1616143, RU2142508) je zložitosť fermentačného procesu pri nízkej úrovni expresie (10 mg interferónu na 1 liter kultivačného média). Produktívnejšie je použitie kmeňov Escherichia coli (Semin. Oncol., 1997, Iun; 24 (3 dodatok 9): S9-41-S9-51).
Je známe veľké množstvo plazmidov a kmeňov E. coli na ich základe exprimujúcich interferón: kmene E. coli ATCC 31633 a 31644 s plazmidmi Z-pBR322 (Psti) HclF-11-206 alebo Z-pBR 322 (Pstl) / HclN SN 35. -AHL6 (SU 1764515), kmeň E. coli pINF-AP2 (SU 1312961), kmeň E. coli pINF-F-Pa (AU 1312962), kmeň E. coli SG 20050 s plazmidom p280 / 21FN (Kravchenko V.V. a kol., Bioorganic chemistry, 1987, v. 13, č. 9, str. 1186-1193), kmeň E. coli SG 20050 s plazmidom pINF14 (SU 1703691), kmeň E. coli SG 20050 s plazmidom pINF16 (RU 2054041) a Nevýhodou technológií založených na použití týchto kmeňov je ich nestabilita a nedostatočná expresia interferónu.
Spolu s charakteristikami použitých kmeňov závisí účinnosť procesu do značnej miery od technológie použitej na izoláciu a čistenie interferónu.
Známy spôsob výroby interferónu vrátane kultivácie Ps buniek. putida, ničenie biomasy, spracovanie polyetylénimínom, frakcionácia síranom amónnym, hydrofóbna chromatografia na fenylsilochróme C-80, pH frakcionácia lyzátu, jeho koncentrácia a diafiltrácia, iónomeničová chromatografia na celulóze DE-52, elúcia v gradiente pH, iónomeničové elučné činidlo na celulóze -52, zahustenie prechodom cez filtračnú kazetu a gélová filtrácia na Sephadex G-100 (SU 1640996). Nevýhodou tejto metódy je okrem zložitej viacstupňovej fermentácie aj viacstupňový proces získavania konečného produktu.
Je tiež známy spôsob výroby interferónu, vrátane kultivácie kmeňa E. coli SG 20050 / pIF16, v LB-bujóne v bankách v termostatickej trepačke, centrifugácia biomasy, jej premývanie pufrovacím roztokom a pôsobenie ultrazvuku na zničenie buniek. Výsledný lyzát sa centrifuguje, premyje 3M roztokom močoviny v pufri, rozpustí v roztoku guanidínchloridu v pufri, sonikuje, centrifuguje, oxidatívnou sulfitolýzou, dialýzou proti 8M močovinou, renaturáciou a finálnou dvojstupňovou chromatografiou na CM-52 celulóze a Sephadec G-50 ( RU 2054041). Nevýhodou tejto metódy je jej relatívne nízka produktivita hlavných stupňov procesu izolácie a čistenia. To platí najmä pre ultrazvukové ošetrenie produktu, dialýzu a oxidačnú sulfitolýzu, čo vedie k nestabilite výťažku interferónu, ako aj k nemožnosti použitia tohto spôsobu na priemyselnú výrobu interferónu.
Ako najbližší analóg (prototyp) možno uviesť spôsob výroby ľudského leukocytového interferónu, ktorý spočíva v kultivácii rekombinantného kmeňa E. coli, zmrazení výslednej biomasy pri teplote nie vyššej ako -70 ° C, rozmrazení, zničení buniek mikroorganizmu lyzozýmom, odstránení DNA a RNA zavedením do lyzátu DNázy a čistenie izolovanej nerozpustnej formy interferónu premytím tlmivým roztokom s detergentmi, rozpustením zrazeniny interferónu v roztoku hydrochloridu guanidínu, renaturáciou a jednostupňovým čistením iónovo-výmennou chromatografiou. Ako producent sa použil kmeň E. coli SS5 získaný pomocou rekombinantného plazmidu pSS5 obsahujúceho tri promótory: Plac, Pt7 a P trp a gén interferónu alfa so zavedenými nukleotidovými substitúciami.
Expresia interferónu kmeňom E. coli SS5 obsahujúcim tento plazmid je riadená tromi promótormi: Plac, Pt7 a P trp. Hladina expresie interferónu je asi 800 mg na 1 liter bunkovej suspenzie (RU 2165455).
Nevýhodou tejto metódy je nízka vyrobiteľnosť použitia enzymatickej deštrukcie buniek, DNA a RNA mikroorganizmu a jednostupňovej chromatografickej purifikácie interferónu. To spôsobuje nestabilitu procesu uvoľňovania interferónu, vedie k zníženiu jeho kvality a obmedzuje možnosť použitia vyššie uvedenej schémy na priemyselnú výrobu interferónu. Nevýhodou tohto plazmidu a kmeňa na ňom založeného je použitie silného neregulovaného promótora fága T7 v kmeni E. coli BL21 (DE3) v plazmide, v ktorom je gén T7 RNA polymerázy umiestnený pod promótorom lac operónu a ktorý vždy „prúdi“. V dôsledku toho v bunke neustále prebieha syntéza interferónu, čo vedie k disociácii plazmidu a zníženiu životaschopnosti buniek kmeňa a v dôsledku toho k zníženiu výťažku interferónu.
Cieľom tohto vynálezu je skonštruovať rekombinantný priemyselný produkčný kmeň E. coli s použitím novej rekombinantnej plazmidovej DNA s vysokou úrovňou biosyntézy interferónu a vyvinúť účinnú priemyselnú technológiu na výrobu medicínskej interferónovej látky zodpovedajúcej v kvalite zodpovedajúcej „Európskemu liekopisu“ pre látku interferón alfa-2b.
Tento problém bol vyriešený vytvorením rekombinantnej plazmidovej DNA kmeňa pSX50 a kmeňa Escherichia coli SX50, uloženej v Všeruskej zbierke priemyselných kmeňov Federálneho štátneho jednotného podniku GosNII Genetics, číslo VKPM B-8550,
ako aj spôsob výroby rekombinantného alfa-2b interferónu založený na použití rekombinantného kmeňa E. coli SX50 a poskytovaní jeho hlbokej kultivácie na živnom médiu so zníženým obsahom tryptofánu s kontinuálnym pridávaním výživných substrátov počas biosyntézy, mechanickou deštrukciou buniek mikroorganizmov pri vysokom tlaku, rozpúšťaním agregovaných látok proteín v koncentrovanom roztoku hydrochloridu guanidínu, nasledovaná renaturáciou interferónu vo fyziologických tlmivých roztokoch za prítomnosti chaotropných látok a trojstupňovou chromatografickou purifikáciou interferónu na živiciach typu Chelating Sepharose Fast Flow, imobilizovaných iónmi Cu +2, iónomeničová chromatografia na iónomeničových živiciach, ako je napríklad CM Flow gel Sepharose gel filter chromatografia na živiciach Superdex 75.
Podstata vynálezu Podľa vynálezu je poskytnutý nový rekombinantný multikopy plazmidový DNA pSX50 kódujúci syntézu ľudského leukocytového alfa-2b interferónu, ktorého expresia je riadená laktózovými a tryptofánovými promótormi a transkripčným terminátorom. Plazmid pSX50 má 3218 párov báz (bp) a vyznačuje sa nasledujúcimi fragmentmi:
Sekvencia od 1 nukleotidu do 176 nukleotidu (nt) obsahuje DNA fragment 176 bp obsahujúci tryptofánový promótor (P trp);
Postupnosť od 177 n. do 194 N. zahŕňa syntetický DNA fragment 18 bp obsahujúci Shine Delgarno sekvenciu zodpovednú za zahájenie translácie;
Dedenie po roku 195 n do 695 N. zahŕňa DNA fragment 501 bp obsahujúci sekvenciu interferónového génu s nasledujúcimi nukleotidovými substitúciami: v polohe 37, zmena z A do C, v polohe 39, zmena z G do T, v polohe 40, zmena z A do C, v polohe 42, zmena z G do T , v polohe 67, nahradenie A za C, v pozícii 69 nahradenie G za T, v pozícii 70 nahradenie A za C, v pozícii 72 nahradenie A za T, v pozícii 96 nahradenie G za A, v pozícii 100 nahradenie A za C, c v polohe 102 zmena A na T, v polohe 114 zmena A na C, v polohe 120 zmena C na G, v polohe 126 zmena G na A, v pozícii 129 zmena G na A, na pozícii 330 zmena C na G, na pozícii 339 nahradenie G za A, v pozícii 342 nahradenie G za A, v pozícii 487 nahradenie A za C, v 489 nahradenie A za T, v 495 nahradenie G za A;
Postupnosť od 696 n. do 713 N. zahŕňa syntetický DNA fragment 18 bp obsahujúci syntetický polylinker;
Poradie od 714 n. do roku 1138 n zahŕňa DNA fragment plazmidu pKK223-3 s 4129 nt. do 4553 N. veľkosť 425 bp, obsahujúca sekvenciu striktného terminátora transkripcie rrnBT 1 T 2;
Postupnosť od roku 1139 n do roku 1229 n zahŕňa DNA fragment plazmidu pUC19 s 2487 nt. do 2577 n. veľkosť 91 bp, obsahujúca promótor génu β-laktomázy (génová rezistencia na ampicilín - Amp R);
Postupnosť od roku 1230 n do roku 2045 n. zahŕňa DNA fragment plazmidu pUC4K s 720 nt. do roku 1535 n veľkosť 816 bp, obsahujúca štrukturálnu oblasť génu kan;
Postupnosť od roku 2046 po Kr do 3218 n. zahŕňa fragment DNA plazmidu pUC19 od 1625 do 453 nt. veľkosť 1173 bp, obsahujúca sekvenciu zodpovednú za replikáciu plazmidu (ori) a lac promótora (Plac).
Obrázky 1-5 ukazujú konštrukčné schémy a fyzickú mapu plazmidu pSX50.
Obrázok 6 zobrazuje kompletnú nukleotidovú sekvenciu pre plazmid pSX50.
Kmeň Escherichia coli SX50 sa získal transformáciou buniek Escherichia coli BL21 plazmidom pSX50 pomocou tradičnej technológie genetického inžinierstva. Kmeň E. Coli SX50 sa vyznačuje nasledujúcimi vlastnosťami.
Kultúrne a morfologické charakteristiky
Bunky sú malé, rovné, zosilnené v tvare tyče, gramnegatívne a nešportové. Bunky rastú dobre na jednoduchých živných médiách. Pri pestovaní na agare Difco sa vytvárajú okrúhle, hladké, konvexné, zakalené, lesklé, šedé kolónie s hladkými okrajmi. Keď rastú v kvapalnom prostredí (v minimálnom prostredí s glukózou alebo v LB-bujóne), vytvárajú intenzívny rovnomerný zákal.
Fyzikálno-biologické znaky
Aerobe. Teplotný rozsah pre rast je 4 - 42 ° C s optimálnym pH 6,5 - 7,5.
Ako zdroj dusíka sa používajú minerálne soli vo forme amónneho a dusičnanu, ako aj organické zlúčeniny vo forme aminokyselín, peptónu, tryptónu, kvasnicového extraktu atď.
Ako zdroj uhlíka sa používajú aminokyseliny, glycerín, uhľohydráty. Antibiotická rezistencia. Bunky vykazujú rezistenciu na kanamycín (až do 100 ug / ml).
Kmeň Escherichia coli 8X50 je producent interferónu.
Metóda, podmienky a zloženie média na skladovanie kmeňa
V L-arape s prídavkom kanamycínu na koncentráciu 20 μg / ml pod olejom, v L-bujóne s obsahom 15% glycerínu a zodpovedajúcich antibiotík v ampulkách pri teplote mínus 70 ° C, v lyofilizovanom stave v ampulkách pri teplote plus 4 ° C.
Kmeň Escherichia coli SX50 je identifikovaný v Bergi's Guide (1974) ako kmeň druhu Escherichia coli.
Spôsob priemyselnej výroby interferónu alfa-2b
Charakteristickým rysom navrhovanej metódy je vývoj technológie, ktorá umožňuje izolovať interferón z nerozpustnej formy, ktorá sa hromadí počas fermentácie, čo môže výrazne zjednodušiť vývojový diagram procesu a zvýšiť výťažok cieľového produktu.
Metóda spočíva v kultivácii kmeňa Escherichia coli SX50 v živnom médiu s neustálym pridávaním výživných substrátov, najlepšie glukózy a kvasnicového extraktu, v procese biosyntézy, najlepšie so zníženým obsahom tryptofánu, mechanickou deštrukciou buniek mikroorganizmov pri vysokom tlaku 700 - 900 bar, rozpustením interferónu v pufri roztok hydrochloridu guanidínu, renaturácia interferónu vo fyziologických tlmivých roztokoch za prítomnosti chaotropných látok, nasledovaná trojstupňovou chromatografickou purifikáciou interferónu na chelátujúcich živiciach Sepharose Fast Flow imobilizovaných iónmi Cu +2, iónomeničová chromatografia na iónomeničových živiciach gélu CM typu Sepharose Flow živice ako Superdex 75.
Optimálne podmienky pre jednotlivé fázy získavania interferónu sú nasledujúce:
Fermentácia sa uskutočňuje s kontinuálnym pridávaním substrátov počas celého procesu, čo vedie k vysokej úrovni expresie interferónu;
Deštrukcia buniek sa uskutočňuje v dezintegrátore typu Gaulin pri tlaku 900 bar;
Odstránenie rozpustných bunkových zložiek (DNA, RNA, proteínov, lipopolysacharidov atď.) Sa uskutoční premytím nerozpustnej formy interferónu pufrovacími roztokmi obsahujúcimi detergenty (Triton XI00, močovina atď.);
Výsledná zrazenina obsahujúca interferón sa rozpustí v tlmivom roztoku 6 M hydrochloridu guanidínu;
Renaturácia interferónu sa uskutočňuje vo fyziologickom tlmivom roztoku obsahujúcom chaotropné látky;
Trojstupňové chromatografické čistenie interferónu sa uskutočňuje na chelatačnej sefarózovej Fast Flow, imobilizovanej iónmi Cu + 2, na katiónovej výmennej živici CM Sepharose Fast Flow a gélová filtračná chromatografia na živici typu Superdex 75;
Po každom chromatografickom čistení sa uskutoční sterilizačná filtrácia cez bezpyrogénne filtre s veľkosťou pórov 0,22 um.
Výťažok interferónu v dôsledku použitia opísanej metódy je približne 400 - 800 mg interferónu z 1 litra kultivačného média. Kvalita výsledného produktu zodpovedá normám a požiadavkám „Európskeho liekopisu“ pre látku alfa-2b interferón.
Zásadné rozdiely medzi navrhovanou metódou a prototypom sú:
Použitie kmeňového konštruktu s vyššou produktivitou, ktorá umožňuje získať väčšie množstvo interferónu z 1 litra kultivačného média počas biosyntézy;
Použitie efektívnej mechanickej deštrukcie bunkovej biomasy, ktorá umožňuje získať čistejší extrakt z nerozpustnej formy interferónu za kratší čas a s menšími stratami;
Použitie fyziologických tlmivých roztokov počas renaturácie v prítomnosti chaotropných látok zvyšuje výťažok správne renaturovanej formy interferónu;
Trojstupňové chromatografické čistenie interferónu umožňuje získať interferónovú látku s viac ako 99% čistotou podľa elektroforézy v redukčných a neredukčných podmienkach pri farbení gélov striebrom a viac ako 98% podľa RF HPLC a prakticky bez pyrogénov (test LAL).
Podstata a výhody nárokovanej skupiny vynálezov sú ilustrované nasledujúcimi príkladmi.
Príklad 1. Konštrukcia rekombinantného plazmidu pSX50
Spôsob konštrukcie plazmidu pSX50 zahrnuje nasledujúce kroky:
Konštrukcia vektorového plazmidu pSX10;
1. konštrukcia plazmidu pSX3 (2641 bp)
2. konštrukcia vektorového plazmidu pSX10 (2553 bp)
Konštrukcia rekombinantného plazmidu pSX41 (3218 bp);
Konštrukcia rekombinantného plazmidu pSX43 (3218 bp);
Konštrukcia rekombinantného plazmidu pSX45 (3218 bp);
Konštrukcia rekombinantného plazmidu pSX50 (3218 bp).
Konštrukcia vektorového plazmidu pSX10
Vektorový plazmid pSX10 je vektor pUC19, v ktorom je kódujúca sekvencia génu beta-laktomázy poskytujúca rezistenciu na ampicilín nahradená kódujúcou sekvenciou génu kan a obsahuje terminátor transkripcie z plazmidu pKK223-3.
Konštrukcia vektorového plazmidu pSS10 sa uskutočňuje v dvoch fázach:
Získanie plazmidu pSX3 (2641 bp), čo je plazmid pUC19, v ktorom je kódujúca oblasť génu amp nahradená kódujúcou oblasťou génu kan;
Získanie veterného plazmidu pSX10 (2553 bp), čo je plazmid pSX3, do ktorého je za BamHI miestom vložený DNA fragment kódujúci transkripčný terminátor rBT1 T2.
Na získanie plazmidu pSX3 sa uskutoční päť kôl amplifikácie DNA pomocou PCR (polymerázová reťazová reakcia). V priebehu prvého kola sa pomocou DNA plazmidu pUC19 ako templátu uskutočnila amplifikácia fragmentu DNA s veľkosťou 1828 bp. (fragment PU1-PU2) pomocou primérov:
Táto a následné PCR reakcie sa uskutočňujú za nasledujúcich podmienok: 20 mM Tis-HCl, pH 8,8, 10 mM (NH4) 2S04, 10 mM KCI, 2 tM MgCI2, 0,1% Triton X100, 0,1 mg / ml BSA, 0,2 mM každého dNTP, 1,25 jednotky. Pfu DNA polymeráza, 100 ng DNA. Proces amplifikácie pozostáva z nasledujúcich stupňov: zahrievanie na 95 ° C po dobu 5 minút, 35 cyklov PCR (30 sekúnd pri 95 ° C, 30 sekúnd pri 56 ° C, 2 minúty pri 72 ° C) a inkubácia 10 minút pri 72 ° C. Po amplifikácii (a po ďalších amplifikáciách) sa DNA fragment prečistí elektroforézou v 1% agarózovom géli. V priebehu druhého a tretieho kola sa s použitím plazmidovej DNA pUC4K ako templátu amplifikoval fragment DNA s veľkosťou 555 bp. (fragment KM1-KM2) s použitím primerov:
a amplifikácia 258 bp DNA fragmentu. (KMZ-KM4) s primermi
V piatom kole PCR sa fragmenty (PU1-PU2) a (KM1-KM4) spoja za nasledujúcich podmienok: zahrievanie na 95 ° C po dobu 5 minút, 5 cyklov PCR (30 s 95 ° C, 30 s 56 ° C, 10 min 72 °) C) a inkubácia 10 minút pri 72 ° C. DNA získaná po poslednej PCR sa priamo transformuje do buniek kmeňa E. coli DH5 a naočkuje sa na LA médium obsahujúce 20 μg / ml kanamycínu. Po inkubácii počas 12 hodín pri 37 ° C sa klony preosejú, izoluje sa plazmidová DNA a vykoná sa reštrikčná analýza. Vo výsledku sa získa plazmid pSX3 s veľkosťou 2641 bp.
Na získanie vektorového plazmidu pSX10 sa uskutočňujú tri cykly amplifikácie DNA pomocou PCR. V priebehu prvého kola sa pomocou DNA plazmidu pSX3 ako templátu uskutočnila amplifikácia fragmentu DNA s veľkosťou 2025 bp. (fragment 10.1-10.2) s použitím primerov:
V priebehu druhého kola sa pomocou DNA plazmidu pKK223-3 ako templátu uskutoční amplifikácia fragmentu DNA s veľkosťou 528 bp. (fragment KK1-KK2) s použitím primerov:
V treťom kole PCR sa fragmenty (10.1-10.2) a (KK1-KK2) spoja za nasledujúcich podmienok: zahrievanie na 95 ° C po dobu 5 minút, 5 cyklov PCR (30 s 95 ° C, 30 s 56 ° C, 10 min 72 °) C) a inkubácia 10 minút pri 72 ° C. DNA získaná po poslednej PCR sa priamo transformuje do buniek kmeňa E. coli DH5 a naočkuje sa na LA médium obsahujúce 20 μg / ml kanamycínu. Po inkubácii počas 12 hodín pri 37 ° C sa klony preosejú, izoluje sa plazmidová DNA a vykoná sa reštrikčná analýza. Vo výsledku sa získa plazmid pSX10 s 2553 bp.
Konštrukcia rekombinantného plazmidu pSX41
Rekombinantný plazmid pSX41 je Hind III - BamHI DNA fragment vektorového plazmidu pSX3 (2529 bp), Hind III - EcoRI a 168 bp DNA fragment kódujúci promótor tryptofánu operónu E. coli (P trp), EcoRI-Xbal syntetický DNA fragment s 20 bp kódujúci SD sekvenciu (Shine-Delgarno) a Xbal-BamHI s 501 bp DNA fragmentom kódujúcim ľudský gén interferónu alfa 2b.
Na získanie Hind III - BamHI, DNA fragmentu vektorového plazmidu pSX3 (2529 bp), sa na DNA plazmidu pSX3 pôsobí restrikčnými enzýmami HindIII a BamHI, po čom nasleduje elektroforetické čistenie v 1% agarózovom géli. Hind III EcoRI DNA fragment s veľkosťou 168 bp kódujúci promótor tryptofánového operónu (P trp) sa získa pomocou PCR s použitím celkovej DNA E. coli ako templátu a primerov TRP1 a PRP2, po ktorej nasleduje spracovanie amplifikovaného fragmentu reštrikčnými enzýmami Hindlll a EcoRI:
Na získanie EcoRI-Xbal syntetického 20 bp DNA fragmentu kódujúceho SD sekvenciu (Shine-Delgarno) sa syntetizujú nasledujúce komplementárne oligonukleotidy:
501 bp fragment Xbal-BamIII kódujúci ľudský gén interferónu alfa 2b sa získa pomocou PCR s použitím celkovej ľudskej DNA ako templátu a primérov IFN1 a IFN2, po ktorej nasleduje spracovanie amplifikovaného fragmentu reštrikčnými enzýmami Xbal a BamIII:
Potom sa elektroforeticky purifikované fragmenty spoja, ligujú s enzýmom fágovej ligázy T4, DNA sa transformuje do buniek kmeňa E. coli DH5 a naočkuje sa na LA médium obsahujúce 20 ug / ml kanamycínu. Po inkubácii počas 12 hodín pri 37 ° C sa klony preosejú, izoluje sa plazmidová DNA, uskutoční sa reštrikčná analýza a stanoví sa primárna štruktúra DNA. Vo výsledku sa získa 3218 bp plazmid pSX41. Ďalej sa uskutočňuje postupná mutagenéza interferónového génu na zvýšenie úrovne expresie cieľového produktu. Mutagenéza génu pre interferón spočíva v nahradení tripletov, ktoré sú zriedkavé v E. coli kódujúcich zodpovedajúce aminokyseliny, tripletov, ktoré sa často nachádzajú v E. coli kódujúcich rovnaké aminokyseliny. DNA mutagenéza interferónového génu sa uskutočňuje pomocou PCR.
Konštrukcia rekombinantného plazmidu pSX43
Na získanie rekombinantného plazmidu pSX43 sa uskutoční jedno kolo amplifikácie DNA pomocou PCR s použitím DNA plazmidu pSX41 ako templátu a primérov IFN3 a IFN4:
PCR sa uskutočňuje za nasledujúcich podmienok: zahrievanie na 95 ° C po dobu 5 minút, 20 PCR cyklov (30 s 95 ° C, 30 s 56 ° C, 10 min 72 ° C) a inkubácia 20 minút pri 72 ° C. DNA získaná po PCR sa priamo transformuje do buniek kmeňa E. coli DH5 a naočkuje sa na LA médium obsahujúce 20 μg / ml kanamycínu. Po inkubácii po dobu 12 hodín pri 37 ° C sa klony preosejú, izoluje sa plazmidová DNA, uskutoční sa reštrikčná analýza a stanoví sa primárna štruktúra DNA. Vo výsledku sa získa plazmid pSX43 s veľkosťou 3218 bp.
Konštrukcia rekombinantného plazmidu pSX45
Na získanie rekombinantného plazmidu pSX45 sa uskutoční jedno kolo amplifikácie DNA pomocou PCR s použitím DNA plazmidu pSX43 ako templátu a primérov IFN5 a IFN6:
PCR sa uskutočňuje za nasledujúcich podmienok: zahrievanie na 95 ° C po dobu 5 minút, 20 PCR cyklov (30 s 95 ° C, 30 s 56 ° C, 10 min 72 ° C) a inkubácia 20 minút pri 72 ° C. DNA získaná po PCR sa priamo transformuje do buniek kmeňa E. coli DH5 a naočkuje sa na LA médium obsahujúce 20 μg / ml kanamycínu. Po inkubácii počas 12 hodín pri 37 ° C sa klony preosejú, izoluje sa plazmidová DNA, uskutoční sa reštrikčná analýza a stanoví sa primárna štruktúra DNA. Ako výsledok sa získa 3218 bp plazmid pSX45.
Konštrukcia rekombinantného plazmidu pSX50.
Na získanie rekombinantného plazmidu pSX50 sa uskutoční jedno kolo amplifikácie DNA pomocou PCR s použitím DNA plazmidu pSX45 ako templátu a primérov IFN7 a IFN8:
PCR sa uskutočňuje za nasledujúcich podmienok: zahrievanie na 95 ° C po dobu 5 minút, 20 PCR cyklov (30 s 95 ° C, 30 s 56 ° C, 10 min 72 ° C) a inkubácia 20 minút pri 72 ° C. DNA získaná po PCR sa priamo transformuje do buniek kmeňa E. coli DH5 a naočkuje sa na LA médium obsahujúce 20 μg / ml kanamycínu. Po inkubácii po dobu 12 hodín pri 37 ° C sa klony preosejú, izoluje sa plazmidová DNA, uskutoční sa reštrikčná analýza a stanoví sa primárna štruktúra DNA. Ako výsledok sa získa 3218 bp plazmid pSX50.
Príklad 2. Získanie kmeňa E. coli SX50 - producent interferónu
Kmeň produkujúci interferón E. coli SX50 sa získa transformáciou buniek kmeňa BL21 E. coli rekombinantným plazmidom pSX50. Kmeň produkujúci interferón sa pestuje v 30 I fermentore na optickú hustotu 25,0 - 30,0 o.u. v médiu M9 obsahujúcom 1% kyslého hydrolyzátu kazeínu (Difco), 1% glukózy, 40 μg / ml kanamycínu, pri 38-39 ° C. Počas fermentácie sa nutričný substrát kontinuálne pridáva pomocou gravitometrického regulátora.
Príklad 3. Spôsob izolácie interferónu z kmeňa E. coli SX50
Interferón sa získal v 4 etapách:
1. etapa Kultivácia kmeňa E. coli SX50.
2. etapa Izolácia a čistenie nerozpustnej formy interferónu.
3. etapa Rozpustenie a renaturácia interferónu.
4. etapa Chromatografické čistenie interferónu.
1. etapa Kultivácia kmeňa E. coli SX50
Pestované inokulum kmeňa E. coli SX50 v objeme 3 1 bohatého média LB po dobu 12 hodín pri 26 ° C sa asepticky zavedie do fermentora obsahujúceho 27 l sterilného média obsahujúceho M9, 1% kyslý hydrolyzát kazeínu, 1% glukózu, 1 mM MgCl. 2, 0,1 mM CaCI2, 40 mg / ml kanamycínu. Kultivácia vo fermentore sa uskutočňuje pri teplote 38 - 39 ° C, pričom sa pH udržuje na hodnote 7 ± 0,15 automatickou titráciou 40% roztokom hydroxidu sodného. Koncentrácia rozpusteného kyslíka v rozmedzí (50 ± 10)% nasýtenia sa udržiava zmenou rýchlosti otáčania miešadla zo 100 na 800 otáčok za minútu a prívodu vzduchu z 1 na 15 l / min. Koncentrácia substrátov, najmä glukózy a kvasnicového extraktu, sa meria počas fermentácie a ich koncentrácia sa udržuje zmenou rýchlosti dávkovania koncentrovaných roztokov pomocou peristaltických púmp pomocou gravimetrického regulátora.
Akumulácia nerozpustného interferónu sa monitoruje fázovou kontrastnou mikroskopiou, 15% elektroforézou na polyakrylamidovom géli (SDS-PAAG) a vysokoúčinnou chromatografiou na reverznej fáze (RF HPLC). Fermentácia sa zastaví, keď sa dosiahne maximálna optická hustota (~ 25 - 30 pu) a zastaví sa syntéza interferónu. Na konci fermentácie sa kultivačná kvapalina oddelí odstredením v prietokovom rotore pri rýchlosti otáčania 5 000 až 10 000 ot./min. Biomasa je balená v plastových vreciach a zmrazená pri teplote mínus 70 ° C.
2. etapa Izolácia a čistenie nerozpustnej formy interferónu
300 až 400 g zmrazenej biomasy kmeňa E. coli SX50 sa suspenduje v 3 000 ml pufru 1 (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 0,1% Triton X100). Suspenzia sa vedie cez prietokový homogenizátor Gaulinovho typu, udržuje sa na 900 baroch a centrifuguje sa v prietokovom rotore pri 15 000 ot./min. Výsledná zrazenina sa premyje za podobných podmienok postupne tlmivými roztokmi 2 (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 3 M močovina) a tlmivým roztokom 3 (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) a nakoniec sa interferónová zrazenina suspenduje v 200 ml tlmivého roztoku 3. V tomto prípade čas izolácie a čistenia nerozpustnej formy interferónu nie je dlhší ako 5 hodín.
3. etapa Rozpustenie a renaturácia interferónu
Suchý hydrochlorid guanidínu sa pridá k suspenzii nerozpustnej formy interferónu získanej v predchádzajúcom stupni na koncentráciu 6 M, ditiotreitol sa pridá na koncentráciu 50 mM, Tris-HCl pH 8,0 na koncentráciu 50 mM, NaCI na koncentráciu 150 mM a Triton X100 na koncentráciu 0,1%, inkubuje sa pri Nerozpustný materiál sa oddelí sterilizáciou filtráciou cez membrány s priemermi pórov 0,22 mikrónu.
Renaturácia interferónu sa uskutočňuje pomalým zriedením výsledného roztoku 100 až 200-krát pufrom 4 (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 100 mM NaCI, 0,1 mM EDTA). Potom sa renaturačná zmes inkubuje za stáleho miešania 12 - 15 hodín pri teplote 4 - 8 ° C. Potom sa pridá síran horečnatý s koncentráciou 1 mM a agregovaný materiál sa odstráni sterilizačnou filtráciou cez membránový filter s priemerom pórov 0,22 mikrónov.
4. etapa Chromatografické čistenie interferónu
Chromatografické čistenie interferónu sa uskutočňuje v troch stupňoch.
1. Výsledný renaturovaný interferón v prvom stupni sa čistí afinitnou chromatografiou na chelátovej sefarózovej živici Fast Flow (Amersham Biosciences) imobilizovanej iónmi Cu + 2. Za týmto účelom sa na kolónu nanesie roztok interferónu s chelátovou sefarózou Cu + 2 Fast Flow a interferón sa eluuje 0,1 M roztokom kyseliny citrónovej, pH 2,2.
2. V druhom stupni chromatografického čistenia sa roztok interferónu nanesie na katiónomeničovú živicu CM Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences) a interferón sa eluuje gradientom roztokov (0,0-0,5 M NaCI) v 50 mM Na (CH3COO) tlmivom roztoku, pH 5,5.
3. Purifikácia monomérnej formy interferónu zo zvyškov polymérnych foriem interferónu sa uskutočňuje v treťom stupni čistenia interferónu gélovou filtráciou na živici Superdex 75 (Amersham Biosciences). Chromatografia sa uskutoční v 50 mM Na (CH3COO) pufri, pH 5,0, obsahujúcom 0,15 M NaCI.
Opísaný spôsob izolácie a čistenia interferónu umožňuje získať 4 až 8 g vysoko purifikovaného interferónu v jednom izolačnom cykle po dobu 7 až 10 dní z biomasy získanej z 10 litrov kultivačného média. Kvalita výsledného interferónu plne vyhovuje požiadavkám „Európskeho liekopisu“ pre látku interferón alfa-2b, a to:
Koncentrácia interferónu nie je menšia ako 2 x 108 IU / ml;
Špecifická aktivita interferónu nie je menšia ako 2,0 x 108 IU / mg;
Elektroforetická čistota prípravku nie je nižšia ako 99% v redukčných a neredukčných podmienkach pri farbení gélov striebrom;
Izoelektrický bod izolovaného interferónu je v oblasti pH 5,8 - 6,3;
Peptidová mapa izolovaného interferónu sa zásadne nelíši od peptidovej mapy pre európsky štandard pre interferón alfa 2b CRS;
Ako vyplýva z vyššie uvedených príkladov, nárokovaná skupina vynálezov umožňuje získať interferón alfa-2b vo vysokom výťažku pomocou relatívne jednoduchej a spoľahlivej technológie.
NÁROK
1. Rekombinantná plazmidová DNA pSX50 kódujúca syntézu rekombinantného ľudského interferónu alfa-2b, vyznačujúca sa tým, že má veľkosť 3218 párov báz (bp) a pozostáva z nasledujúcich fragmentov: sekvencia od 1 do 176 nukleotidov (bp) obsahuje fragment. DNA 176 bp, obsahujúca tryptofánový promótor (P trp), sekvencia od 177 do 194 bp. zahŕňa syntetický DNA fragment 18 bp obsahujúci Shine Delgarno sekvenciu zodpovednú za zahájenie translácie, sekvenciu od 195 do 695 nt. Zahŕňa 501 bp DNA fragment obsahujúci gén interferónu alfa-2b s nukleotidovými substitúciami: 37 (A\u003e C), 39 (G\u003e T), 40 (A\u003e C), 42 (G\u003e T), 67 ( A\u003e C), 69 (G\u003e T), 70 (A\u003e C), 72 (A\u003e T), 96 (G\u003e A), 100 (A\u003e C), 102 (A\u003e T), 114 (A \u003e C), 120 (C\u003e G), 126 (G\u003e A), 129 (G\u003e A), 330 (C\u003e G), 339 (G\u003e A), 342 (G\u003e A), 487 (A\u003e C), 489 (A\u003e T), 495 (G\u003e A), sekvencia od 696 do 713 n. zahŕňa syntetický DNA fragment s 18 bp obsahujúci syntetický polylinker, sekvencie od 714 do 1138 bp. zahŕňa DNA fragment plazmidu pKK223-3 od 4129 do 4553 nt. veľkosť 425 bp, obsahujúca sekvenciu striktného terminátora transkripcie rrnBT 1 T 2, sekvenciu od 1139 do 1229 nt. zahŕňa DNA fragment plazmidu pUC19 od 2487 do 2577 nt. veľkosť 91 bp, obsahujúca promótor génu β-laktomázy (génová rezistencia na ampicilín-Amp R), sekvencia od 1230 do 2045 nt. zahŕňa DNA fragment plazmidu pUC4K s 720 nt. do roku 1535 n veľkosť 816 bp, obsahujúca štrukturálnu oblasť génu kan, sekvencia od 2046 bp. do 3218 n. zahŕňa fragment DNA plazmidu pUC19 od 1625 do 453 nt. veľkosť 1173 bp, obsahujúca sekvenciu zodpovednú za replikáciu plazmidu (ori) a lac promótora (Plac).
2. Bakteriálny kmeň Eschcerichia coli SX50 transformovaný rekombinantným plazmidom podľa nároku 1 - producent rekombinantného ľudského leukocytového interferónu alfa-2b.
3. Spôsob výroby humánneho interferónu alfa-2b vrátane kultivácie kmeňa Escherichia coli SX5 podľa nároku 2 v živnom médiu s konštantným pridávaním živných substrátov počas biosyntézy, mechanická deštrukcia buniek mikroorganizmov pri tlaku 700-900 bar, rozpúšťanie interferónu v tlmivom roztoku hydrochloridu guanidínu. , renaturácia interferónu vo fyziologických tlmivých roztokoch za prítomnosti chaotropných látok, trojstupňové chromatografické čistenie interferónu na chelátujúcich živinách Sepharose Fast Flow imobilizovaných iónmi Cu +2, iónová výmenná chromatografia na iónomeničových živiciach CM Sepharose Fast Flow a gélová filtračná chromatografia na živiciach Superdex 75 ...
4. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že sa kultivácia uskutočňuje na živnom médiu so zníženým obsahom tryptofánu za kontinuálneho pridávania výživných substrátov, výhodne glukózy a kvasnicového extraktu.
5. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že pred rozpustením interferónu sa purifikuje odstránením rozpustných bunkových zložiek, vrátane DNA, RNA, proteínov, lipopolysacharidov, premytím pufrovacími roztokmi obsahujúcimi detergenty, ako je Triton XI 00, močoviny.
6. Spôsob podľa nároku 3, v y z n a č u j ú c i s a t ý m, že po každom chromatografickom čistení sa uskutoční sterilizácia filtráciou cez filtre s veľkosťou pórov 0,22 um.
02.02.2018 17:43:00 + 03:00
Preukázaná účinnosť interferónu alfa 2b
Prvýkrát sa svet dozvedel o interferóne - prírodnej bielkovine ľudského tela v roku 1957, keď vedci Alik Isaacs a Jean Lindenmann objavili taký fenomén ako interferencia - komplexný mechanizmus biologických procesov, vďaka ktorým je telo schopné bojovať proti rôznym chorobám. Ale v minulom storočí pravdepodobne netušili, že tento proteín sa stane hlavnou zložkou mnohých liekov.
Interferóny sú bielkoviny, ktoré sú produkované bunkami tela, keď sa do nich zavedú vírusy. Vďaka nim sa aktivujú gény, ktoré sú zodpovedné za syntézu ochranných intracelulárnych molekúl, ktoré poskytujú antivírusový účinok potlačením syntézy vírusových proteínov a zabránením ich reprodukcie. Inými slovami, tieto proteíny (nazývajú sa tiež cytokíny) v našom tele pôsobia ako mocní obrancovia, ktorí chránia naše zdravie a sú prísne ostražití, aby v prípade potreby okamžite odrazili útok vírusov a porazili chorobu.
Na ochranu organizmu infikovaného vírusmi je interferón produkovaný takmer všetkými bunkami v tele. Jeho tvorbu navyše môžu stimulovať nielen vírusy, ale aj bakteriálne toxíny, takže tento proteín je účinný aj pri niektorých bakteriálnych infekciách. Možno teda dospieť k záveru, že tento cytokín je veľmi dôležitou súčasťou ľudského imunitného systému. Bez nej by ľudstvo už dávno porazilo množstvo vírusov a baktérií.
Typy interferónov
Interferóny sú rozdelené do troch typov: alfa, beta a gama, ktoré sú produkované rôznymi bunkami.
- Interferón alfa aktivuje takzvané prirodzené zabíjačské bunky - leukocyty, ktoré ničia vírusy, baktérie a ďalšie „nepriateľské“ látky.
- Interferón beta sa produkuje vo fibroblastoch, bunkách epitelu a makrofágoch, ktoré absorbujú infekčné látky.
- Interferón gama produkujú T-lymfocyty, jeho hlavnou funkciou, ako aj inými typmi, je regulácia imunity.
Ako sa dokázala účinnosť interferónu pri ARVI?
Ako viete, pri predpisovaní terapie sa lekári spoliehajú na svoje skúsenosti a už zavedený systém znalostí. Ale medicína sa rýchlo rozvíja: každý rok sa vo svete vyvíjajú nové účinné metódy liečby a nové lieky sú patentované. Preto bolo nevyhnutné systematizovať najnovšie pokroky a objavy v medicíne, ktorých výsledkom boli klinické pokyny a štandardy liečby. Tieto zdokumentované algoritmy, založené na preukázaných klinických skúsenostiach, popisujú pokyny pre diagnostiku, liečbu, rehabilitáciu a prevenciu chorôb, ktoré je potrebné dodržiavať, a pomáhajú lekárovi pri rozhodovaní o voľbe taktiky terapie v danej situácii.
Napríklad v otázkach poskytovania lekárskej starostlivosti deťom o probléme ARVI a chrípky sa skupina vývojových pracovníkov skladá z približne 40 ľudí a tvoria poprední ruskí špecialisti v oblasti infekčných chorôb z rôznych inštitúcií a rôznych oddelení. Je logické, že špecialisti venujú osobitnú pozornosť liekom, ktoré sú schopné zvládnuť choroby čo najrýchlejšie a zároveň majú minimum vedľajších účinkov. Teraz hovoríme o liekoch obsahujúcich interferón, ktoré pomáhajú bojovať proti ARVI u dospelých a detí.
Ako už bolo spomenuté vyššie, ich schopnosť bojovať proti vírusom bola objavená štúdiom interferencie vedcov Isaacsa a Lindenmanna. Popísali interferón ako „proteín, výrazne menší ako imunoglobulíny, ktorý produkujú bunky v tele po infikovaní živými alebo inaktivovanými vírusmi; schopné potlačiť rast rôznych vírusov v dávkach netoxických pre bunky. ““ Dnes je známe, že tieto proteíny môžu byť produkované takmer všetkými bunkami tela v reakcii na zavedenie zahraničných informácií bez ohľadu na ich etiológiu (vírusy, huby, baktérie, intracelulárne patogény, onkogény). A ich hlavný biologický účinok spočíva v procesoch rozpoznávania a odstraňovania týchto cudzích informácií. Inými slovami, tieto ochranné molekuly „sú schopné“ jemne a presne ničiť vírusy, ktoré obsadili bunky, bez poškodenia samotných buniek. Potvrdili to početné vedecké štúdie.
Pokiaľ ide o spôsoby použitia liekov obsahujúcich interferóny, je potrebné spomenúť niektoré nuansy. Jedným z hlavných problémov liečby interferónom je „dodanie“ účinnej dávky lieku bez toho, aby to malo negatívne následky. V niektorých prípadoch vedie intramuskulárne alebo intravenózne podávanie liekov obsahujúcich interferón k vedľajším účinkom vo forme horúčky, zimnice, bolesti hlavy a iných nežiaducich javov. Tieto príznaky nie sú pre telo kritické a čoskoro zmiznú, ale v priebehu liečby spôsobujú nepríjemné pocity.
Použitie čapíkov obsahujúcich interferón alfa-2b umožnilo minimalizovať vedľajšie účinky liečby interferónom alebo sa úplne zaobišlo bez nich. Podľa vedeckých štúdií rektálne podanie rekombinantného ľudského interferónu v prvých dňoch ochorenia ARVI skracuje dobu horúčky, bojuje proti bežnému nachladnutiu a umožňuje vám rýchlo chorobu poraziť 2. Liečbu dopĺňa intranazálne podávanie liekov (ak sa liek aplikuje na nosovú sliznicu) obsahujúcich interferón alfa-2b a zaisťuje optimálny účinok liečby. Jedným z liekov, ktoré sú vhodné na potlačenie chrípky a iných akútnych respiračných vírusových infekcií v ktoromkoľvek štádiu ochorenia, je VIFERON. Dodáva sa vo forme čapíkov (sviečok), gélu a masti.
Stručný návod na použitie a znášanlivosť liekov obsahujúcich interferón alfa-2b
Kto môže užívať lieky VIFERON:
- dospelí;
- deti od prvých dní života;
- tehotné ženy od 4. týždňa tehotenstva.
Uznanie vedeckou komunitou
Interferón alfa-2b (VIFERON) je zahrnutý v troch federálnych štandardoch lekárskej starostlivosti ako odporúčaný liek na liečbu chrípky a ARVI, ako aj v troch federálnych protokoloch na liečbu týchto chorôb. 1 Ak vezmeme do úvahy nielen chrípku a ARVI, ale aj ďalšie choroby, potom je počet štandardov a odporúčaní týkajúcich sa tohto lieku ešte väčší - interferón (VIFERON) je zahrnutý v 30 federálnych normách pre poskytovanie lekárskej starostlivosti pre dospelých a deti schválených Ministerstvom zdravotníctva Ruskej federácie, ako aj v 21 Protokol (klinické pokyny) o poskytovaní lekárskej starostlivosti o dospelých vrátane tehotných žien a detí.
Princíp drogy
Ľudský rekombinantný interferón alfa-2b, ktorý je súčasťou prípravku VIFERON, má antivírusové, imunomodulačné vlastnosti a inhibuje replikáciu vírusov obsahujúcich RNA a DNA. Antivírusovú liečbu chrípky je možné začať v ktorejkoľvek fáze ochorenia. Pomôže to zlepšiť stav a zabrániť vzniku komplikácií 2. Prípravok VIFERON obsahuje všeobecne známe vysoko aktívne antioxidanty: vitamíny E a C v sviečkach, vitamín E v masti, vitamín E, kyselina citrónová a benzoová v géle. Na pozadí takejto antioxidačnej podpory je zaznamenané zvýšenie antivírusovej aktivity interferónov.
Výsledky drogových testov
VIFERON prešiel celým cyklom klinických skúšok na širokej škále rôznych chorôb na popredných ruských klinikách. Výsledkom výskumu bol dôkaz terapeutickej a profylaktickej účinnosti lieku VIFERON pri rôznych infekčných a zápalových ochoreniach u dospelých a detí vrátane novorodencov a tehotných žien. Bolo vedecky dokázané, že zložité zloženie a forma uvoľňovania poskytujú VIFERONU jedinečné farmakokinetické vlastnosti s predĺženým účinkom interferónu pri absencii vedľajších účinkov, ktoré sú vlastné parenterálnym prípravkom rekombinantných interferónov3.
Na aké choroby sa používajú lieky na báze interferónu?alfa-2 b
VIFERON vo forme čapíkov, gélu a masti sa používa na liečbu nasledujúcich chorôb:
- SARS vrátane chrípky;
- opar;
- infekcia papilomavírusom;
- enterovírusová infekcia;
- laryngotracheobronchitída;
- chronická hepatitída B, C, D, vrátane tých, ktoré komplikuje cirhóza pečene;
- bakteriálna vaginóza;
- kandidóza;
- mykoplazmóza;
- ureaplasmóza;
- gardnerelóza.
Použitie lieku VIFERON ako súčasti komplexnej antivírusovej liečby umožňuje zníženie terapeutických dávok antibakteriálnych a hormonálnych liekov, ako aj zníženie toxických účinkov tejto liečby.
Všeobecný lekár
- http://www.rosminzdrav.ru, vyhláška Ministerstva zdravotníctva Ruskej federácie, http://www.raspm.ru; http://www.niidi.ru; http://www.pediatr-russia.ru; http://www.nnoi.ru
- I. V. Nesterovej „Prípravky interferónov v klinickej praxi: kedy a ako“, „Ošetrujúci lekár“, september 2017.
- „VIFERON je komplexný antivírusový a imunomodulačný liek na liečbu infekčných a zápalových ochorení v perinatológii.“ (Sprievodca pre lekárov), Moskva, 2014.
Použité zdroje: http://www.lsgeotar.ru
