Genų terapijos rinka per ateinančius 10 metų gali tapti greičiausiai augančia rinka pasaulyje. Perspektyvos, kurias atveria genetinė manipuliacija, skatina „Big Pharma“ atstovus ne tik atlikti savo tyrimus, bet ir aktyviai supirkti perspektyviausias įmones.
Farmacijos milžinė Novartis, matyt, gali reikšti plataus genų terapijos įvedimo į pasaulinę klinikinę praktiką pradžią: FDA maisto produktai ir vaistai (Food and Drug Administration, FDA) patvirtino genų terapijos naudojimą pacientams nuo 3 iki 25 metų, kenčiantiems nuo ūmine limfoblastine leukemija.
Gydymas padeda pasiekti remisiją, o kai kuriais atvejais net nugalėti ligą. Žiniasklaida teisingai pavadino šį įvykį „naująja medicinos era“ – genetinės manipuliacijos pagalba žmonija pamažu susidoroja su anksčiau nepagydomomis ligomis.
Pažiūrėkime, kas lėmė „naujos eros“ pradžią ir pažiūrėkime, kur link juda viena perspektyviausių rinkų.
Kaip viskas prasidėjo
Maždaug prieš 15 metų mokslininkams pavyko „perskaityti“ genomą ir pagaliau gauti prieigą prie žmogaus kūno „šaltinio kodo“, kuriame saugomi visi reikalingi duomenys apie jį, o svarbiausia – kontroliuojamas jo gyvenimas ir mirtis. Prireikė dar kelerių metų, kad suprastume įgytas žinias ir pamažu pradėtume jas pritaikyti šioje srityje praktinis pritaikymas: pirmiausia į diagnostinę, o paskui į klinikinę praktiką.
Per pastaruosius 100 metų patogenų valdymas įvairių ligų, kaip ir virusai bei bakterijos, mokslas gana gerai išmoko – dėka vakcinų ir antibiotikų – tačiau ligos, kurias sukelia genų mutacijos, jau seniai buvo laikomos nepagydomomis. Todėl daugiau nei 3 milijardų nukleotidų porų iššifravimas atvėrė tikrai neribotas „ateities medicinos“ kūrimo perspektyvas – pirmiausia prevencinę genetinę terapiją ir, idealiu atveju, visiškai personalizuotą mediciną.
Rinkos ekspertai prognozuoja spartų augimą šiose srityse: prognozuojama, kad vėžio genų terapijos rinka iki 2024 m. pasieks 4 milijardus dolerių, iki 2025 m. visa genų terapijos rinka sieks 11 milijardų dolerių, o visos personalizuotos medicinos prognozės yra dar optimistiškesnės: nuo 149 mlrd. USD 2020 m. iki 2,5 trilijonų USD iki 2022 m.
Pirmieji žmogaus genomo iššifravimo vaisiai buvo įgimtų ligų diagnostikos ar polinkio į jas pagerėjimas (daugelis prisimins atvejį su BRCA1 genu ir Angelina Jolie). Atsižvelgiant į tai, vadinamosios „vartotojiškos genetikos“ rinka pradėjo sparčiai vystytis – iki 2020 m. ji išaugs iki 12 mlrd.
Genetiniai tyrimai suteikia pacientui galimybę atlikti analizę ir rasti jo kūne „blogus genus“ arba, atvirkščiai, pasidžiaugti jų nebuvimu. Iš pradžių gana brangus malonumas(999–2500 USD) tapo vis labiau prieinama, nes sumažėjo sekos sudarymo išlaidos. Pavyzdžiui, šiandien vieno iš pasaulio rinkos lyderių „23andMe“ siūlomo išsamaus tyrimo kaina yra 199 USD. Rusijoje kainos yra šiek tiek didesnės: nuo 20 000 iki 30 000 rublių.
Be to, realybe tampa tikslinė terapija, kuri ypač svarbi ne tik sergant paveldimomis ligomis, bet ir sergant širdies ir kraujagyslių bei infekcinėmis ligomis, taip pat onkologinėmis ligomis – pagrindinėmis mirties priežastimis visame pasaulyje. Genetinė manipuliacija leidžia pacientui įvesti „gerus“ genus, kurie kompensuoja problemas, kylančias dėl blogo „blogųjų“ genų veikimo, pavyzdžiui, hemofilijos atveju, o ateityje jie taip pat galės „pataisyti“ arba visiškai pašalinti kenksmingus genus, pavyzdžiui, tuos, kurie sukelia neurodegeneracinę Hantingtono ligą. Nors genų terapija farmacijos rinkoje užima labai kuklią vietą, jos dalis tikrai nuolat augs.
Žinoma, vis dar yra daug problemų, kurias reikia išspręsti: tai didelė imuninių reakcijų rizika, didelės terapijos kainos ir, galbūt, net etiniai klausimai, susiję su genetiniais pokyčiais žmogaus organizme. Tačiau tokios manipuliacijos yra šansas pacientams, kurių ligos laikomos nepagydomomis arba negali būti veiksmingai gydomos esamais vaistais, taip pat naujas ginklas kovojant su senėjimu, suteikiantis žmonijai vilties sveiko ilgaamžiškumo visiškai kitokiu lygmeniu. rinka – naujos, kur perspektyvesni plėtros keliai.
Pirmosios pergalės
Ši programa pradeda veikti nuo brendimo momento ir lėtai, bet nenumaldomai veda į mirtį. Be to, tai gana reguliuojamas procesas. Kiekviena rūšis turi aiškią gyvenimo ribą, kuri jai yra skirta. Pavyzdžiui, pelei jis vidutiniškai yra 2,5 metų, žmogui - maždaug 80 metų. Tuo pačiu metu yra ir kitų graužikų, gyvenančių kelis kartus ar net eilės tvarka ilgiau nei pelės – pavyzdžiui, voverės ar garsioji nuoga kurmio žiurkė.
Pagrindinis klausimas – ar senėjimą galima išjungti ar bent sulėtinti. Galbūt revoliucinė technologija, pakeičianti ląstelių vystymąsi, kurią atrado Shinya Yamanaka, Kioto universiteto Pažangiųjų medicinos mokslų instituto profesorius, padės atsakyti į šį klausimą: jis nustatė, kad skatinant keturių transkripcijos faktorių (spalio 4, Sox2, Klf4 ir c-Myc, ir visi kartu – OSKM, arba Yamanaka faktoriai), kurie glaudžiai susiję su pagrindiniais ląstelės gyvavimo ciklo etapais, somatines ląsteles vėl paverčia pluripotentinėmis. Už šį tikrai revoliucinį atradimą Yamanaka 2012 metais gavo Nobelio premiją.
Naudodama Yamanakos proveržį, Salko instituto mokslininkų komanda, vadovaujama Juano Carloso Izpisua Belmonte'o, bandė panaudoti šį natūralų atkūrimo mechanizmą. biologinis laikrodis pratęsti suaugusių gyvūnų gyvenimą. Ir aš neklydau. Naudodami Yamanaka faktorius, jie galėjo patvirtinti hipotezę apie galimybę atsukti „epigenetinį laikrodį“, ty ląstelių atjauninimą, ir padidinti vidutinę greitai senstančių pelių gyvenimo trukmę 33–50%, palyginti su įvairiomis kontrolinėmis grupėmis. .
16886 0
Geno, kurio mutacijos sukelia specifines ligas, vietos ir sekos nustatymas, taip pat pati mutacija ir šiuolaikiniai metodai jo tyrimas leidžia diagnozuoti ligą neo- ir net prenataliniu organizmo vystymosi periodu. Tai leidžia sušvelninti genetinio defekto pasireiškimą gydymas vaistais, dietos, kraujo perpylimai ir kt.
Tačiau šis metodas nepadeda ištaisyti paties defekto ir, kaip taisyklė, paveldimos ligos nėra išgydomos. Situaciją dar labiau apsunkina tai, kad vieno geno mutacija gali turėti labai skirtingą poveikį organizmui. Jei dėl geno mutacijos pasikeičia jo koduojamo fermento aktyvumas, tai gali lemti toksiško substrato kaupimąsi arba, atvirkščiai, normaliam ląstelės funkcionavimui reikalingo junginio trūkumą.
Gerai žinomas tokios ligos pavyzdys yra fenilketonurija. Jį sukelia kepenų fermento fenilalanino dehidroksilazės geno mutacija, kuri katalizuoja fenilalanino pavertimą tirozinu. Dėl to kraujyje padidėja endogeninio fenilalanino kiekis, dėl kurio aplink aksonus susidaro netinkamas mielino apvalkalas. nervų ląstelės centrinė nervų sistema ir dėl to sunkus protinis atsilikimas.
Jei mutacija paveikia struktūrinio baltymo geną, ji gali sukelti rimtų sutrikimų ląstelių, audinių ar organų lygyje. Tokios ligos pavyzdys yra cistinė fibrozė.
Dėl geno, koduojančio baltymą, vadinamą cistinės fibrozės transporteriu, delecija sukelia baltymų sintezės defektus (trūksta fenilalanino 508) ir chloro jonų pernešimo per ląstelių membranas. Vienas iš žalingiausių to padarinių yra tai, kad plaučius išklojančios ir saugančios gleivės tampa neįprastai storos. Tai apsunkina prieigą prie plaučių ląstelių ir skatina jų kaupimąsi kenksmingų mikroorganizmų. Ląstelės, išklojusios plaučių kvėpavimo takus, miršta ir jas pakeičia pluoštinis randinis audinys (iš čia ir kilęs ligos pavadinimas). Dėl to pacientas miršta nuo kvėpavimo nepakankamumo.
Paveldimos ligos yra sudėtingos klinikinės apraiškos, o jų tradicinis gydymas dažniausiai yra simptominis: fenilketonurijai gydyti skiriama dieta be alanino, sugedę baltymai pakeičiami funkciniais. į veną Norint kompensuoti prarastas funkcijas, atliekama kaulų čiulpų ar kitų organų transplantacija. Visos šios priemonės dažniausiai yra neveiksmingos, brangios, atimančios daug laiko, o iki senatvės išgyvena tik keli pacientai. Todėl iš esmės naujų terapijos rūšių kūrimas yra labai svarbus.
Genų terapija
Genų terapija yra žmogaus somatinių ląstelių genų inžinerija, skirta ištaisyti genetinį defektą, sukeliantis ligą. Konkrečios ligos korekcija atliekama įvedant normaliai išreikštus genus į defektines somatines ląsteles. Iki devintojo dešimtmečio, kai buvo sukurti atskirų genų gavimo metodai ir sukurti eukariotų ekspresijos vektoriai, genų perkėlimo eksperimentai su pelėmis tapo įprasti, o genų korekcijos perspektyvos tapo realios.1990 m. JAV daktaras W. Frenchas Andrsonas pirmą kartą pabandė genų terapiją gydyti sunkų kombinuotą imunodeficitą (SCID) trejų metų mergaitei Ashanti da Silva. Šią ligą sukelia adenosanadenilazę (ADA) koduojančio geno mutacija. Šio fermento trūkumas prisideda prie adenozino ir deoksiadenozino kaupimosi kraujyje, toksinis poveikis dėl to miršta periferinio kraujo B ir T limfocitai ir dėl to atsiranda imunodeficitas.
Šia liga sergantys vaikai turi būti apsaugoti nuo bet kokių infekcijų (laikyti specialiose steriliose kamerose), nes bet kokia liga gali būti mirtina. Praėjus ketveriems metams nuo gydymo pradžios, vaikui pasireiškė normaliai funkcionuojanti ADA ir palengvėjo SCID simptomai, todėl ji paliko sterilią kamerą ir gyveno įprastą gyvenimą.
Taigi buvo įrodyta esminė sėkmingos somatinių ląstelių genetinės terapijos galimybė. Nuo 90-ųjų. Bandoma daugybė genų terapijų genetinės ligos, įskaitant tokias sunkias ligas kaip hemofilija, AIDS, skirtingi tipai piktybiniai navikai, cistinė fibrozė ir kt Šis momentas Apie 10 žmonių ligų jau gali būti išgydomos naudojant transgenezę.
Dėl genetinių ligų įvairovės buvo sukurta daugybė genų terapijos metodų. Šiuo atveju išsprendžiamos 2 pagrindinės problemos: terapinio geno pristatymo priemonė; metodas, užtikrinantis tikslinį patekimą į korekcijai skirtas ląsteles. Iki šiol visus somatinių ląstelių genų terapijos būdus galima suskirstyti į dvi kategorijas: ex vivo ir in vivo terapiją (3.15 pav.).
Ryžiai. 3.15. Genų terapijos schema ex vivo (a) ir in vivo (a)
Ex vivo genų terapija apima sugedusių ląstelių genetinį koregavimą už kūno ribų ir normaliai veikiančių ląstelių grąžinimą atgal į kūną.
In vivo genų terapija apima terapinio geno tiekimą tiesiai į konkretaus paciento audinio ląsteles. Pažvelkime į šiuos metodus išsamiau.
Ex vivo genų terapija apima šiuos veiksmus:
1) pažeistų ląstelių paėmimas iš paciento ir jų kultivavimas;
2) pageidaujamo geno perkėlimas į izoliuotas ląsteles, naudojant terapinio geno konstrukcijos transfekciją;
3) genetiškai koreguotų ląstelių atranka ir išplėtimas;
4) šių ląstelių transplantacija arba perpylimas pacientui.
Naudojant paties paciento ląsteles užtikrinama, kad grįžus jiems neatsiras imuninis atsakas. Geno konstrukcijos perkėlimo procedūra turi būti efektyvi, o normalus genas turi būti stabiliai palaikomas ir nuolat ekspresuojamas.
Pačios gamtos sukurtos genų perdavimo priemonės yra virusai. Norint gauti veiksmingus vektorius genų perdavimui, daugiausia naudojamos dvi virusų grupės – adenovirusai ir retrovirusai (3.16 pav.). Genų terapijoje naudojami genetiškai neutralizuotų virusų variantai.
Ryžiai. 3.16. Virusai, naudojami terapiniams vektoriams kurti
Panagrinėkime retrovirusų pagrindu sukurtų dizainų dizainą ir naudojimą. Prisiminkime, kad retroviruso genomą vaizduoja dvi identiškos vienagrandė RNR molekulės, kurių kiekviena susideda iš šešių skyrių: dviejų ilgų galinių pakartojimų (LTR) 5" ir 3" galuose, nekoduojanti seka * P+, reikalingas RNR supakuoti į viruso dalelę, ir trys sritys, koduojančios vidinės kapsidės (gag), atvirkštinės transkriptazės (pol) ir apvalkalo baltymo (env) struktūrinį baltymą (3.17a pav.).
Ryžiai. 3.17. Tipiško retroviruso (a) genetinis žemėlapis ir retrovirusinio vektoriaus žemėlapis (a)
Prisiminkime, kad retroviruso gyvavimo ciklas apima šiuos etapus:
1. Tikslinių ląstelių infekcija.
2. Genomo DNR kopijos sintezė naudojant savo atvirkštinę transkriptazę.
3. Viruso DNR pernešimas į branduolį.
4. Viruso DNR inkorporavimas į šeimininko ląstelės chromosomą.
5. iRNR transkripcija iš virusinės DNR kontroliuojant stiprų promotorių, lokalizuotą 5"-LTR srityje.
6. Gag, Pol ir Env baltymų vertimas.
7. Viruso kapsidės susidarymas ir dviejų RNR grandinių bei atvirkštinės transkriptazės molekulių pakavimas.
8. Virionų išlaisvinimas iš ląstelės.
Gaunant retrovirusinį vektorių, viso ilgio retroviruso DNR įterpiama į plazmidę, pašalinama didžioji dalis gag geno ir visi pol bei env genai, o vietoj jų – „gydomasis“ T genas ir, jei reikia. , įterpiamas selektyvus žymeninis genas Rg su savo promotoriumi (3.17 pav., b ). T geno transkripciją kontroliuos tas pats stiprus promotorius, lokalizuotas 5"-LTR srityje. Remiantis šia schema buvo sukurti įvairūs retrovirusiniai vektoriai ir maksimalus DNR intarpo dydis – maždaug 8 tūkst. bp.
Tokiu būdu gautas konstruktas pats gali būti panaudotas transformacijai, tačiau jo efektyvumas ir vėlesnė integracija į šeimininko ląstelės genomą yra itin žemi. Todėl buvo sukurta technika, skirta retrovirusinio vektoriaus viso ilgio RNR pakuoti į nepažeistas virusines daleles, kurios dideliu dažniu prasiskverbia į ląstelę ir garantuotai bus integruotos į šeimininko genomą. Šiuo tikslu buvo sukurta vadinamoji „pakavimo“ ląstelių linija. Dviejuose skirtinguose šių ląstelių chromosomų skyriuose yra įterpti retrovirusiniai genai gag ir pol-env, kurie dėl sekos + (84*+) trūkumo netenka galimybės pakuotis (3.18 pav.).
Ryžiai. 3.18. Supakuoto virusinio vektoriaus gavimo schema
Tai yra, abu šie fragmentai yra transkribuojami, tačiau susidaro tuščios kapsidės, kuriose nėra RNR. Kai virusinė vektorinė RNR yra transfekuota į tokias ląsteles, ji integruojama į chromosomų DNR ir transkribuojama, kad susidarytų viso ilgio retrovirusinė RNR, o tokiomis sąlygomis tik vektorinė RNR yra supakuota į kapsidus (tik joje yra + seka). Gautos nepažeistos viruso dalelės naudojamos efektyviam retrovirusinio vektoriaus pristatymui į tikslines ląsteles.
Retrovirusai aktyviai užkrečia tik greitai besidalijančias ląsteles. Norint perkelti genus, jie yra apdorojami išgrynintomis supakuoto retrovirusinio vektoriaus dalelėmis arba kartu kultivuojami su juos gaminančia ląstelių linija, o tada atrenkami, kad būtų atskirtos tikslinės ląstelės nuo pakavimo ląstelių.
Transdukuotos ląstelės yra kruopščiai tikrinamos, ar nėra terapinio geno produkto sintezės lygio, ar nėra replikacijai kompetentingų retrovirusų ir ar nepasikeitė ląstelių gebėjimas augti arba funkcionuoti.
Genų terapijai tinkamiausios yra kaulų čiulpų ląstelės. Taip yra dėl to, kad yra totipotentinių embrioninių kamieninių ląstelių, kurios gali daugintis ir diferencijuotis į įvairių tipų ląsteles – B ir T limfocitus, makrofagus, eritrocitus, trombocitus ir osteoklastus. Būtent šiomis ląstelėmis gydoma daugybė paveldimų ligų, įskaitant jau minėtą sunkų kombinuotą imunodeficitą, Gošė ligą, pjautuvinę anemiją, talasemiją, osteoporozę ir kt.
Be totipotentinių kaulų čiulpų kamieninių ląstelių, kurias sunku išskirti ir kultivuoti, hipercholesterolemijai gydyti naudojamos kamieninės ląstelės iš virkštelės kraujo (pageidautina naudoti genų terapijai naujagimiams), taip pat kepenų ląstelės – hepatocitai.
In vivo genų terapija ypač svarbu užtikrinti terapinio geno patekimą į defektines ląsteles. Tokį tikslinį pristatymą gali užtikrinti modifikuoti vektoriai, sukurti remiantis virusais, galinčiais užkrėsti specifiniai tipai ląstelės. Apsvarstykite jau minėtą cistinės fibrozės gydymo metodą. Kadangi plaučiai yra atvira ertmė, jiems gana lengva pristatyti terapinius genus. Klonuota sveiko geno versija buvo įvesta į inaktyvuotą adenovirusą (3.19 pav.). Šio tipo viruso specifiškumas yra tas, kad jis užkrečia plaučių gleivinę ir sukelia peršalimą.
Ryžiai. 3.19. Adenoviruso vektoriaus gavimo schema
Taip sukonstruotas virusas buvo išbandytas purškiant jį į eksperimentinių gyvūnų nosį ir plaučius, o vėliau – į pacientus. Kai kuriais atvejais buvo pastebėtas sveiko geno įvedimas ir ekspresija bei normalaus chlorido jonų transportavimo atstatymas. Gali būti, kad šis metodas (įprasto geno įvedimas naudojant nosies purškalus) artimiausiu metu bus plačiai taikomas gydant cistinės fibrozės simptomus plaučiuose.
Be retro ir adenovirusų, genų terapijos eksperimentuose taip pat naudojami kitų tipų virusai, pavyzdžiui, Herpes simplex virusas. Ypatinga šio dvigubos grandinės (152 kb) DNR viruso savybė yra jo gebėjimas specifiškai užkrėsti neuronus. Yra daug žinomų genetinių ligų, pažeidžiančių centrinę ir periferinę nervų sistema- navikai, medžiagų apykaitos sutrikimai, neurodegeneracinės ligos (Alzheimerio liga, Parkinsono liga).
I tipo herpes simplex virusas (HSV) yra labai tinkamas pernešėjas tokioms ligoms gydyti. Šio viruso kapsidas susilieja su neurono membrana, o jo DNR pernešama į branduolį. Buvo pasiūlyta keletas terapinio geno perdavimo būdų naudojant HSV vektorius ir buvo atlikti sėkmingi bandymai su eksperimentiniais gyvūnais.
Virusiniai vektoriai turi keletą trūkumų: didelę kainą, ribotą klonavimo pajėgumą ir galimą uždegiminį atsaką. Taigi 1999 m., atsiradus neįprastai stipriam imuniniam atsakui į adenovirusinio vektoriaus įvedimą, mirė 18 metų savanoris, dalyvavęs vaistų tyrimuose. 2002 m. du vaikai Prancūzijoje susirgo į leukemiją panašia liga, kai buvo gydomi nuo imunodeficito (naudojant retrovirusus į kamienines ląsteles įvedant terapinius genus).
Todėl kuriamos nevirusinės genų pristatymo sistemos. Paprasčiausias ir labiausiai efektyvus metodas– Tai plazmidinės DNR injekcija į audinius. Antrasis būdas yra bombarduoti audinius aukso mikrodalelėmis (1–3 mikronai), susietomis su DNR. Šiuo atveju terapiniai genai išreiškiami tiksliniuose audiniuose ir jų produktai – gydomieji baltymai patenka į kraują. Pagrindinis šio metodo trūkumas yra priešlaikinis šių baltymų inaktyvavimas arba sunaikinimas kraujo komponentais.
DNR gali būti pristatyta supakavus ją į dirbtinį lipidų apvalkalą. Tokiu būdu gautos sferinės liposomų dalelės lengvai prasiskverbia pro ląstelės membraną. Buvo sukurtos įvairių savybių liposomos, tačiau kol kas tokio pristatymo efektyvumas yra žemas, nes dauguma DNR sunaikinama lizosomų pavidalu. Be to, norint pristatyti genetinį konstrukciją, DNR konjugatai sintetinami su įvairiomis molekulėmis, kurios gali užtikrinti jo saugumą, tikslinį pristatymą ir prasiskverbimą į ląstelę.
Pastaraisiais metais buvo vykdomi intensyvūs eksperimentai, siekiant sukurti dirbtinę 47-ąją chromosomą, kuri leistų įtraukti didelį kiekį genetinės medžiagos su pilnu vieno ar kelių terapinių genų reguliavimo elementų rinkiniu. Tai leistų panaudoti terapinio geno genominį variantą ir taip užtikrinti jo stabilumą bei veiksmingą ilgalaikę ekspresiją. Eksperimentai parodė, kad dirbtinės žmogaus chromosomos su terapiniais genais sukūrimas yra visiškai įmanomas, tačiau kol kas neaišku, kaip tokią didžiulę molekulę įvesti į tikslinės ląstelės branduolį.
Pagrindiniai iššūkiai, su kuriais susiduria genų terapija, be sunkios imuninės reakcijos rizikos, yra sunkumai ilgalaikis saugojimas ir terapinės DNR funkcionavimą paciento organizme, daugelio ligų daugiageniškumą, todėl jos tampa sunkiais genų terapijos taikiniais, taip pat rizika, kad virusai bus naudojami kaip vektoriai.
ANT. Voinovas, T.G. Volova
Per gana trumpą gyvavimo istoriją genų terapija patyrė pakilimų ir nuosmukių: kartais mokslininkai ir praktikai ją laikydavo kone panacėja, o vėliau prasidėjo nusivylimo ir skepticizmo laikotarpis...
Idėjos apie galimybę į organizmą įvesti genus terapiniais tikslais buvo išsakytos dar praėjusio amžiaus 60-ųjų pradžioje, tačiau realūs žingsniai buvo žengti tik devintojo dešimtmečio pabaigoje ir buvo glaudžiai susiję su tarptautiniu žmogaus genomo iššifravimo projektu.
1990 metais buvo bandoma taikyti genų terapiją dėl sunkaus, dažnai su gyvybe nesuderinamo, paveldimo imunodeficito, atsiradusio dėl geno, koduojančio fermento adenozindeaminazės sintezę, defekto. Tyrimo autoriai pranešė apie aiškų gydomąjį poveikį. Ir nors laikui bėgant kilo nemažai abejonių dėl gauto efekto patvarumo ir specifinių jo mechanizmų, būtent šis darbas buvo galingas postūmis plėtoti genų terapiją ir pritraukė milijardines investicijas.
Genų terapija yra medicininis metodas, pagrįstas genų konstrukcijų įvedimu į ląsteles įvairioms ligoms gydyti. Norimas efektas pasiekiamas arba dėl įvesto geno ekspresijos, arba dėl sugedusio geno funkcijos slopinimo. Reikia pabrėžti, kad genų terapijos tikslas yra ne „gydyti“ genus kaip tokius, o jų pagalba gydyti įvairias ligas.
Paprastai kaip „vaistas“ naudojamas DNR fragmentas, turintis reikiamą geną. Tai gali būti tiesiog „nuoga DNR“, paprastai kartu su lipidais, baltymais ir kt. Tačiau daug dažniau DNR įvedama kaip dalis specialių genetinių konstrukcijų (vektorių), sukurtų įvairių žmonių ir gyvūnų virusų pagrindu naudojant genų inžinerijos manipuliacijų skaičius. Pavyzdžiui, iš viruso pašalinami jo dauginimuisi reikalingi genai. Tai, viena vertus, daro virusines daleles praktiškai saugias, kita vertus, „atlaisvina vietos“ genams, skirtiems įvesti į organizmą.
Esminis genų terapijos taškas yra geno konstrukcijos įsiskverbimas į ląstelę (transfekcija), daugeliu atvejų – į jos branduolį. Svarbu, kad geno konstrukcija pasiektų būtent tas ląsteles, kurias reikia „gydyti“. Todėl genų terapijos sėkmė labai priklauso nuo optimalaus ar bent jau patenkinamo genų konstrukcijų įvedimo į organizmą metodo pasirinkimo.
Dėl virusinių vektorių padėtis yra daugiau ar mažiau nuspėjama: jie plinta visame kūne ir prasiskverbia į ląsteles kaip jų protėvių virusai, suteikdami pakankamai aukštas lygis organų ir audinių specifiškumas. Tokios konstrukcijos paprastai leidžiamos į veną, į pilvaplėvės ertmę, po oda arba į raumenis.
Buvo sukurta daugybė nevirusinių vektorių, skirtų „tiksliniam pristatymui“ specialius metodus. Paprasčiausias būdas norimo geno pristatymas į ląsteles in vivo – tiesioginis genetinės medžiagos įšvirkštimas į audinį. Šio metodo naudojimas yra ribotas: injekcijos gali būti atliekamos tik į odą, užkrūčio liauką, dryžuotus raumenis ir kai kuriuos solidinius navikus.
Kitas transgeno pristatymo būdas yra balistinė transfekcija. Jis pagrįstas organų ir audinių „gliaudymu“ sunkiųjų metalų (aukso, volframo) mikrodalelėmis, padengtomis DNR fragmentais. „Gauti“ jie naudoja specialų „genų pistoletą“.
Gydant plaučių ligas, galima įterpti genetinę medžiagą Kvėpavimo takai aerozolio pavidalu.
Ląstelių transfekcija taip pat gali būti atliekama ex vivo: ląstelės išskiriamos iš kūno, genetiškai manipuliuojamos ir vėl įvedamos į paciento kūną.
Gydome: paveldimą...
Pradiniame genų terapijos vystymosi etape pagrindiniais jos objektais buvo laikomos paveldimos ligos, kurias sukelia vieno geno nebuvimas arba nepakankama funkcija, tai yra monogeniniai. Buvo manoma, kad normaliai veikiančio geno įvedimas pacientui padės išgydyti ligą. Ne kartą buvo bandoma gydyti „karališką ligą“ – hemofiliją, Diušeno raumenų distrofiją, cistinę fibrozę.
Šiandien genų terapijos metodai yra kuriami ir išbandomi beveik 30 monogeninių žmogaus ligų. Tuo tarpu klausimų lieka daugiau nei atsakymų, ir dažniausiai realus gydomasis efektas nepasiektas. To priežastys, visų pirma, yra organizmo imuninė reakcija, laipsniškas įvesto geno funkcijų „susilpnėjimas“, taip pat nesugebėjimas pasiekti „tikslinės“ perkelto geno integracijos į chromosomų DNR.
Mažiau nei 10% genų terapijos tyrimų yra skirti monogeninėms ligoms, o likusi dalis yra susijusi su nepaveldimomis patologijomis.
...ir įsigijo
Įgytos ligos nėra susijusios su įgimtu genų struktūros ir funkcijos defektu. Jų genų terapija grindžiama principu, kad į organizmą įvestas „terapinis genas“ turėtų paskatinti baltymo sintezę, kuris arba turės gydomąjį poveikį, arba padės padidinti individualų jautrumą vaistų poveikiui.
Genų terapija gali būti taikoma kraujo krešulių prevencijai, širdies raumens kraujagyslių sistemos atstatymui po miokardo infarkto, aterosklerozės profilaktikai ir gydymui, taip pat kovojant su ŽIV infekcija ir vėžiu. Pavyzdžiui, intensyviai kuriamas navikų genų terapijos metodas, pvz., navikinių ląstelių jautrumo chemoterapiniams vaistams didinimas, atliekami klinikiniai tyrimai, kuriuose dalyvauja pacientai, sergantys pleuros mezoteliomą, kiaušidžių vėžiu, glioblastoma. 1999 metais patvirtintas prostatos vėžio gydymo protokolas, parinktos saugios chemoterapijos dozės, įrodytas teigiamas gydomasis poveikis.
Sauga ir etika
Atliekant genetines manipuliacijas su žmogaus organizmu keliami ypatingi saugumo reikalavimai: juk bet koks svetimos genetinės medžiagos patekimas į ląsteles gali turėti neigiamų pasekmių. Nekontroliuojama „naujų“ genų integracija į tam tikras paciento genomo dalis gali sutrikdyti „savo“ genų funkciją, o tai savo ruožtu gali sukelti nepageidaujamus pokyčius organizme, ypač vėžinių navikų susidarymą.
Be to, neigiami genetiniai pokyčiai gali atsirasti somatinėse ir lytinėse ląstelėse. Pirmuoju atveju kalbame apie vieno žmogaus likimą, kai su genetine korekcija susijusi rizika yra nepalyginamai mažesnė nei mirties nuo esamos ligos rizika. Kai genų konstrukcijos įvedamos į lytines ląsteles, nepageidaujami genomo pokyčiai gali būti perduodami ateities kartoms. Todėl atrodo visiškai natūralu, kad norima uždrausti lytinių ląstelių genetinės modifikacijos eksperimentus ne tik dėl medicininių, bet ir dėl etinių priežasčių.
Nemažai moralinių ir etinių problemų yra susijusios su genų intervencijos į besivystančio žmogaus embriono ląsteles metodų kūrimu, tai yra, intrauterine genų terapija (gimdos terapija). Jungtinėse Amerikos Valstijose galimybė taikyti genų terapiją gimdoje svarstoma tik esant dviem sunkioms genetinėms ligoms: sunkaus kombinuoto imunodeficito, kurį sukelia adenozino deaminazės fermento geno defektas, ir homozigotinės beta talasemijos – sunkios. paveldima liga, susijęs su visų keturių globino genų ar mutacijų juose nebuvimu. Jau yra sukurta ir preliminariam tyrimui ruošiama nemažai genų konstrukcijų, kurias patekus į organizmą, tikimasi kompensuoti genetinius defektus ir pašalinti šių ligų simptomus. Tačiau tokių manipuliacijų neigiamų genetinių pasekmių rizika yra gana didelė. Todėl intrauterinės genų terapijos etika taip pat išlieka prieštaringa.
Šių metų sausį JAV vėl laikinai buvo uždrausti eksperimentai su genų terapija. Priežastis buvo pavojingų komplikacijų kurie atsirado dviem vaikams po genų terapijos dėl paveldimo imunodeficito. Prieš kelis mėnesius Prancūzijoje vienam iš vaikų, kurie, kaip manoma, buvo išgydyti genų terapija, buvo diagnozuotas į leukemiją panašus sindromas. Ekspertai neatmeta, kad retrovirusinių vektorių naudojimas gydymo metu gali būti vaikų komplikacijų vystymosi priežastis. Dabar Maisto kontrolės agentūros atstovai ir vaistai(FDA) apsvarstys galimybę tęsti genų terapijos eksperimentus individualiai, ir tik tuo atveju, jei nėra kitų ligos gydymo metodų.
Ne panacėja, o perspektyva
Negalima paneigti, kad tikroji genų terapijos sėkmė gydant konkrečius pacientus yra gana kukli, o pats požiūris dar tik duomenų kaupimo ir technologijų kūrimo stadijoje. Genų terapija netaps ir, aišku, niekada netaps panacėja. Organizmo reguliacinės sistemos yra tokios sudėtingos ir taip mažai ištirtos, kad paprasčiausiai įvedus geną daugeliu atvejų nėra reikiamo terapinio poveikio.
Tačiau nepaisant viso to, genų terapijos pažadą vargu ar galima pervertinti. Yra pagrindo tikėtis, kad pažanga molekulinės genetikos ir genų inžinerijos technologijų srityje lems neabejotiną sėkmę gydant žmonių ligas naudojant genus. Ir galiausiai genų terapija teisėtai užims savo vietą praktinėje medicinoje.
Atrodo, kad genų terapija gali turėti netikėtų rezultatų. Mokslininkų teigimu, 2012 metais vyks olimpinės žaidynės, kuriose pasirodys transgeniniai superatletai. „DNR dopingas“ suteiks neabejotinų pranašumų
lavinant jėgą, ištvermę ir greitį. Neabejotina, kad aršios konkurencijos sporte sąlygomis atsiras sportininkų, pasiruošusių genetinei modifikacijai, net ir atsižvelgiant į galimą riziką, susijusią su naujų technologijų naudojimu.
Žmogaus genų terapija plačiąja prasme apima funkciškai aktyvaus geno (-ų) įvedimą į ląsteles, kad būtų ištaisytas genetinis defektas. Yra du galimi paveldimų ligų gydymo būdai. Pirmuoju atveju somatinės ląstelės (ląstelės, išskyrus lytines ląsteles) yra genetiškai transformuojamos. Šiuo atveju genetinio defekto korekcija apsiriboja konkrečiu organu ar audiniu. Antruoju atveju pakeičiamas lytinių ląstelių (spermatozoidų ar kiaušinėlių) arba apvaisintų kiaušinėlių (zigotų) genotipas, kad visos iš jų besivystančio individo ląstelės turėtų „pataisytus“ genus. Taikant genų terapiją, naudojant lytinių ląstelių ląsteles, genetiniai pokyčiai perduodami iš kartos į kartą.
Somatinių ląstelių genų terapijos politika.
1980 metais JAV katalikų, protestantų ir žydų bendruomenių atstovai parašė atvirą laišką prezidentui, kuriame išdėstė savo požiūrį į genų inžinerijos panaudojimą žmonių atžvilgiu. Šios problemos etiniams ir socialiniams aspektams įvertinti buvo sukurta Prezidento komisija ir Kongreso komisija. Tai buvo labai svarbios iniciatyvos, nes Jungtinėse Valstijose viešąjį interesą veikiančios programos dažnai vykdomos remiantis tokių komisijų rekomendacijomis. Galutinėse abiejų komisijų išvadose buvo aiškiai atskirta somatinių ląstelių genų terapija ir lytinių ląstelių genų terapija. Somatinių ląstelių genų terapija priskiriama standartiniam medicininės intervencijos į organizmą metodui, panašiam į organų transplantaciją. Priešingai, lytinių ląstelių genų terapija buvo laikoma technologiškai per sudėtinga ir etiškai pernelyg sudėtinga, kad ją būtų galima nedelsiant įgyvendinti. Padaryta išvada, kad reikia parengti aiškias taisykles, reglamentuojančias tyrimus somatinių ląstelių genų terapijos srityje; panašių dokumentų, susijusių su lytinių ląstelių genų terapija, kūrimas buvo laikomas per anksti. Siekiant sustabdyti visą nelegalią veiklą, buvo nuspręsta nutraukti visus eksperimentus lytinių ląstelių genų terapijos srityje.
Iki 1985 m. jie buvo parengę dokumentą „Paraiškų eksperimentams somatinių ląstelių genų terapijos srityje rengimo ir pateikimo taisyklės“. Jame buvo pateikta visa informacija apie tai, kokius duomenis reikia pateikti kreipiantis dėl leidimo tirti somatinių ląstelių genų terapiją žmonėms. Pagrindas buvo paimtas iš reglamentuojančių taisyklių laboratoriniai tyrimai su rekombinantine DNR; jie buvo pritaikyti tik biomedicinos tikslams.
Aštuntajame dešimtmetyje biomedicinos teisės aktai buvo peržiūrėti ir išplėsti. kaip atsakas į 1972 m. paskelbtus 40 metų Nacionalinės sveikatos tarnybos Alabamos eksperimento su 400 neraštingų sifiliu sergančių afroamerikiečių grupe rezultatus. Eksperimentas buvo atliktas siekiant ištirti natūralų šios lytiškai plintančios ligos vystymąsi, gydymas nebuvo atliktas. Žinia apie tokią siaubingą neinformuotų žmonių patirtį sukrėtė daugelį JAV. Kongresas nedelsdamas sustabdė eksperimentą ir priėmė įstatymą, draudžiantį daugiau kada nors atlikti tokius tyrimus.
Tarp klausimų, skirtų asmenims, kurie kreipėsi dėl leidimo eksperimentuoti somatinių ląstelių genų terapijos srityje, buvo šie:
- 1. Kokia liga turėtų būti gydoma?
- 2. Kiek tai rimta?
- 3. Ar yra alternatyvių gydymo būdų?
- 4. Kuo pavojingas siūlomas gydymas pacientams?
- 5. Kokia gydymo sėkmės tikimybė?
- 6. Kaip bus atrenkami pacientai klinikiniams tyrimams?
- 7. Ar ši atranka bus nešališka ir reprezentatyvi?
- 8. Kaip pacientai bus informuojami apie tyrimus?
- 9. Kokia informacija jiems turėtų būti suteikta?
- 10. Kaip bus gautas jų sutikimas?
- 11. Kaip bus užtikrintas informacijos apie pacientus ir tyrimus konfidencialumas?
Kai buvo pradėti genų terapijos eksperimentai, daugumą klinikinių tyrimų paraiškų pirmiausia peržiūrėjo įstaigos, kurioje turėjo būti atlikti tyrimai, etikos komitetas, prieš perduodamas Žmogaus genų terapijos pakomitečiui. Pastarasis paraiškas vertino pagal jų mokslinę ir medicininę reikšmę, atitiktį galiojančioms taisyklėms, argumentų įtikinamumą. Jei prašymas buvo atmestas, jis buvo grąžintas su reikiamomis pastabomis. Pasiūlymo autoriai galėtų peržiūrėti pasiūlymą ir jį perdaryti. Jei paraiška buvo patvirtinta, Genų terapijos pakomitetis ją aptarė viešose diskusijose pagal tuos pačius kriterijus. Patvirtinus tokio lygio paraišką, pakomitečio direktorius ją patvirtino ir pasirašė įgaliojimą atlikti klinikinius tyrimus, be kurių jie negalėjo pradėti. Pastaruoju atveju ypatingas dėmesys buvo skiriamas gaminio gavimo būdui, jo grynumo kokybinės kontrolės būdams, kokie ikiklinikiniai tyrimai buvo atlikti gaminio saugai užtikrinti.
Tačiau laikui bėgant paraiškų skaičiui augant, o genų terapijai tapus, vieno komentatoriaus žodžiais tariant, „laimėjusiu bilietu medicinoje“, pradinis paraiškos patvirtinimo procesas buvo laikomas bereikalingai daug laiko reikalaujančiu ir pertekliniu. Atitinkamai, po 1997 m. Genų terapijos pakomitetis nebebuvo viena iš agentūrų, prižiūrinčių žmogaus genų terapijos tyrimus. Jei pakomitetis egzistuoja, jis greičiausiai sudarys forumus, kuriuose bus aptariami etiniai su žmogaus genų terapija susiję klausimai. Tuo tarpu reikalavimas, kad visi genų terapijos taikymai būtų aptariami viešai, buvo panaikintas. Agentūra, atsakinga už biologinių produktų gamybos ir naudojimo stebėseną, konfidencialiai atlieka visus būtinus vertinimus, siekdama užtikrinti, kad būtų gerbiamos kūrėjų nuosavybės teisės. Žmogaus genų terapija šiuo metu laikoma saugia medicininė procedūra, nors ir ne itin efektyvus. Anksčiau išreikštas susirūpinimas išsisklaidė ir tapo vienu iš pagrindinių naujų požiūrių į žmonių ligų gydymą.
Dauguma ekspertų mano, kad žmogaus somatinių ląstelių genų terapijos bandymų patvirtinimo procesas Jungtinėse Valstijose yra gana tinkamas; tai garantuoja nešališką pacientų atranką ir jų sąmoningumą bei visų manipuliacijų atlikimą tinkamai, nedarant žalos tiek konkretiems pacientams, tiek visai žmonių populiacijai. Kitos šalys šiuo metu taip pat rengia genų terapijos tyrimų reglamentus. JAV tai buvo daroma atidžiai pasveriant kiekvieną pasiūlymą. Kaip sakė daktaras Waltersas, vienas iš Genų terapijos pakomitečio klausymų 1989 m. sausio mėn. dalyvių: „Nežinau jokio kito biomedicinos mokslo ar technologijos, kuri būtų taip plačiai ištirta kaip genų terapija“.
Defektuotų genų kaupimasis ateities kartose.
Yra nuomonė, kad genetinių ligų gydymas taikant somatinių ląstelių genų terapiją neišvengiamai sukels žmonių populiacijos genofondo pablogėjimą. Jis pagrįstas idėja, kad sugedusio geno dažnis populiacijoje didės iš kartos į kartą, nes genų terapija skatins mutantinių genų perdavimą kitai kartai iš tų žmonių, kurie anksčiau negalėjo susilaukti palikuonių arba negalėjo susilaukti palikuonių. išgyventi iki pilnametystės. Tačiau ši hipotezė pasirodė neteisinga. Remiantis populiacijos genetika, už tai, kad dėl to žymiai padidėtų kenksmingo ar mirtino geno dažnis efektyvus gydymas tai trunka tūkstančius metų. Taigi, jei reta genetinė liga pasireiškia 1 iš 100 000 gyvų gimimų, po veiksmingos genų terapijos įvedimo prireiks maždaug 2 000 metų, kol šios ligos dažnis padvigubės iki 1 iš 50 000.
Be to, kad mirtino geno dažnis beveik nedidėja iš kartos į kartą, todėl ilgalaikis gydymas visiems kam reikia, atskirų individų genotipas taip pat išlieka nepakitęs. Šį dalyką galima iliustruoti pavyzdžiu iš evoliucijos istorijos. Primatai, įskaitant žmones, negali sintetinti gyvybiškai svarbių medžiagų svarbus vitaminas C, jie turi jį gauti iš išorinių šaltinių. Taigi galime teigti, kad visi esame genetiškai pažeisti šios gyvybiškai svarbios medžiagos geno. Priešingai, varliagyviai, ropliai, paukščiai ir ne primatai žinduoliai sintetina vitaminą C. Tačiau genetinis defektas, dėl kurio neįmanoma biosintetinti vitamino C, daugiau nei milijonus metų „netrukdė“ sėkmingai primatų evoliucijai. Taip pat kitų genetinių defektų taisymas nesukels reikšmingo „nesveikų“ genų kaupimosi ateities kartose.
Lytinių ląstelių genų terapija.
Eksperimentai žmogaus lytinių ląstelių genų terapijos srityje dabar griežtai draudžiami, tačiau reikia pripažinti, kad kai kurias genetines ligas galima išgydyti tik tokiu būdu. Žmogaus lytinių ląstelių genų terapijos metodika dar nėra pakankamai išvystyta. Tačiau neabejotina, kad tobulėjant genetinės manipuliacijos gyvūnams metodams ir diagnostinis tyrimas preimplantacijos embrionai užpildys šią spragą. Be to, somatinių ląstelių genų terapijai tapus įprastesnėmis, tai turės įtakos žmonių požiūriui į žmogaus lytinių ląstelių genų terapiją ir laikui bėgant reikės ją išbandyti. Belieka tikėtis, kad iki to laiko bus išspręstos visos problemos, susijusios su praktinio genų terapijos panaudojimo pasekmėmis žmogaus lytinių ląstelių ląstelėms, įskaitant socialines ir biologines.
Manoma, kad žmogaus genų terapija padeda gydyti rimtos ligos. Iš tiesų, tai gali padėti ištaisyti daugybę fizinių ir psichinių sutrikimų, nors lieka neaišku, ar visuomenei toks genų terapijos naudojimas bus priimtinas. Kaip ir bet kuri kita nauja medicinos kryptisŽmogaus lytinių ląstelių genų terapija kelia daug klausimų, būtent:
- 1. Kiek kainuoja žmogaus lytinių ląstelių genų terapijos metodų kūrimas ir diegimas?
- 2. Ar vyriausybė turėtų nustatyti medicininių tyrimų prioritetus?
- 3. Ar prioritetinė genų terapijos plėtra lytinėms ląstelėms lems kitų gydymo metodų paieškos darbų apribojimą?
- 4. Ar pavyks pasiekti visus pacientus, kuriems to reikia?
- 5. Ar asmuo ar įmonė galės gauti išskirtines teises gydyti konkrečias ligas taikant genų terapiją?
Žmonių klonavimas.
Visuomenės susidomėjimas žmonių klonavimo galimybe atsirado septintajame dešimtmetyje, po to, kai buvo atlikti atitinkami eksperimentai su varlėmis ir rupūžėmis. Šie tyrimai parodė, kad apvaisinto kiaušinėlio branduolį galima pakeisti nediferencijuotos ląstelės branduoliu ir embrionas vystysis normaliai. Taigi iš esmės galima išskirti branduolius iš nediferencijuotų organizmo ląstelių, įterpti juos į apvaisintus to paties organizmo kiaušinėlius ir susilaukti palikuonių, kurių genotipas toks pat kaip ir tėvas. Kitaip tariant, kiekvienas iš palikuonių organizmų gali būti laikomas pirminio donoro organizmo genetiniu klonu. 1960 m atrodė, kad nepaisant techninių galimybių trūkumo, varlių klonavimo rezultatus nebuvo sunku ekstrapoliuoti žmonėms. Spaudoje pasirodė daug straipsnių šia tema, buvo parašyti net mokslinės fantastikos kūriniai. Viena iš istorijų buvo apie klastingai nužudyto JAV prezidento Johno F. Kennedy klonavimą, tačiau populiaresnė tema buvo piktadarių klonavimas. Darbai apie žmogaus klonavimą buvo ne tik neįtikėtini, bet ir propagavo klaidingą ir labai pavojingą mintį, kad žmogaus asmenybės bruožus, charakterį ir kitas savybes lemia tik jo genotipas. Tiesą sakant, žmogus kaip asmenybė formuojasi veikiamas tiek savo genų, tiek aplinkos sąlygų, ypač kultūrinių tradicijų. Pavyzdžiui, piktybinis rasizmas, kurį skelbė Hitleris, yra įgyta elgesio savybė, kuri nėra nulemta nei vieno geno, nei jų derinio. Kitoje aplinkoje su skirtingomis kultūrinėmis savybėmis „klonuotas Hitleris“ nebūtinai būtų susiformavęs į asmenybę, panašią į tikrąjį Hitlerį. Taip pat „Motinos Teresės klonas“ nebūtinai „padarytų“ moterį, kuri savo gyvenimą paskyrė padėti vargšams ir ligoniams Kalkutoje.
Tobulėjant žinduolių reprodukcinės biologijos metodams ir kuriant įvairius transgeninius gyvūnus, tapo vis labiau aišku, kad žmogaus klonavimas yra ne per tolimos ateities reikalas. Spėlionės tapo realybe 1997 m., kai buvo klonuota avis, vardu Dolly. Tam buvo panaudotas diferencijuotos avies donorės ląstelės branduolys. Metodologinis požiūris, kuris buvo naudojamas Dolly „sukurti“, iš esmės yra tinkamas bet kokių žinduolių, įskaitant žmones, klonams gauti. Ir net jei tai nepasiteisina kitoms žinduolių rūšims, tikriausiai nereikės per daug eksperimentuoti, kad būtų sukurtas tinkamas metodas. Dėl to žmogaus klonavimas iš karto taps bet kokių diskusijų, susijusių su genetikos ir biologinės medicinos etinėmis problemomis, objektu.
Be jokios abejonės, žmogaus klonavimas yra sudėtingas ir prieštaringas klausimas. Kai kuriems atrodo nepriimtina pati idėja sukurti jau egzistuojančio asmens kopiją eksperimentiniu būdu. Kiti mano, kad klonuotas individas yra tas pats, kas identiškas dvynys, nepaisant amžiaus skirtumo, todėl klonavimas nėra iš prigimties kenkėjiškas, nors galbūt ir ne visai būtinas. Klonavimas gali turėti teigiamą medicininį ir socialinį poveikį, kuris išimtiniais atvejais pateisina jo įgyvendinimą. Pavyzdžiui, tai gali būti gyvybiškai svarbu sergančio vaiko tėvams. Atsakomybę už žmogaus klonavimo eksperimentus daugelyje šalių reglamentuoja įstatymai, draudžiami visi su žmogaus klonavimu susiję tyrimai. Tokių apribojimų pakanka, kad būtų pašalinta žmogaus klonavimo galimybė. Tačiau klausimas dėl žmogaus klonavimo neišvengiamumo tikrai iškils.
Diušeno raumenų distrofija yra viena iš retų, bet vis dar gana dažnų genetinių ligų. Liga diagnozuojama nuo trejų iki penkerių metų, dažniausiai berniukams, iš pradžių pasireiškianti tik sunkiais judesiais, dešimties metų sergantis tokia raumenų distrofija jau nebegali vaikščioti, o iki 20 metų – 22 jo gyvenimas baigiasi. Jį sukelia distrofino geno, esančio X chromosomoje, mutacija. Jis koduoja membraną apimantį baltymą raumenų ląstelė su susitraukiamomis skaidulomis. Funkciškai tai savotiška spyruoklė, užtikrinanti sklandų ląstelės membranos susitraukimą ir vientisumą. Geno mutacijos sukelia skeleto raumenų audinio, diafragmos ir širdies distrofiją. Ligos gydymas yra paliatyvus ir gali tik šiek tiek palengvinti kančias. Tačiau vystantis genų inžinerijai, šviesa tunelio gale.
Apie karą ir taiką
Genų terapija yra nukleorūgščių pagrindu pagamintų konstrukcijų pristatymas į ląsteles genetinėms ligoms gydyti. Tokios terapijos pagalba galima koreguoti genetinę problemą DNR ir RNR lygiu, pakeičiant norimo baltymo raiškos procesą. Pavyzdžiui, DNR su pataisyta seka gali būti pristatyta į ląstelę, su kuria sintetinamas funkcinis baltymas. Arba, atvirkščiai, galima pašalinti tam tikras genetines sekas, kurios taip pat padės sumažinti žalingą mutacijos poveikį. Teoriškai tai paprasta, tačiau praktiškai genų terapija yra pagrįsta sudėtingiausiomis darbo su mikroskopiniais objektais technologijomis ir yra pažangių žinių molekulinės biologijos srityje rinkinys.
DNR injekcija į zigotos branduolį yra viena iš ankstyviausių ir tradiciškiausių transgenų kūrimo technologijų. Injekcija atliekama rankiniu būdu, naudojant itin plonas adatas po mikroskopu su 400 kartų padidinimu.
„Distrofino genas, kurio mutacijos sukelia Diušeno raumenų distrofiją, yra didžiulis“, – sako Vadimas Žernovkovas, biotechnologijų įmonės Marlin Biotech plėtros direktorius, biologijos mokslų kandidatas. „Joje yra 2,5 milijono nukleotidų porų, kurias būtų galima palyginti su raidžių skaičiumi romane „Karas ir taika“. Ir įsivaizduokime, kad iš epo išplėšėme kelis svarbius puslapius. Jei šiuose puslapiuose aprašomi reikšmingi įvykiai, suprasti knygą jau būtų sunku. Bet su genu viskas yra sudėtingiau. Nesunku būtų surasti kitą „Karo ir taikos“ egzempliorių, o tada būtų galima perskaityti trūkstamus puslapius. Tačiau distrofino genas yra X chromosomoje, o vyrų – tik vienas. Taigi gimimo berniukų lytinėse chromosomose saugoma tik viena geno kopija. Kitos nėra kur gauti.
Galiausiai, sintetinant baltymus iš RNR, svarbu išlaikyti skaitymo rėmą. Skaitymo rėmelis nustato, kuri trijų nukleotidų grupė yra skaitoma kaip kodonas, atitinkantis vieną baltymo aminorūgštį. Jei iš geno pašalinamas DNR fragmentas, kuris nėra trijų nukleotidų kartotinis, skaitymo rėmelis pasislenka – pasikeičia kodavimas. Tai būtų galima palyginti su situacija, kai išplėšus puslapius visoje likusioje knygoje visos raidės abėcėlėje pakeičiamos kitomis. Rezultatas bus abrakadabra. Tas pats nutinka ir su netinkamai sintetintais baltymais.
Biomolekulinis pleistras
Vienas iš veiksmingi metodai genų terapija normaliai baltymų sintezei atkurti – egzonų praleidimas naudojant trumpas nukleotidų sekas. „Marlin Biotech“ šiuo metodu jau sukūrė darbo su distrofino genu technologiją. Kaip žinoma, transkripcijos (RNR sintezės) procese pirmiausia susidaro vadinamoji pre-template RNR, kurioje yra ir baltymus koduojančios sritys (egzonai), ir nekoduojančios sritys (intronai). Toliau prasideda sujungimo procesas, kurio metu atskiriami intronai ir egzonai ir susidaro „subrendusi“ RNR, susidedanti tik iš egzonų. Šiuo metu kai kurie egzonai gali būti užblokuoti, „užsandarinti“ specialių molekulių pagalba. Dėl to subrendusioje RNR nebus tų koduojančių sričių, kurių norėtume atsikratyti, ir taip bus atkurtas skaitymo rėmas ir susintetintas baltymas.
„Mes ištaisėme šią technologiją in vitro“, – sako Vadimas Žernovkovas, tai yra, naudojant ląstelių kultūras, išaugintas iš pacientų, sergančių Diušeno raumenų distrofija, ląstelių. Tačiau atskiros ląstelės nėra organizmas. Įsiverždami į ląstelių procesus, pasekmes turime stebėti gyvai, tačiau įtraukti žmonių į tyrimus neįmanoma dėl įvairių priežasčių– nuo etinio iki organizacinio. Todėl reikėjo gauti laboratorinį Diušeno raumenų distrofijos modelį su tam tikromis mutacijomis.
Kaip suleisti mikrokosmosą
Transgeniniai gyvūnai – tai laboratorijoje gauti gyvūnai, kurių genomas buvo tikslingai ir apgalvotai pakeistas. Praėjusio amžiaus aštuntajame dešimtmetyje tapo aišku, kad transgenų kūrimas yra svarbiausias metodas genų ir baltymų funkcijų tyrimai. Vienas iš ankstyviausių būdų gauti visiškai genetiškai modifikuotą organizmą buvo DNR injekcija į apvaisintų kiaušinėlių zigotų probrandulį („branduolių pirmtaką“). Tai logiška, nes lengviausia modifikuoti gyvūno genomą pačioje jo vystymosi pradžioje.
Diagramoje parodytas CRISPR/Cas9 procesas, apimantis subgenominę RNR (sgRNR), jos sritį, kuri veikia kaip orientacinė RNR, ir Cas9 nukleazės baltymą, kuris nupjauna abi genominės DNR grandines nukreipiančiosios RNR nurodytoje vietoje.
Įpurškimas į zigotos branduolį yra labai nebanali procedūra, nes kalbame apie mikroskalą. Pelės kiaušinio skersmuo yra 100 mikronų, o branduolys yra 20 mikronų. Operacija vyksta po mikroskopu su 400 kartų didinimu, tačiau injekcija yra pati didžiausia rankų darbo. Žinoma, „injekcijai“ naudojamas ne tradicinis švirkštas, o speciali stiklinė adata su tuščiaviduriu kanalu viduje, į kurį surenkama genų medžiaga. Vieną jo galą galima laikyti rankoje, o kitas – itin plonas ir aštrus – plika akimi praktiškai nematomas. Žinoma, tokios trapios konstrukcijos iš borosilikatinio stiklo ilgai laikyti negalima, todėl laboratorija turi rinkinį ruošinių, kurie prieš pat darbą ištraukiami specialia mašina. Naudojama speciali kontrastinės ląstelės vizualizavimo sistema be dažymo – intervencija į probrandulį savaime yra traumuojanti ir yra ląstelės išlikimo rizikos veiksnys. Dažai būtų dar vienas toks veiksnys. Laimei, kiaušiniai yra gana atkaklūs, tačiau zigotų, iš kurių susidaro transgeniniai gyvūnai, skaičius yra tik keli procentai viso skaičiaus. iš viso kiaušinėlių, į kuriuos buvo suleista DNR.
Kitas etapas yra chirurginis. Atliekama operacija, per kurią į pelės recipientės kiaušintakį persodinamos mikroinjektuotos zigotos, kurios taps būsimų transgenų surogatine motina. Tada laboratorinis gyvūnas natūraliai pereina nėštumo ciklą ir gimsta palikuonys. Paprastai vadoje yra apie 20% transgeninių pelių, o tai taip pat rodo metodo netobulumą, nes joje yra didelis atsitiktinumo elementas. Sušvirkštas mokslininkas negali tiksliai kontroliuoti, kaip įvesti DNR fragmentai bus integruoti į būsimo organizmo genomą. Yra didelė tikimybė, kad tokie deriniai lems gyvūno mirtį embriono stadijoje. Nepaisant to, metodas veikia ir yra gana tinkamas daugeliui mokslinių tikslų.
Transgeninių technologijų plėtra leidžia gaminti gyvūninius baltymus, kurių paklausa farmacijos pramonė. Šie baltymai išgaunami iš transgeninių ožkų ir karvių pieno. Taip pat yra specifinių baltymų gavimo iš vištų kiaušinių technologijos.
DNR žirklės
Tačiau yra veiksmingesnis būdas, pagrįstas tiksliniu genomo redagavimu naudojant CRISPR / Cas9 technologiją. „Šiandien molekulinė biologija yra šiek tiek panaši į tolimų jūrų ekspedicijų po burėmis erą“, – sako Vadimas Žernovkovas. — Beveik kiekvienais metais šiame moksle atsiranda reikšmingų atradimų, galinčių pakeisti mūsų gyvenimą. Pavyzdžiui, prieš kelerius metus mikrobiologai išsiaiškino, kad bakterijų rūšis, kuri buvo tyrinėta ilgą laiką, buvo atspari virusinės infekcijos. Kaip rezultatas tolesnis tyrimas Paaiškėjo, kad bakterijų DNR yra specialių lokusų (CRISPR), iš kurių sintetinami RNR fragmentai, galintys komplementariai prisijungti prie svetimų elementų, pavyzdžiui, DNR ar RNR virusų, nukleorūgščių. Cas9 baltymas, kuris yra nukleazės fermentas, jungiasi prie tokios RNR. RNR tarnauja kaip Cas9 vadovas, žyminti tam tikrą DNR dalį, kurioje nukleazė pjauna. Maždaug prieš trejus ar penkerius metus pasirodė pirmieji moksliniai straipsniai, kuriuose CRISPR/Cas9 technologija buvo sukurta genomo redagavimui.
Transgeninės pelės leidžia sukurti gyvus sunkių žmogaus genetinių ligų modelius. Žmonės turėtų būti dėkingi šioms mažytėms būtybėms.
Palyginti su atsitiktinio įterpimo konstrukto įvedimo metodu, naujasis metodas leidžia pasirinkti CRISPR/Cas9 sistemos elementus taip, kad RNR kreiptuvai būtų tiksliai nukreipti į norimas genomo sritis ir būtų pasiektas tikslinis jų ištrynimas arba įterpimas. norimą DNR seką. Šiam metodui taip pat pasitaiko klaidų (vadovinė RNR kartais jungiasi ne į tą vietą, kur ji yra nukreipta), tačiau naudojant CRISPR/Cas9 transgenų kūrimo efektyvumas jau siekia apie 80%. „Šis metodas turi plačias perspektyvas ne tik kuriant transgenus, bet ir kitose srityse, ypač genų terapijoje“, – sako Vadimas Žernovkovas. „Tačiau technologija dar tik savo kelionės pradžioje ir gana sunku įsivaizduoti, kad artimiausiu metu žmonių genų kodas bus koreguojamas naudojant CRISPR/Cas9. Nors yra klaidos galimybė, yra ir pavojus, kad žmogus neteks svarbios koduojančios genomo dalies.
Pieno vaistas
Rusijos kompanijai „Marlin Biotech“ pavyko sukurti transgeninę pelę, kurioje visiškai atkurta mutacija, vedanti į Diušeno raumenų distrofiją, o kitas etapas bus genų terapijos technologijų išbandymas. Tačiau žmonių genetinių ligų modelių kūrimas remiantis laboratoriniais gyvūnais nėra vienintelis galimas transgenų panaudojimas. Taigi Rusijoje ir Vakarų laboratorijose vyksta darbas biotechnologijų srityje, leidžiantis gauti farmacijos pramonei svarbius vaistinius gyvūninės kilmės baltymus. Karvės ar ožkos gali veikti kaip augintojai, kuriuose gali būti keičiamas ląstelinis aparatas, gaminantis piene esančius baltymus. Iš pieno galima išskirti vaistinius baltymus, kurių negaunama chemiškai, bet natūralaus mechanizmo pagalba, kuris padidins vaisto veiksmingumą. Šiuo metu yra sukurtos technologijos vaistinių baltymų, tokių kaip žmogaus laktoferinas, prourokinazė, lizocimas, atrinas, antitrombinas ir kt., gamybai.
