UŽEIGA: 2b alfa interferonas

Gamintojas: UAB „Sikor Biotech“

Anatominė-terapinė-cheminė klasifikacija: Alfa-2b interferonas

Registracijos numeris RK: Nr. RK-BP-5 Nr. 012842

Registracijos laikotarpis: 18.06.2014 - 18.06.2019

KNF (vaistai yra įtraukti į Kazachstano nacionalinį vaistų receptą)

ALO (įtraukta į nemokamų ambulatorinių vaistų tiekimo sąrašą)

UNIT (įtrauktas į vaistų sąrašą pagal garantuojamą medicininės priežiūros apimtį, kurią reikia įsigyti iš vieno platintojo)

Didžiausia pirkimo kaina Kazachstano Respublikoje: 33 116,64 KZT

Instrukcijos

Prekinis pavadinimas

Realdironas

Tarptautinis nepatentuotas pavadinimas

Alfa interferonas

Dozavimo forma

Liofilizuoti milteliai injekciniam tirpalui paruošti, 1 000 000 TV, 3 000 000 TV, 6 000 000 TV, 9 000 000 TV ir 18 000 000 TV

Kompozicija

Viename buteliuke yra

veiklioji medžiaga : žmogaus rekombi alfa-2b interferonas

1 milijonas TV, 3 milijonai TV, 6 milijonai TV, 18 milijonų TV

pagalbinės medžiagosdekstranas 60, natrio chloridas, dinatrio vandenilio fosfato dodekahidratas, natrio divandenilio fosfato dihidratas

apibūdinimas

Balti milteliai arba akyta masė

Farmakoterapinė grupė

Imunomoduliatoriai. Interferonai. Alfa interferonas

ATX kodas L03AB05

Farmakologinės savybės

Farmakokinetika

Maksimalios interferono alfa 2b koncentracijos atsiradimo laikas po injekcijos į raumenis yra 2 valandos ir trunka iki 12 valandų, po oda - 7,3 valandos, po 20 valandų vaistas neaptinkamas.

T1 / 2 (pusinės eliminacijos laikas) švirkščiant į raumenis yra apie 2–3 valandas. Biologinis prieinamumas yra 80%.

Vaistas tolygiai pasiskirsto po organus ir audinius. Jis biotransformuojamas inkstuose ir šiek tiek kepenyse. Iš dalies išsiskiria nepakitęs, daugiausia per inkstus.

Farmakodinamika

Alfa-2b interferonas yra labai išgrynintas baltymas, gaunamas naudojant rekombinantinę DNR. Molekulės polipeptido struktūra, biologinis aktyvumas ir farmakologinės savybės yra identiškos žmogaus leukocitų alfa-2b interferonui. Jis turi antivirusinį, antiproliferacinį, priešnavikinį ir imunomoduliuojantį poveikį.

Vaistas, sąveikaudamas su susijusiais ląstelės paviršiaus receptoriais, inicijuoja sudėtingą pokyčių grandinę ląstelėje. Manoma, kad šie procesai yra susiję su viruso replikacijos ląstelėje prevencija, ląstelių dauginimosi slopinimu ir imunomoduliuojančiu interferono poveikiu. Interferonas alfa-2b gali stimuliuoti makrofagų fagocitinį aktyvumą, taip pat T ląstelių ir NK (natūralių žudikų) citotoksinį aktyvumą. Šios interferono savybės yra atsakingos už gydomąjį vaisto poveikį.

Vartojimo indikacijos

Kaip kompleksinio suaugusiųjų gydymo dalis. Virusinės ligos

- lėtinis aktyvus hepatitas B, jei jo vartoti neįmanoma

pegiliuoti interferonai

- lėtinis hepatitas C, jei jo neįmanoma naudoti

pegiliuoti interferonai

Onkologinės ligos - plaukuotųjų ląstelių leukemija - lėtinė mieloidinė leukemija - inkstų vėžys - piktybinė melanoma.

Vartojimo būdas ir dozavimas

„Realdiron“ tirpalas vartojamas į raumenis arba po oda. Prieš vartojimą buteliuko turinys ištirpinamas 1 ml injekcinio vandens. Vaisto tirpalas turėtų būti skaidrus, be pašalinių intarpų. Sergant lėtiniu aktyviu hepatitu B, Realdiron skiriamas po 3 milijonus TV tris kartus per savaitę 6 mėnesius. Jei po gydymo per 3 mėnesius klinikinio, biocheminio HBsAg pagerėjimo ir (arba) išnykimo nepastebima, vaisto vartojimas nutraukiamas.

Sergant lėtiniu hepatitu C, „Realdiron“ skiriama 3 milijonus TV 3 kartus per savaitę 6 mėnesius. Jei pavartojus vaistą per mėnesį nuo gydymo, ALT aktyvumas kraujo plazmoje nesumažėja 50%, vaisto dozė padidinama iki 6 milijonų TV 3 kartus per savaitę. Jei po 3 mėnesių gydymo klinikinio, biocheminio pagerėjimo nėra, vaistą reikia atšaukti.

Sergant plaukuotųjų ląstelių leukemija, 2 mėnesius kasdien skiriama 3 milijonai TV; pasiekus hematologinę remisiją - 3 milijonai TV 3 kartus per savaitę.

Sergant lėtine mieloidine leukemija, pradinė 3 milijonų TV paros dozė skiriama į raumenis arba po oda. Gerai toleruojant, vaisto dozė kas savaitę didinama iki didžiausios 9 milijonų TV paros dozės. Kai baltųjų kraujo kūnelių skaičius stabilizuosis, šią dozę galima vartoti tris kartus per savaitę. Gydymo kursas atliekamas neribotą laiką, išskyrus tuos atvejus, kai gydymą reikia nutraukti (pavyzdžiui, greitai progresuojant ligai ar netoleruojant vaistų).

Inkstų vėžiui gydyti Realdiron skiriama po 3 milijonus TV kasdien 10 dienų. Gerai toleruojant, vaisto dozė kas savaitę didinama iki didžiausios 18 milijonų TV paros dozės. Po 3 mėnesių gydymo palaikomoji terapija pradedama nuo 18 milijonų TV tris kartus per savaitę 6 mėnesius.

Esant piktybinei melanomai, pradinė 3 milijonų TV dozė per parą vartojama į raumenis arba po oda. Gerai toleruojant, vaisto dozė kas savaitę didinama iki didžiausios 9-18 milijonų TV paros dozės. Pasiekę klinikinį efektą, 3 kartus per savaitę jie pereina prie palaikomojo gydymo 9-18 mln. TV. Adjuvantinis gydymas „Realdiron“ po chirurginio piktybinės I-II stadijos melanomos pašalinimo gali pailginti atkryčio laiką.

Šalutiniai poveikiai

dažnai

Karščiavimas, nuovargis, negalavimas, galvos skausmas, mialgija, šaltkrėtis, drebulys, į gripą panašūs simptomai

Anoreksija, pykinimas

ne taip dažnai

Skonio pokyčiai, stomatitas, burnos džiūvimas, dantų paviršiaus ir burnos gleivinės pažeidimas, vėmimas, viduriavimas, vidurių užkietėjimas, išmatos, pilvo skausmas

Alopecija, niežulys, sausa oda, bėrimas

Nugaros skausmas, raumenų ir kaulų skausmas, krūtinės skausmas, miozitas, artralgija

Depresija, mintys ir veiksmai apie savižudybę, savižudybė

Per didelis prakaitavimas, ypač naktį

Dirglumas, nemiga, mieguistumas, nerimas, susilpnėjusi koncentracija, emocinis labilumas, galvos svaigimas

Arterinė hipotenzija, hipertenzija

retai

Uždegimas, paraudimas, dirginimas injekcijos vietoje

Sujaudinimas, nervingumas, psichozė, įskaitant haliucinacijas, agresyvus elgesys, sujaudinimas, sutrikusi sąmonė, neuropatija, polineuropatija, periferinė neuropatija, parestezija, hipostezija, traukuliai, sąmonės praradimas

Virusinė infekcija, įskaitant paprastąją pūslelinę

Eritema

Konjunktyvitas, akių skausmas, neryškus matymas, tinklainės kraujosruvos, retinopatijos, židininiai tinklainės pokyčiai, tinklainės arterijos ar venos obstrukcija, sumažėjęs regėjimo aštrumas ar regėjimo lauko apribojimas, regos nervo uždegimas, regos diskų edema.

Ašarų liaukos disfunkcija

Kraujavimas iš nosies, nosies užgulimas, sinusitas, rinitas

Migrena

Kosulys, faringitas, plaučių infiltratai, plaučių uždegimas, dusulys, kvėpavimo sutrikimai

Svorio metimas

Tachikardija, širdies plakimas

Sumažėjęs libido, mėnesinių sutrikimai (amenorėja, menoragija)

Padidėjęs apetitas, glositas, dantenų kraujavimas

Rabdomiolizė (kartais sunki)

Klausos sutrikimas ar praradimas

Veido edema, inkstų funkcijos sutrikimas, nefrozinis sindromas, inkstų

nesėkmė, hiperurikemija

Hipertirozė ir hipotirozė, toksinis poveikis kepenims (įskaitant mirtinus atvejus)

Leukopenija

Dantų ir periodonto sutrikimai (įskaitant tuos, dėl kurių netenkama dantų)

retai

Padidėjęs apetitas, cukrinis diabetas, hiperglikemija, hipertrigliceridemija, kolitas, hepatomegalija, pankreatitas

Smegenų kraujagyslių išemija, smegenų kraujagyslių kraujavimai

Sarkoidozė arba sarkoidozės paūmėjimas

Alerginės reakcijos, daugiaformė eritema, Stivenso ir Džonsono sindromas, toksinė epidermio nekrolizė

Trombocitopenija, limfocitopenija, aplastinė anemija

Limfadenopatija

Mieguistumas

Injekcijos vietos nekrozė

Autoimuniniai ir imuninės sistemos sutrikimai, įskaitant idiopatinė trombocitopeninė purpura, reumatoidinis artritas, sisteminė raudonoji vilkligė, vaskulitas ir Vogt-Kayanagi-Harada sindromas

Triukšmas ausyse

Miokardo infarktas, aritmija (dažniausiai pacientams, kuriems anksčiau buvo širdies ir kraujagyslių ligų ar anksčiau buvo gydomi kardiotoksiniais vaistais), grįžtama laikina kardiomiopatija (pastebėta pacientams, kuriems anksčiau nebuvo širdies ir kraujagyslių sistemos)

Plaučių uždegimas

retai (vartojant monoterapiją arba kartu su ribavirinu)

Visiška raudonųjų kaulų čiulpų aplazija

Laboratorinių parametrų pokyčiai (dažniau pastebimi skiriant vaistą

daugiau kaip 10 milijonų TV per parą): sumažėjęs granulocitų skaičius,

sumažėjęs hemoglobino kiekis, padidėjęs ALT, AST aktyvumas (pastebėtas vartojant visoms indikacijoms, išskyrus lėtinį virusinį hepatitą), ALP, LDH, serumo kreatinino ir karbamido azoto

Vaikams, įskaitant kombinuotą gydymą ribavirinu (≥ 1% pacientų, vartojančių kombinuotą gydymą ribavirinu)

dažnai

Anemija, neutropenija

Hipotireozė

Depresija, emocinis labilumas, nemiga, dirglumas, galvos skausmas, galvos svaigimas

Anoreksija, pykinimas, vėmimas, pilvo skausmas, viduriavimas

Alopecija, bėrimas

Artralgija, mialgija

Uždegiminės reakcijos injekcijos vietoje: skausmas, hiperemija

Silpnumas, karščiavimas, šaltkrėtis, į gripą panašūs simptomai, negalavimas, virusinė infekcija, faringitas

Fizinis vystymasis vėluoja (sulėtėjęs augimas ir (arba) kūno svoris, palyginti su amžiumi)

dažnai

Blyškumas

Nosies kraujavimas

Bakterinė infekcija, pneumonija, grybelinė infekcija, paprastoji pūslelinė

Neoplazmos, neklasifikuojamos

Trombocitopenija, limfadenopatija

Hipertirozė, virilizmas

Hipertrigliceridemija, hiperurikemija

Sujaudinimas, drebulys, mieguistumas, agresyvi reakcija, nerimas, apatija, nervingumas, elgesio sutrikimai, somnambulizmas, mintys apie savižudybę, sumišimas, nenormalūs sapnai, miego sutrikimas, hiperkinezija, disfonija, parestezija, hiperestezija, hipostezija, sumažėjusi dėmesio koncentracija

Konjunktyvitas, akių skausmas, neryškus matymas, ašarų liaukų disfunkcija

Raynaudo liga

Kosulys, dusulys, vidurinės ausies uždegimas, nosies užgulimas, nosies gleivinės dirginimas, rinorėja, čiaudulys, tachipnėja

Virškinimo trakto sutrikimai, padidėjęs apetitas, vidurių užkietėjimas, laisvi išmatos, tiesiosios žarnos sutrikimai, dispepsija, gastroezofaginis refliuksas, gastroenteritas, glositas, stomatitas, įsk. opinis, dantų skausmas, kepenų funkcijos sutrikimas

Skausmas krūtinėje, dešiniajame viršutiniame pilvo kvadrante

Spuogai, egzema, nagų pokyčiai, sausa oda, odos įtrūkimai, padidėjusio jautrumo šviesai reakcijos, makulopapulinis bėrimas, odos pigmentacijos pokyčiai, eritema, prakaitavimas, hematoma, niežulys.

Šlapimo takų infekcijos, šlapinimosi sutrikimai, enurezė

Menstruacijų pažeidimai, amenorėja, menoragija, makšties sutrikimai, vaginitas, skausmas sėklidės srityje (berniukams)

Kontraindikacijos

Padidėjęs jautrumas veikliajai arba bet kuriai pagalbinei medžiagai

Sunkios širdies ligos, įskaitant nekontroliuojamus širdies sutrikimus, neseniai įvykusį miokardo infarktą, sunkias širdies aritmijas.

Sunki inkstų ar kepenų liga, įskaitant naviko metastazes jose, inkstų nepakankamumas, kai kreatinino klirensas yra mažesnis nei 50 ml / min., Vartojant kartu su ribavirinu

Dekompensuota kepenų cirozė

Lėtinis hepatitas su sunkia ciroze ar kepenų nepakankamumu

Lėtinis hepatitas, anksčiau gydytas imunosupresantais arba gliukokortikosteroidais

Autoimuninės ligos, įskaitant esamas ar anksčiau buvęs autoimuninis hepatitas

Skydliaukės sutrikimai, kurių nekontroliuoja standartinis gydymas

Ankstesnė psichikos ar medicinos istorija vaikams ir paaugliams

Vaikai iki 3 metų, sergantys lėtiniu hepatitu C

Nėštumas ir žindymo laikotarpis vartojant kartu su ribavirinu

Skiriant kartu su ribavirinu, taip pat reikia atsižvelgti į kontraindikacijas, nurodytas ribavirino vartojimo instrukcijose.

Vaistų sąveika

Alfa interferonas slopina mikrosominius kepenų fermentus (citochromą P-450), todėl gali sutrikdyti daugelio vaistų (teofilino ir kt.) Metabolizmą, padidindamas jų koncentraciją kraujyje.

Atsižvelgiant į centrinės nervų sistemos nepageidaujamų reakcijų riziką, kartu su alfa interferonu ypač atsargiai reikia vartoti narkotikus, migdomuosius ir raminamuosius vaistus.

Vaistų sąveika tarp „Realdiron“ ir kitų vaistų nebuvo iki galo ištirta. „Realdiron“ reikia vartoti atsargiai kartu su vaistais, kurie gali turėti mielosupresinį poveikį.

Kartu vartojant „Realdiron“ ir zidovudiną, gali būti pastebimas sinergetinis poveikis leukocitų skaičiaus sumažėjimui. Tokį gydymą vartojusiems pacientams nuo dozės priklausomi neutropenijos atvejai buvo dažnesni, nei tikėtasi monoterapijos metu zidovudinu. Pacientams, kurie kartu su ribavirinu ar zidovudinu vartoja „Realdiron“, padidėja anemijos rizika.

Realdiron vartojimo kartu su antiretrovirusiniais vaistais poveikis nežinomas.

Interferonai gali paveikti oksidacinius metabolinius procesus. Į tai reikia atsižvelgti vartojant kartu su oksidacijos būdu metabolizuojamais vaistais (įskaitant ksantino darinius - aminofiliną ir teofiliną). Kartu su teofilinu vartojant „Realdiron“, būtina kontroliuoti pastarojo koncentraciją kraujo serume ir, jei reikia, pakoreguoti dozavimo režimą.

Farmakologinė sąveika

Realdiron negalima maišyti su kitomis vaistinėmis medžiagomis, išskyrus 0,9% natrio chlorido tirpalą.

Specialios instrukcijos

Hepatitas B

Prieš pradedant gydymą pacientams, sergantiems hepatitu B, rekomenduojama atlikti kepenų biopsiją, siekiant patvirtinti lėtinį hepatitą ir nustatyti pažeidimo mastą, taip pat įsitikinti, kad šiuo metu nėra ir nėra buvusi encefalopatija, kraujavimas iš stemplės varikozės, ascito ar kitų klinikinių dekompensacijos požymių.

Prieš pradėdami gydymą „Realdiron“, turite sutelkti dėmesį į šiuos rodiklius:

bilirubino norma

protrombino laiko suaugusieji - pailgėja ne ilgiau kaip 3 sekundes

vaikai - pailgėja ne ilgiau kaip 2 sekundes

leukocitų ≥ 4000 / mm3

trombocitai suaugę ≥ 100 000 / mm3

vaikai ≥ 150 000 / mm3

Hepatitas C

Optimalus gydymo būdas yra kombinuotas gydymas ribavirinu. Monoterapija su „Realdiron“ daugiausia atliekama esant netolerancijai arba esant kontraindikacijoms vartoti ribaviriną.

Kai vartojate „Realdiron“ kaip kompleksinio gydymo su ribavirinu nuo lėtinio hepatito C dalį, taip pat perskaitykite ribavirino medicininio naudojimo instrukcijas.

Kepenų biopsija rekomenduojama visiems pacientams, sergantiems lėtiniu hepatitu C, tačiau tam tikrais atvejais (pavyzdžiui, pacientams, sergantiems 2 ir 3 virusų genotipais) gydymas galimas be histologinio patvirtinimo.

Suaugusieji. Prieš pradedant gydymą „Realdiron“, būtina įsitikinti, kad nėra encefalopatijos, kraujavimo iš stemplės venų išsiplėtimo, ascito ar kitų klinikinių dekompensacijos požymių, anamnezėje, sutelkiant dėmesį į šiuos rodiklius:

bilirubinas ≤ 2 mg / dL

albuminas stabilus ir normos ribose

protrombino laikas suaugusiems pailgėja ne daugiau kaip 3 sekundėmis, vaikams - 2 sekundėmis

leukocitų ≥ 3000 / mm3

trombocitų ≥ 70 000 / mm3

kreatinino koncentracija serume yra normali arba beveik normali

Vartojant Realdiron kartu su ribavirinu pacientams, kurių inkstų funkcija sutrikusi (kreatinino klirensas\u003e 50 ml / min.), Reikia stebėti bendrą kraujo kiekį, kreatinino kiekį kraujyje ir šlapime, atsižvelgiant į anemijos galimybę. Vyresniems nei 50 metų pacientams šis stebėjimas turėtų būti atliekamas kartą per savaitę.

Monoterapija.

Gydant „Realdiron“, gali būti sutrikusi skydliaukės veikla - hipotirozė ar hipertirozė. Prieš pradėdami vartoti „Realdiron“, turite nustatyti skydliaukę stimuliuojančio hormono (TSH) kiekį kraujo serume ir atlikti skydliaukės ultragarsą. Jei nustatoma kokių nors anomalijų, reikia atlikti tinkamą gydymą.

Paraiška bendrai užsikrėsti ŽIV ir hepatito C virusu

Pacientams, kurie yra papildomai užsikrėtę ŽIV ir kuriems taikoma labai aktyvi antiretrovirusinė terapija (HAART), gali padidėti pieno rūgšties acidozės rizika. Pridedant gydymą Realdiron ir ribavirinu prie HAART, reikia būti atsargiems.

Ciroze sergantiems pacientams, kurie yra papildomai užsikrėtę ŽIV ir hepatito C virusu ir kurie gauna HAART, gali padidėti kepenų dekompensacijos ir mirties rizika.

Papildomas alfa interferonų naudojimas atskirai arba kartu su ribavirinu padidina minėtą riziką šios kategorijos pacientams.

Dantų ir periodonto sutrikimai

Laboratoriniai tyrimai

Prieš pradedant gydymą „Realdiron“ ir periodiškai gydymo metu, visi pacientai stebimi dėl periferinio kraujo (nustatant leukocitų formulę ir trombocitų skaičių), kraujo biocheminių parametrų (nustatant elektrolitų, kepenų fermentų, įskaitant ALT, bilirubino, bendro baltymo ir frakcijos, įskaitant albuminą ir kreatininą). Prieš pradedant gydymą „Realdiron“ ir jo metu kraujo kiekis turi būti normalus.

Gydant pacientus, sergančius lėtiniu hepatitu, rekomenduojama tokia laboratorinių parametrų stebėjimo schema: 1, 2, 4, 8, 12, 16 savaičių, o po to kartą per mėnesį, per visą gydymo kursą. Jei ALT padidėja iki dvigubai ar daugiau, nei buvo prieš pradedant gydymą, gydymą Realdiron galima tęsti, išskyrus atvejus, kai pasireiškia kepenų nepakankamumo požymiai. Tokiu atveju ALT, protrombino laiką, šarminę fosfatazę, albuminą ir bilirubiną reikia nustatyti kas 2 savaites.

Pacientams, sergantiems piktybine melanoma, kepenų funkcija ir leukocitų skaičius (pagal formulę) turi būti stebimi kas savaitę remisijos indukcijos metu ir kas mėnesį - palaikomojo gydymo metu.

Skubus padidėjęs jautrumas

Dėl trumpalaikio odos bėrimo gydymo nutraukti nereikia.

Lydinčios ligos

„Realdiron“ atsargiai skiriamas pacientams, kuriems anksčiau buvo sunkių lėtinių ligų: lėtinė obstrukcinė plaučių liga, cukrinis diabetas, linkęs į ketoacidozę. Ypač atsargiai reikia vartoti vaistą pacientams, turintiems kraujavimo sutrikimų

(tromboflebitas, plaučių embolija) arba su sunkia mielosupresija.

Vienalaikė chemoterapija

„Realdiron“ vartojimas kartu su kitais chemoterapiniais vaistais (pavyzdžiui, citarabinu, ciklofosfamidu, doksorubicinu, tenipozidu) padidina toksinio poveikio riziką (jų sunkumą ir trukmę), kuris dėl bendro vartojimo gali kelti pavojų gyvybei arba sukelti mirtį. Dėl padidėjusio toksiškumo rizikos reikia atidžiai pasirinkti Realdiron ir kartu vartojamų chemoterapinių vaistų dozę.

Autoantikūnai ir autoimuninės ligos

Gydymas „Realdiron“ gali sukelti autoantikūnų atsiradimą ir autoimuninių ligų vystymąsi. Pacientai, turintys paveldimą polinkį ar įtariantys autoimuninių ligų simptomų atsiradimą, turėtų būti nuolat stebimi, ar jie anksti diagnozuojami. Jei įtariamas Vogt-Koyanagi-Harada sindromas pacientams, sergantiems lėtiniu hepatitu C, antivirusinį gydymą reikia nutraukti ir aptarti kortikosteroidų vartojimo poreikį.

Karščiavimas

Karščiavimas gali būti į gripą panašaus sindromo, kuris būdingas gydant interferonu, pasireiškimas, tačiau reikėtų atmesti kitas priežastis.

Norint sumažinti kūno temperatūrą ir sumažinti galvos skausmą su į gripą panašiu sindromu, kuris gali atsirasti gydant Realdiron, rekomenduojama naudoti karščiavimą mažinančią terapiją.

Paraiška sutrikus kepenų funkcijai

Mirtingi atvejai dėl toksinio hepatito buvo reti. Jei vartojant Realdiron atsiranda kepenų funkcijos sutrikimo požymių, pacientą reikia atidžiai stebėti ir, progresuojant simptomams, vaisto vartojimą reikia nutraukti.

Pacientams, sergantiems lėtiniu hepatitu B, kuriems yra susilpnėjusi sintetinė kepenų funkcija (pvz., Sumažėjęs albumino kiekis arba ilgesnis protrombino laikas), bet kurie atitinka tinkamumo kriterijus pradėti gydymą, gali padidėti klinikinės dekompensacijos rizika, jei gydymo metu padidėja aminotransferazių kiekis. Prieš gydant tokius pacientus, būtina nustatyti „Realdiron“ vartojimo pranašumus prieš galimą riziką.

Alografų atmetimas

Pirminiai duomenys rodo, kad gydymas alfa interferonu gali padidinti inkstų transplantato atmetimo riziką. Taip pat buvo pranešta apie kepenų transplantacijos atmetimą, nors priežastinis ryšys su gydymu alfa interferonu nebuvo nustatytas.

Drėkinimas

Gydant „Realdiron“, būtina užtikrinti tinkamą kūno hidrataciją, nes kai kuriais atvejais buvo pastebėta dehidracijos sukelta arterinė hipotenzija (dėl kurios gali reikėti papildomai skirti skysčių).

Širdies ir kraujagyslių sistema

Pacientams, kuriems anksčiau buvo širdies ir kraujagyslių ligų (lėtinis širdies nepakankamumas, miokardo infarktas ir (arba) aritmija), reikia skirti rūpestingą medicininę priežiūrą skiriant „Realdiron“. Pranešta apie pavienius kardiomiopatijos atvejus, kurie kartais gali būti grįžtami nutraukus gydymą „Realdiron“. Pacientams, kuriems yra buvę širdies ligų, patariama atlikti

EKG prieš gydymą „Realdiron“ ir jo metu. Aritmijos, daugiausia supraventrikulinės, pasireiškė retai ir daugiausia pacientams, kuriems anksčiau buvo širdies ir kraujagyslių ligų arba kurie anksčiau buvo gydomi kardiotoksiniais vaistais. Tokie ritmo sutrikimai paprastai reaguoja į įprastą gydymą, tačiau gali prireikti keisti dozę arba nutraukti „Realdiron“ vartojimą.

Kvėpavimo sistema

Bet kuris pacientas, turintis karščiavimą, kosulį, dusulį ar kitus kvėpavimo takų simptomus, turi atlikti krūtinės ląstos rentgenogramą. Aptikus infiltratų ar pažeidus plaučių funkciją, būtina atidžiai stebėti pacientą ir, jei reikia, nutraukti gydymą „Realdiron“. Tokie pokyčiai dažniau pasireiškė pacientams, sergantiems lėtiniu hepatitu C, kuriems buvo taikoma alfa interferono terapija, tačiau buvo pranešimų apie jų vystymosi atvejus vėžiu sergantiems pacientams, kurie taip pat buvo gydomi alfa interferonu. Laiku nutraukus gydymą alfa interferonu ir vartojant kortikosteroidus, išnyksta nepageidaujamos plaučių reakcijos. Be to, pranešta apie dažnesnius šių simptomų pasireiškimus vartojant Shosaikoto (kinų augalinį vaistą) kartu su alfa interferonu.

Psichikos sutrikimai ir centrinė nervų sistema (CNS). Kai kuriems pacientams gydymo Realdiron metu ir net pasibaigus, dažniausiai 6 mėnesius, buvo pastebėta rimtų centrinės nervų sistemos sutrikimų, ypač depresijos, minčių apie savižudybę ir bandymų nusižudyti. Vaikams ir paaugliams, kurie vartojo Realdiron kartu su ribavirinu, mintys apie savižudybę ir bandymai nusižudyti buvo pastebėti dažniau, palyginti su suaugusiais pacientais (2,4%, palyginti su 1%). Suaugusiems pacientams, vaikams ir paaugliams taip pat buvo stebimi kiti psichiniai sutrikimai, pavyzdžiui, depresija, emocinis labilumas ir mieguistumas. Kai atsiranda šie simptomai, reikia atsižvelgti į galimą šių nepageidaujamų reiškinių sunkumą. Jei simptomai išlieka ar pablogėja, arba atsiranda minčių apie savižudybę ar agresyvaus elgesio, rekomenduojama nutraukti gydymą ir suteikti pacientui tinkamą psichiatrinę priežiūrą.

Pacientai, turintys psichikos ar psichikos sveikatos problemų. Interferono alfa-2b negalima vartoti vaikams ir paaugliams, turintiems psichikos sutrikimų ar turėjusiems sutrikimų anamnezėje (žr. Skyrių „Kontraindikacijos“).

Jei buvo nuspręsta, kad gydymas Realdiron yra būtinas suaugusiems pacientams, turintiems psichikos sutrikimų ar istorinių sutrikimų, taip pat turintiems priklausomybę nuo alkoholio ir narkotikų, jis turėtų būti pradėtas tik nustačius tinkamą individualią diagnozę ir nuolat stebint psichinę būklę.

Gydymas interferonu gali sustiprinti psichinių sutrikimų simptomus pacientams, infekuotiems hepatito C virusu, turintiems esamų ar buvusių psichinių sutrikimų, taip pat priklausomybei nuo alkoholio ir narkotikų. Jei pacientams, sergantiems tokiais sutrikimais, būtina gydyti interferonu, tada, norint sėkmingai gydyti interferoną, reikia tinkamai gydyti psichinius simptomus. Be to, privaloma reikalauti individualaus paciento elgesio ir psichinių sutrikimų simptomų tikrinimo. Šiems pacientams rekomenduojama atlikti išankstinį gydymą prieš prasidedant ar pasireiškiant psichiniams simptomams.

Oftalmologiniai sutrikimai

Prieš pradedant gydymą, visi pacientai turi būti ištirti oftalmologiškai. Nutraukę gydymą Realdiron, nutraukite naujų akių ligų paūmėjimą ar pablogėjimą.

Skydliaukės pokyčiai

Esant sutrikusiai skydliaukės funkcijai, gydymą Realdiron galima pradėti arba tęsti, jei gydantis vaistais galima palaikyti normalų TSH kiekį. Nutraukus „Realdiron“ vartojimą, skydliaukės veikla normalizuojasi, o gydymo metu jos sutrinka.

Metaboliniai sutrikimai

Dėl hipertrigliceridemijos išsivystymo ar progresavimo iki sunkių formų rekomenduojama kontroliuoti lipidų kiekį kraujyje.

Kiti

Atsižvelgiant į aprašytus psoriazės ir sarkoidozės paūmėjimo atvejus gydymo interferonu alfa metu, „Realdiron“ tokiems pacientams vartoti galima tik tuo atveju, jei laukiama nauda viršija galimą riziką.

Taikymas pediatrijoje

Sprendimas pradėti kombinuotą terapiją vaikams turėtų būti priimamas individualiai, atsižvelgiant tiek į ligos progresavimo požymius (kepenų uždegiminio proceso aktyvumą ir fibrozę), tiek į virusologinio atsako, HCV genotipo ir viruso krūvio prognostinius veiksnius. Svarbu nepamiršti, kad kombinuotas gydymas gali sukelti sulėtėjusį augimą, svorio augimą kai kuriems vaikams, kurie buvo gydomi vienerius metus, o jų grįžtamumas nėra visiškai suprantamas. Atsižvelgiant į tai, terapijos metu ir 6 mėnesius po gydymo rekomenduojama stebėti fizinį vaikų vystymąsi.

Jei norite sumažinti lėto augimo riziką, jei įmanoma, vaikas turėtų būti gydomas greitai išaugus brendimo metu. Duomenų apie ilgalaikio gydymo poveikį brendimui nėra.

Poveikis reprodukcinei funkcijai

Buvo pranešta apie estradiolio ir progesterono koncentracijos sumažėjimą Realdiron vartojančių moterų serume. Todėl „Realdiron“ gali būti naudojamos reprodukcinio amžiaus moterims, jei jos vartoja veiksmingą kontracepcijos metodą per visą gydymo laikotarpį. Realdironas taip pat atsargiai naudojamas reprodukcinio amžiaus vyrams.

Nėštumas ir žindymo laikotarpis

Nėra pakankamai duomenų apie „Realdiron“ vartojimą nėštumo metu. Realdiron nėštumo metu reikia vartoti, jei galima nauda motinai nusveria galimą pavojų vaisiui.

Dėl galimo neigiamo poveikio kūdikiui, sprendimas nutraukti žindymą ar nutraukti vaisto vartojimą turėtų būti priimtas atsižvelgiant į motinos šios terapijos poreikio laipsnį.

Narkotiko įtakos gebėjimui vairuoti transporto priemonę ar galimai pavojingas mašinas ypatybės.

Gydymo metu būtina įspėti pacientą apie galimą silpnumo, mieguistumo, sutrikusio sąmonės vystymąsi ir rekomenduoti vengti vairuoti ar naudotis sudėtinga įranga.

Perdozavimas

Šiuo metu nėra pranešta apie narkotikų perdozavimo atvejus.

Perdozavus, skiriamas simptominis gydymas.

Šiame skyriuje pateikiama alfa 2b ir alfa 2a interferonų naudojimo instrukcijospirmoji karta, kuri dar vadinama linijine, paprasta ar trumpalaike. Vienintelis šių produktų pranašumas yra palyginti maža jų kaina.

Dar 1943 m. W. ir J. Heyle'iai atrado vadinamąjį trikdžių fenomeną. Pradinė interferono idėja buvo tokia: veiksnys, neleidžiantis daugintis virusams. 1957 m. Anglų mokslininkas Alikas Isaacsas ir šveicarų tyrinėtojas Jeanas Lindenmanas nustatė šį veiksnį, aiškiai jį apibūdino ir pavadino interferonu.

Interferonas (IFN) yra baltymo molekulė, kuri gaminama žmogaus organizme. Jos sintezės (interferono geno) „receptas“ yra užkoduotas žmogaus genetiniame aparate. Interferonas yra vienas iš citokinų, signalizuojančių molekulių, vaidinančių svarbų vaidmenį imuninės sistemos veikime.

Nuo to laiko, kai pusę amžiaus buvo rastas IFN, buvo ištirta dešimtys šio baltymo savybių. Medicininiu požiūriu pagrindinės yra antivirusinės ir priešnavikinės funkcijos.

Žmogaus kūnas gamina apie 20 rūšių - visą šeimą - interferonų. IFN yra suskirstyti į dvi rūšis: I ir II.

I tipo IFN - alfa, beta, omega, teta - gamina ir išskiria dauguma organizmo ląstelių, reaguodamos į virusus ir kai kuriuos kitus veiksnius. II tipo IFN apima gama interferoną, kurį gamina imuninės sistemos ląstelės, reaguodamos į pašalinių veiksnių poveikį.

Iš pradžių interferono preparatai buvo gaunami tik iš donoro kraujo ląstelių; jie buvo vadinami leukocitų interferonais. 1980 m. Prasidėjo rekombinantinių arba genetiškai modifikuotų interferonų era. Rekombinantinių vaistų gamyba tapo daug pigesnė nei panašių vaistų gamyba iš žmogaus donoro kraujo ar kitų biologinių žaliavų; jie nenaudoja paaukoto kraujo, kuris gali būti infekcijos šaltinis. Rekombinantiniuose vaistuose nėra pašalinių priemaišų, todėl jie turi mažiau šalutinių poveikių. Jų terapinis potencialas yra didesnis nei panašių natūralių preparatų.

Virusinėms ligoms, ypač hepatitui C, gydyti daugiausia naudojamas interferonas alfa (IFN-α). Atskirkite „paprastus“ („trumpalaikius“) alfa 2b ir alfa 2a interferonus ir pegilintus (alfa-2a peginterferonas ir alfa-2b peginterferonas). „Paprasti“ interferonai praktiškai nenaudojami ES ir JAV, tačiau mūsų šalyje dėl santykinai pigumo jie naudojami gana dažnai. Gydant hepatitą C, naudojamos abi „trumpojo“ IFN-α formos: alfa-2a-interferonas ir alfa-2b-interferonas (skiriasi viena aminorūgštimi). Injekcijos paprastais interferonais paprastai daromos kas antrą dieną (su peginterferonais - kartą per savaitę). Gydymo trumpalaikiais IFN, vartojamais kas antrą dieną, veiksmingumas yra mažesnis nei peginterferonų. Kai kurie ekspertai rekomenduoja kasdien sušvirkšti „paprastus“ IFN, nes AVT veiksmingumas yra šiek tiek didesnis.

„Trumpųjų“ IFN diapazonas yra gana platus. Juos gamina skirtingi gamintojai skirtingais pavadinimais: „Roferon-A“, „Intron A“, „Laferon“, „Reaferon-EC“, „Realdiron“, „Eberon“, „Interal“, „Altevir“, „Alfarona“ ir kiti.
Labiausiai ištirti (atitinkamai - brangūs) yra „Roferon-A“ ir „Intron-A“. Gydymo IFN duomenimis kartu su ribavirinu efektyvumas, priklausomai nuo viruso genotipo ir kitų veiksnių, svyruoja nuo 30% iki 60%. Pagrindinių paprastų interferonų gamintojų prekės ženklų sąrašas ir jų aprašymas pateikiami lentelėje.

Visi interferonai turi būti laikomi šaldytuve (nuo +2 iki +8 laipsnių Celsijaus). Jie neturi būti šildomi ar užšaldyti. Nekratykite ir nelaikykite vaisto tiesioginių saulės spindulių. Būtina gabenti narkotikus specialiuose konteineriuose.

Išradimas susijęs su genų inžinerija, biotechnologijomis, medicina, farmakologija. Nauja rekombinantinė daugiakopija plazmidės DNR pSX50, koduojanti žmogaus leukocitų alfa-2b interferono, kurio ekspresiją kontroliuoja laktozės ir triptofano promotoriai ir transkripcijos terminatorius, sintezę. Transformavus recipiento E. coli BL21 padermės ląsteles rekombinantine plazmidės DNR pSX50, buvo gauta E. coli SX50 padermė - rekombinantinio žmogaus leukocitų alfa-2b interferono gamintojas, kurio produktyvumas buvo iki 0,9–1,0 g alfa-2b interferono iš 1 litro kultūrinės terpės. Rekombinantinio alfa-2b-interferono gamybos būdas pagrįstas sukurto rekombinantinio E. coli SX50 štamo panaudojimu ir numatant jo gilų auginimą maistinėje terpėje su sumažintu triptofano kiekiu, nuolat biosintezės metu pridedant maistinių substratų, mechaniškai sunaikinant mikroorganizmo ląsteles esant aukštam slėgiui, agreguoto baltymo ištirpinimą koncentruotas guanidino hidrochlorido tirpalas, po kurio internautas renatuiruojamas fiziologiniuose buferiniuose tirpaluose, esant chaotropiniams agentams, ir jo gryninimas naudojant trijų pakopų chromatografinį interferono gryninimą ant dervų, tokių kaip chelatinis Sepharose Fast Flow, imobilizuotas Cu +2 jonais, jonų mainų chromatografija ant jonų mainų dervų, tokių kaip CM Flow ir Seph gelis. filtravimo chromatografija ant „Superdex 75“ tipo dervų. Metodas leidžia gauti daugiau kaip 99% grynumo interferono pagal elektroforezės duomenis redukuojančiomis ir nesumažinančiomis sąlygomis. dažant gelius sidabru ir daugiau kaip 98% pagal RF HPLC ir be pirogenų (LAL testas) ne mažiau kaip 400–800 mg kiekiais iš 1 litro kultūrinės terpės. 3 n. ir 3 c.p f-kristalai, 6 sergantys.

RF patento 2242516 brėžiniai

Išradimas susijęs su genetiškai modifikuotais vaistais, gautais naudojant biotechnologijas, būtent su rekombinantinio žmogaus leukocitų alfa-2b interferono (toliau - interferonas) pramoninės gamybos metodais, taip pat su rekombinantiniais štamais, gaminančiais Escherichia coli (E. coli) ir plazmidės DNR, koduojantis interferono sintezę.

Interferonai yra baltymų molekulės, kurių molekulinė masė yra nuo 15 000 iki 21 000 daltonų, kurias gamina ir išskiria ląstelės, reaguodamos į virusinę infekciją ar kitus patogenus. Yra trys pagrindinės interferonų grupės: alfa, beta ir gama. Pačios šios grupės nėra vienalytės ir jose gali būti keletas skirtingų molekulinių interferono rūšių. Taigi buvo nustatyta daugiau kaip 14 alfa-interferono genetinių veislių, kurios domina ir yra plačiai naudojamos medicinoje kaip antivirusiniai, antiproliferaciniai ir imunomoduliaciniai agentai.

Žinomi žmogaus leukocitų interferono iš žmogaus donoro kraujo leukocitų, sukeltų virusų ir kitų induktorių, gamybos būdai (SU1713591, RU 2066188, RU 2080873).

Pagrindinis šių interferonų gamybos būdų trūkumas yra galimo produkto užteršimo žmogaus virusais, tokiais kaip hepatito B ir C virusu, imunodeficito virusu ir kt., Tikimybė.

Šiuo metu interferono gavimo mikrobiologinės sintezės būdu metodas yra pripažintas perspektyvesniu, todėl iš santykinai nebrangios žaliavos galima gauti tikslinį produktą su žymiai didesniu derlingumu. Šiuo atveju naudojami metodai leidžia sukurti struktūrinio geno variantus, optimalius bakterijų ekspresijai, taip pat norminius elementus, kontroliuojančius jo raišką.

Kaip pradiniai mikroorganizmai naudojami įvairūs Pichia pastoris, Pseudomonas putida ir Escherichia coli kamienai.

Trūkumas naudojant P. pastoris kaip interferono gamintoją (JN Garcia, JA Aguiar ir kt. // Aukšto lygio žmogaus IFN-2b ekspresija Pichia pastoris. // Biotecnologia Aplicada, 12 (3), 152-155, 1995). yra ypač sunkios sąlygos tokio tipo mielėms fermentuoti, būtinumas biosintezės procese griežtai palaikyti induktoriaus, ypač metanolio, koncentraciją. Trūkumas naudojant Ps. putida (SU1364343, SU1640996, SU1591484, RU1616143, RU2142508) - tai fermentacijos proceso sudėtingumas esant žemam išraiškos lygiui (10 mg interferono 1 litrui kultūrinės terpės). Produktyvesnis yra Escherichia coli štamų naudojimas (Semin. Oncol., 1997, Iun; 24 (3 Suppl. 9): S9-41-S9-51).

Yra žinomas didelis skaičius plazmidžių ir jų pagrindu pagamintų E. coli padermių, kurios išreiškia interferoną: E. coli padermės ATCC 31633 ir 31644 su plazmidėmis Z-pBR322 (Psti) HclF-11-206 arba Z-pBR 322 (Pstl) / HclN SN 35. -AHL6 (SU 1764515), E. coli padermė pINF-AP2 (SU 1312961), E. coli padermė pINF-F-Pa (AU 1312962), E. coli SG 20050 padermė su plazmidė p280 / 21FN (Kravchenko V.V. et al., Bioorganic chemistry, 1987, v. 13, Nr. 9, p. 1186-1193), E. coli SG 20050 kamienas su plazmidė pINF14 (SU 1703691), E. coli SG 20050 kamienas su plazmidė pINF16 (RU 2054041) ir kitas Šių atmainų pagrindu sukurtų technologijų trūkumas yra jų nestabilumas, taip pat nepakankama interferono ekspresija.

Kartu su naudojamų padermių ypatybėmis proceso efektyvumas labai priklauso nuo technologijos, naudojamos interferono išskyrimui ir gryninimui.

Žinomas interferono gavimo būdas, įskaitant Ps ląstelių auginimą. putida, biomasės sunaikinimas, apdorojimas polietileniminu, frakcionavimas amonio sulfatu, hidrofobinė chromatografija ant fenilsilochromo C-80, lizato pH frakcija, jo koncentracija ir diafiltravimas, jonų mainų chromatografija ant celiuliozės DE-52, eliuavimas pH gradiente, jonų mainų tirpiklis ant celiuliozės -52, koncentracija, praleidžiant pro filtro kasetę ir filtruojant geliu Sephadex G-100 (SU 1640996). Šio metodo trūkumas, be sudėtingos daugiapakopės fermentacijos, yra daugiapakopis procesas gaunant galutinį produktą.

Taip pat žinomas interferono gavimo būdas, įskaitant E. coli padermės SG 20050 / pIF16 auginimą LB sultinyje kolbose termostatiniame purtiklyje, centrifuguojant biomasę, plaunant buferiniu tirpalu ir ultragarsu, kad būtų sunaikintos ląstelės. Gautas lizatas centrifuguojamas, plaunamas 3M karbamido tirpalu buferyje, ištirpinamas guanidino chlorido tirpale buferyje, ultragarsu apdorojamas, centrifuguojamas, oksidacinė sulfitolizė, dializė prieš 8 M karbamidą, renaturacija ir galutinė dviejų pakopų chromatografija naudojant CM-52 celiuliozę ir Sephadec G-50 ( RU 2054041). Šio metodo trūkumai yra santykinai mažas pagrindinių izoliavimo ir gryninimo etapų produktyvumas. Visų pirma tai taikoma gaminio apdorojimui ultragarsu, dializei ir oksidacinei sulfitolizei, kuri lemia interferono išeigos nestabilumą, taip pat tai, kad neįmanoma naudoti šio metodo pramoninėje interferono gamyboje.

Kaip artimiausią analogą (prototipą) galima nurodyti žmogaus leukocitų interferono gavimo būdą, kurį sudaro rekombinantinio E. coli kamieno auginimas, gautos biomasės užšaldymas ne aukštesnėje kaip -70 ° C temperatūroje, atitirpinimas, mikroorganizmo ląstelių sunaikinimas lizocimu, pašalinant DNR ir RNR. į DNazės lizatą ir izoliuotos netirpios interferono formos išvalymą plaunant buferiniu tirpalu su plovikliais, ištirpinant interferono nuosėdas guanidino hidrochlorido tirpale, renaturacija ir gryninimas vienpakopiu būdu naudojant jonų mainų chromatografiją. Kaip gamintojas naudojo E. coli SS5 padermę, gautą naudojant rekombinantinę plazmidę pSS5, turinčią tris promotorius: P lac, P t7 ir P trp ir interferono alfa geną su nukleotidų pakaitomis.

Interferono ekspresiją E. coli paderme SS5, turinčioje šią plazmidę, kontroliuoja trys promotoriai: P lac, P t7 ir P trp. Interferono ekspresijos lygis yra apie 800 mg 1 l ląstelių suspensijos (RU 2165455).

Šio metodo trūkumas yra nedidelis fermentinis mikroorganizmo ląstelių, DNR ir RNR sunaikinimo bei interferono vienpakopio chromatografinio gryninimo gamybos būdas. Tai sukelia interferono atpalaidavimo proceso nestabilumą, pablogina jo kokybę ir apriboja galimybę naudoti aukščiau pateiktą schemą pramoninei interferono gamybai. Šios plazmidės ir jos pagrindu naudojamos padermės trūkumai yra tai, kad plazmidėje naudojamas stiprus nereguliuojamas T7 fago promotorius E. coli BL21 (DE3) kamiene, kuriame T7 RNR polimerazės genas yra po lac operono promotoriumi ir kuris visada „teka“. Todėl ląstelėje nuolat vyksta interferono sintezė, kuri lemia plazmidės disociaciją ir padermės ląstelių gyvybingumo sumažėjimą, ir dėl to sumažėja interferono išeiga.

Šio išradimo tikslas yra sukurti rekombinantinį pramoninį E. coli gamintojo štamą, naudojant naują rekombinantinę plazmidės DNR, turinčią aukštą interferono biosintezės lygį, ir sukurti veiksmingą pramoninę technologiją medicininės interferono medžiagos, atitinkančios „Europos farmakopėją“, alfa-2b-interferono medžiagai, gaminti.

Ši užduotis buvo išspręsta sukūrus rekombinantinę plazmidės DNR pSX50 ir Escherichia coli SX50 padermę, deponuotą visos Rusijos Federacijos valstybinės vieningos įmonės „GosNII genetikos“ pramoninių padermių kolekcijoje, kurios numeris VKPM B-8550,

taip pat rekombinantinio alfa-2b-interferono gamybos būdas, pagrįstas rekombinantinio E. coli SX50 štamo panaudojimu ir numatantis jo auginimą povandeninėje mitybinėje terpėje su sumažintu triptofano kiekiu, nuolat pridedant maistinių medžiagų substratų biosintezės metu, mechaniškai sunaikinant mikroorganizmo ląsteles esant aukštam slėgiui, agreguotų medžiagų ištirpinimui. baltymai koncentruotame guanidino hidrochlorido tirpale, po to interferonas renatuiruojamas fiziologiniuose buferiniuose tirpaluose, esant chaotropiniams agentams, ir interferono trijų pakopų chromatografinis gryninimas chelatiniuose Sepharose Fast Flow tipo dervuose, imobilizuotuose Cu +2 jonais, jonų mainų chromatografija ant CM Flow tipo gelio ir CM Sephar jonų mainų dervų. chromatografija ant „Superdex 75“ dervų.

Pagal šį išradimą yra pateiktas naujas rekombinantinis daugiakopijos plazmidės DNR pSX50, koduojantis žmogaus leukocitų alfa-2b interferono sintezę, kurio ekspresiją kontroliuoja laktozės ir triptofano promotoriai ir transkripcijos terminatorius. PSX50 plazmidė turi 3218 bazinių porų (bp) ir pasižymi šiais fragmentais:

Seka nuo 1 nukleotido iki 176 nukleotido (nt) apima 176 bazės ilgio DNR fragmentą, kuriame yra triptofano promotorius (P trp);

Seka nuo 177 n. iki 194 N. apima sintetinį 18 bp DNR fragmentą, kuriame yra Shine Delgarno seka, atsakinga už vertimo inicijavimą;

Paveldėjimas nuo 195 m iki 695 N. apima 501 bp dydžio DNR fragmentą, kuriame yra interferono geno seka su tokiais nukleotidų pakeitimais: 37-oje padėtyje, pokytis iš A į C, 39-oje padėtyje, pakeitimas iš G į T, 40-oje padėtyje, pokytis iš A į C, 42-oje padėtyje, pokytis iš G į T , 67 padėtyje, A pakeitimą C, 69 pozicijoje, G pakeičiant T, 70 padėtyje, A pakeičiant C, 72 padėtyje, A pakeičiančią T, 96 pozicijoje, pakeičiančia G, A, 100 padėtyje, pakeičiančia A, C, c 102 padėtyje keiskite A į T, 114 pozicijoje keiskite A į C, 120 pozicijoje keiskite C į G, 126 pozicijoje keiskite G į A, 129 pozicijoje keiskite G į A, 330 pozicijoje keiskite C į G, 339 pozicijoje. G pakeitimas A, 342 padėtyje G pakeitimas A, 487 padėtyje, A pakeitimas C, 489 pozicijoje, A pakeitimas T, 495 padėtyje, G pakeitimas A;

Seka nuo 696 n. iki 713 N. apima sintetinį 18 bp dydžio DNR fragmentą, turintį sintetinį polilinkerį;

Seka nuo 714 n. iki 1138 m apima plazmidės pKK223-3 DNR fragmentą su 4129 nt. iki 4553 N. dydis - 425 bp, kuriame yra griežto transkripcijos terminatoriaus rrnBT1 T2 seka;

Seka nuo 1139 m iki 1229 m apima pUC19 plazmidės DNR fragmentą su 2487 nt. iki 2577 n. dydis 91 bp, kuriame yra geno β-laktomazės promotorius (geno atsparumas ampicilinui - Amp R);

Seka nuo 1230 m iki 2045 n. apima plazmidės pUC4K DNR fragmentą su 720 nt. iki 1535 m dydis 816 bp, kuriame yra kan geno struktūrinis regionas;

Seka nuo 2046 m. \u200b\u200bAD iki 3218 n. apima plazmidės pUC19 DNR fragmentą nuo 1625 iki 453 nt. dydis 1173 bp, turintis seką, atsakingą už plazmidės (ori) ir lac promotoriaus (P lac) replikaciją.

1-5 paveikslai rodo plazmidės pSX50 konstravimo schemas ir fizinį žemėlapį.

6 paveiksle parodyta visa plazmidės pSX50 nukleotidų seka.

Escherichia coli SX50 padermė buvo gauta transformuojant Escherichia coli BL21 ląsteles su pSX50 plazmidė, naudojant tradicinę genų inžinerijos technologiją. E. Coli SX50 kamienui būdingos šios savybės.

Kultūrinės ir morfologinės savybės

Ląstelės yra mažos, tiesios, sutirštintos lazdelės formos, gramneigiamos, nesportiškos. Ląstelės gerai auga paprastose maistinėse terpėse. Augant Difco agare, susidaro apvalios, lygios, išgaubtos, drumstos, blizgančios, pilkos kolonijos su lygiais kraštais. Augant skystoje terpėje (minimalioje terpėje su gliukoze arba LB sultinyje), jie suformuoja intensyvų, tolygų miglą.

Fizikiniai ir biologiniai požymiai

Aerobe. Augimo temperatūra yra 4–42 ° C, o optimalus pH yra 6,5–7,5.

Kaip azoto šaltinis naudojamos tiek mineralinės druskos amonio ir nitrato pavidalu, tiek organiniai junginiai amino rūgščių, peptono, triptono, mielių ekstrakto ir kt. Pavidalu.

Kaip anglies šaltinis naudojamos amino rūgštys, glicerinas, angliavandeniai. Atsparumas antibiotikams. Ląstelės pasižymi atsparumu kanamicinui (iki 100 μg / ml).

Escherichia coli 8X50 padermė yra interferono gamintoja.

Temperatūros laikymo būdas, sąlygos ir sudėtis

L-arape, pridedant kanamicino iki 20 μg / ml koncentracijos aliejuje, L-sultinyje, kuriame yra 15% glicerolio, ir atitinkamuose antibiotikuose ampulėse, esant minus 70 ° C temperatūrai, liofilizuotoje ampulėje, esant + 4 ° C temperatūrai.

„Escherichia coli SX50“ padermė „Bergi's Guide“ (1974) identifikuojama kaip Escherichia coli rūšies padermė.

Alfa-2b-interferono pramoninės gamybos būdas

Siūlomo metodo bruožas yra technologijos, leidžiančios atskirti interferoną nuo netirpios formos, kuri kaupiasi fermentacijos metu, sukūrimas, kuris gali žymiai supaprastinti proceso srauto schemą ir padidinti tikslinio produkto išeigą.

Metodas susideda iš Escherichia coli SX50 padermės kultivavimo mitybinėje terpėje, į biosintezės procesą nuolat pridedant maistinių substratų, geriausiai gliukozės ir mielių ekstrakto, geriau su sumažintu triptofano kiekiu, mechaniniu būdu sunaikinant mikroorganizmų ląsteles esant aukštam 700–900 barų slėgiui, interferono ištirpinimui buferyje. guanidino hidrochlorido tirpalas, regeneruojamas interferonas fiziologiniuose buferiniuose tirpaluose, esant chaotropiniams agentams, po to trifazis interferono gryninimas chromatografiškai atliekant chelatines Sepharose Fast Flow dervas, imobilizuotas Cu +2 jonais, jonų mainų chromatografija ant CM tipo gelio jonų mainų dervų. Sepharose Flow ir gelis Sepharose Flow filtras. dervos kaip „Superdex 75“.

Atskiroms interferono gavimo stadijoms yra optimalios sąlygos:

Fermentacija vykdoma nuolat pridedant substratų viso proceso metu, o tai lemia aukštą interferono ekspresijos lygį;

Ląstelės sunaikinamos Gaulino tipo dezintegratoriuje esant 900 barų slėgiui;

Tirpių ląstelių komponentų (DNR, RNR, baltymų, lipopolisaharidų ir kt.) Pašalinimas atliekamas netirpios formos interferono plovimu buferiniais tirpalais, kuriuose yra ploviklių (Triton XI00, karbamidas ir kt.);

Susidariusios nuosėdos su interferonu ištirpinamos buferiniame 6 M guanidino hidrochlorido tirpale;

Interferono atnaujinimas atliekamas fiziologiniame buferiniame tirpale, kuriame yra chaotropinių agentų;

Interferono trijų pakopų chromatografinis gryninimas atliekamas chelatiniuose Sepharose Fast Flow, imobilizuotuose Cu +2 jonais, CM Sepharose Fast Flow katijonų mainų dervoje ir gelio filtravimo chromatografijoje naudojant Superdex 75 tipo dervą;

Po kiekvieno chromatografinio gryninimo sterilizuojamas filtravimas per filtrus, kuriuose nėra pirogenų ir kurių porų dydis yra 0,22 μm.

Interferono išeiga, gauta naudojant aprašytą metodą, yra maždaug 400–800 mg interferono iš 1 litro kultūrinės terpės. Gauto produkto kokybė atitinka alfa-2b-interferono „Europos farmakopėjos“ standartus ir reikalavimus.

Esminiai siūlomo metodo ir prototipo skirtumai yra šie:

Panaudojimas didesnio produktyvumo kamieno konstrukto, kuris leidžia gauti didesnį interferono kiekį iš 1 litro kultūrinės terpės biosintezės metu;

Naudojamas efektyvus mechaninis ląstelių biomasės sunaikinimas, kuris leidžia per trumpesnį laiką gauti grynesnį netirpios formos interferono ekstraktą su mažesniais nuostoliais;

Naudojant fiziologinius buferinius tirpalus renaturacijos metu, esant chaotropiniams agentams, padidėja teisingai renatūruotos interferono formos išeiga;

Trijų pakopų chromatografinis interferono gryninimas leidžia gauti daugiau kaip 99% grynumo interferono medžiagą pagal elektroforezę redukuojančiomis ir nesumažinančiomis sąlygomis dažant gelius sidabru ir daugiau kaip 98% pagal RF HPLC ir praktiškai neturint pirogenų (LAL testas).

Tariamų išradimų grupės esmė ir pranašumai iliustruojami sekančiais pavyzdžiais.

1 pavyzdys. Rekombinantinės plazmidės pSX50 konstravimas

PSX50 plazmidės konstravimo būdas apima šiuos veiksmus:

Vektoriaus plazmidės pSX10 konstravimas;

1.pSX3 plazmidės (2641 bp) konstravimas

2.vektorinės plazmidės pSX10 (2553 bp) konstravimas

Rekombinantinės plazmidės pSX41 (3218 bp) konstravimas;

Rekombinantinės plazmidės pSX43 (3218 bp) konstravimas;

Rekombinantinės plazmidės pSX45 (3218 bp) konstravimas;

Rekombinantinės plazmidės pSX50 (3218 bp) konstravimas.

PSX10 vektoriaus plazmidės konstravimas

Vektorinė plazmidė pSX10 yra vektorius pUC19, kuriame beta-laktomazės geno, koduojančio atsparumą ampicilinui, kodavimo seka yra pakeista kan geno kodavimo seka ir joje yra transkripcijos terminatorius iš plazmidės pKK223-3.

Vektoriaus plazmidės pSS10 konstravimas vyksta dviem etapais:

Gauname pSX3 (2641 bp) plazmidę, kuri yra plazmidė pUC19, kurioje amp geno koduojanti sritis yra pakeista kan geno koduojančia sritimi;

Gauna vėjo plazmidę pSX10 (2553 bp), kuri yra plazmidė pSX3, kurioje DNR fragmentas, koduojantis transkripcijos terminatorių rBT1 T2, yra įterptas už BamHI vietos.

Norint gauti plazmidę pSX3, atliekami penki DNR amplifikavimo raida PGR (polimerazės grandininės reakcijos) metodai. Pirmojo turo metu, panaudojant pUC19 plazmidės DNR kaip šabloną, atliekama 1828 bp dydžio DNR fragmento amplifikacija. (fragmentas PU1-PU2), naudojant pradmenis:

Ši ir vėlesnės PGR reakcijos vykdomos šiomis sąlygomis: 20 mM Tis-HCl, pH 8,8, 10 mM (NH4) 2 SO 4, 10 mM KCl, 2 tM MgCl2, 0,1% Triton X100, 0,1 mg / ml BSA, 0,2. mM kiekvieno dNTP, 1,25 vienetų. Pfu DNR polimerazė, 100 ng DNR. Amplifikavimo procesą sudaro šie etapai: 5 minučių kaitinimas 95 ° С temperatūroje, 35 PGR ciklai (30 sek. 95 ° С, 30 sek. 56 ° С, 2 min. 72 ° С) ir inkubavimas 10 min., Esant 72 ° С. Po amplifikacijos (ir po vėlesnių amplifikacijų) DNR fragmentas išvalomas elektroforezės būdu 1% agarozės gelyje. Antrojo ir trečiojo raundų metu, naudojant šabloną pUC4K plazmidės DNR, atliekama 555 bp dydžio DNR fragmento amplifikacija. (fragmentas KM1-KM2), naudojant pradmenis:

ir 258 bp dydžio DNR fragmento amplifikacija. (KMZ-KM4) su gruntais

Penktame PGR etape fragmentai (PU1-PU2) ir (KM1-KM4) sujungiami šiomis sąlygomis: kaitinant 5 min. 95 ° C temperatūroje, 5 PGR ciklus (30 sek. 95 ° C, 30 sek. 56 ° C, 10 min. 72 °). C) ir inkubuojama 10 min 72 ° C temperatūroje. Po paskutinio PGR gauta DNR yra tiesiogiai transformuojama į E. coli DH5 padermės ląsteles ir pasėjama į LA terpę, kurioje yra 20 μg / ml kanamicino. Po 12 valandų inkubacijos 37 ° C temperatūroje, klonai išsijojami, išskiriama plazmidės DNR ir atliekama restrikcijos analizė. Dėl to gaunama 2641 bp dydžio plazmidė pSX3.

Norint gauti vektoriaus plazmidę pSX10, atliekami trys DNR amplifikavimo raida PGR metodu. Pirmojo turo metu, panaudojant pSX3 plazmidės DNR kaip šabloną, atliekama 2025 bp DNR fragmento amplifikacija. (fragmentas 10.1-10.2), naudojant pradmenis:

Antrojo etapo metu, naudojant šabloną plazmidės pKK223-3 DNR, atliekama 528 bp DNR fragmento amplifikacija. (fragmentas KK1-KK2), naudojant pradmenis:

Trečiajame PGR etape fragmentai (10.1-10.2) ir (KK1-KK2) sujungiami šiomis sąlygomis: kaitinant 5 minutes 95 ° C temperatūroje, 5 PGR ciklus (30 sek. 95 ° C, 30 sek. 56 ° C, 10 min. 72 °). C) ir inkubuojama 10 min 72 ° C temperatūroje. Po paskutinio PGR gauta DNR yra tiesiogiai transformuojama į E. coli DH5 padermės ląsteles ir pasėjama į LA terpę, kurioje yra 20 μg / ml kanamicino. Po 12 valandų inkubacijos 37 ° C temperatūroje, klonai išsijojami, išskiriama plazmidės DNR ir atliekama restrikcijos analizė. Dėl to gaunama 2553 bp plazmidė pSX10.

Rekombinantinės plazmidės pSX41 konstravimas

Rekombinantinė plazmidė pSX41 yra vektoriaus plazmidės pSX3 (2529 bp) Hind III - BamHI DNR fragmentas (2529 bp), Hind III - EcoRI - 168 bp dydžio DNR fragmentas, koduojantis E. coli triptofano operono promotorių (P trp), EcoRI-XbaI. sintetinis 20 bp DNR fragmentas, koduojantis SD seką (Shine-Delgarno), ir XbaI-BamHI 501 bp DNR fragmentas, koduojantis žmogaus interferono alfa 2b geną.

Norint gauti Hind III - BamHI, vektoriaus plazmidės pSX3 (2529 bp) DNR fragmentą, pSX3 plazmidės DNR yra apdorojama restrikcijos fermentais HindIII ir BamHI, po to elektroforetiškai gryninama 1% agarozės gelyje. 168 bp ilgio HindRI EcoRI DNR fragmentas, koduojantis triptofano operono promotorių (P trp), buvo gautas PCR metodu, naudojant šabloną suminę E. coli DNR ir pradmenis TRP1 bei PRP2, po to amplifikuoto fragmento apdorojimą restrikcijos fermentais Hindlll ir EcoRI:

Norint gauti „EcoRI-Xbal“ sintetinį 20 bp ilgio DNR fragmentą, koduojantį SD seką („Shine-Delgarno“), sintetinami šie komplementuojantys oligonukleotidai:

501 bp XbaI-BamIII DNR fragmentas, koduojantis žmogaus interferono alfa 2b geną, gaunamas PGR, naudojant šabloną bendrą žmogaus DNR ir pradmenis IFN1 ir IFN2, po to amplifikuoto fragmento apdorojimas restrikcijos fermentais Xbal ir BamIII:

Tada elektroforetiškai išgryninti fragmentai sujungiami, sujungiami su T4 fago ligazės fermentu, DNR paverčiama E. coli DH5 kamieno ląstelėmis ir pasodinama ant LA terpės, turinčios 20 μg / ml kanamicino. Po 12 valandų inkubacijos 37 ° C temperatūroje, klonai išsijojami, išskiriama plazmidinė DNR, atliekama restrikcijos analizė ir nustatoma pirminė DNR struktūra. Dėl to gaunama 3218 bp dydžio plazmidė pSX41. Toliau, siekiant padidinti tikslinio produkto ekspresijos lygį, vykdoma laipsniška interferono geno mutagenezė. Interferono geno mutagenezė susideda iš tripletų, retų E. coli, koduojančių atitinkamas aminorūgštis, pakeitimo tripletais, kurie dažnai randami E. coli, koduojant tas pačias aminorūgštis. Interferono geno DNR mutagenezė atliekama PGR metodu.

Rekombinantinės plazmidės pSX43 konstravimas

Norint gauti rekombinantinę plazmidę pSX43, atliekamas vienas DNR amplifikacijos raundas naudojant PGR, naudojant plazmidės pSX41 DNR kaip šabloną ir IFN3 bei IFN4 pradmenis:

PGR atliekama tokiomis sąlygomis: 5 minutes kaitinant 95 ° C temperatūroje, 20 PGR ciklų (30 sek. Esant 95 ° C, 30 s. 56 ° C, 10 min. 72 ° C) ir inkubuojant 20 min. 72 ° C temperatūroje. Po PGR gauta DNR tiesiogiai transformuojama į E. coli DH5 padermės ląsteles ir pasėjama į LA terpę, kurioje yra 20 μg / ml kanamicino. Po 12 valandų inkubacijos 37 ° C temperatūroje, klonai išsijojami, išskiriama plazmidės DNR, atliekama restrikcijos analizė ir nustatoma pirminė DNR struktūra. Dėl to gaunama pSX43 plazmidė, kurios dydis yra 3218 bp.

Rekombinantinės plazmidės pSX45 konstravimas

Norint gauti rekombinantinę plazmidę pSX45, atliekamas vienas DNR amplifikacijos turas naudojant PGR, naudojant plazmidės pSX43 DNR kaip šabloną ir IFN5 ir IFN6 pradmenis:

PGR atliekama tokiomis sąlygomis: 5 minutes kaitinant 95 ° C temperatūroje, 20 PGR ciklų (30 s 95 ° C, 30 s 56 ° C, 10 min. 72 ° C) ir inkubuojant 20 min. 72 ° C temperatūroje. Po PGR gauta DNR tiesiogiai transformuojama į E. coli DH5 padermės ląsteles ir pasėjama į LA terpę, kurioje yra 20 μg / ml kanamicino. Po 12 valandų inkubacijos 37 ° C temperatūroje, klonai išsijojami, išskiriama plazmidės DNR, atliekama restrikcijos analizė ir nustatoma pirminė DNR struktūra. Dėl to gaunama 3218 bp plazmidė pSX45.

Rekombinantinės plazmidės pSX50 konstravimas.

Norint gauti rekombinantinę plazmidę pSX50, atliekamas vienas DNR amplifikacijos raundas naudojant PGR, naudojant plazmidės pSX45 DNR kaip šabloną ir IFN7 bei IFN8 pradmenis:

PGR atliekama tokiomis sąlygomis: 5 minutes kaitinant 95 ° C temperatūroje, 20 PGR ciklų (30 s 95 ° C, 30 s 56 ° C, 10 min. 72 ° C) ir inkubuojant 20 min. 72 ° C temperatūroje. Po PGR gauta DNR tiesiogiai transformuojama į E. coli DH5 padermės ląsteles ir pasėjama į LA terpę, kurioje yra 20 μg / ml kanamicino. Po 12 valandų inkubacijos 37 ° C temperatūroje, klonai išsijojami, išskiriama plazmidės DNR, atliekama restrikcijos analizė ir nustatoma pirminė DNR struktūra. Dėl to gaunama 3218 bp plazmidė pSX50.

2 pavyzdys. E. coli SX50 padermės gavimas - interferono gamintojas

Padermė, gaminanti interferoną E. coli SX50, gaunama transformuojant E. coli BL21 padermės ląsteles rekombinantine plazmidė pSX50. Interferoną gaminantis štamas auginamas 30 l fermenteryje, kad optinis tankis būtų 25,0–30,0 o.u. M9 terpėje, kurioje yra 1% rūgšties kazeino hidrolizatas (Difco), 1% gliukozės, 40 μg / ml kanamicino, esant 38-39 ° C. Fermentacijos metu maistinis substratas nuolat pridedamas naudojant gravitometrinį valdiklį.

3 pavyzdys. Interferono išskyrimo iš E. coli SX50 padermės metodas

Interferonas buvo gaunamas 4 etapais:

1 etapas. E. coli SX50 padermės auginimas.

2 etapas. Netirpios interferono formos išskyrimas ir gryninimas.

3 etapas. Interferono ištirpinimas ir renaturacija.

4 etapas. Chromatografinis interferono gryninimas.

1 etapas. E. coli SX50 padermės auginimas

Išaugintas E. coli SX50 padermės inokuliatas 3 litrų turtingos LB terpės 12 valandų 26 ° C temperatūroje yra aseptiniu būdu įpilamas į fermentatorių, kuriame yra 27 litrai sterilios terpės, kurioje yra M9, \u200b\u200b1% kazeino rūgšties hidrolizatas, 1% gliukozės, 1 mM MgCl. 2, 0,1 mM CaCl2, 40 mg / ml kanamicino. Auginimas fermenteryje atliekamas 38–39 ° C temperatūroje, palaikant pH 7 ± 0,15, automatiškai titruojant 40% natrio hidroksido tirpalu. Ištirpusio deguonies koncentracija (50 ± 10)% soties intervale palaikoma keičiant maišiklio sukimosi greitį nuo 100 iki 800 aps / min, o oro tiekimą - nuo 1 iki 15 l / min. Substratų, ypač gliukozės ir mielių ekstrakto, koncentracija matuojama fermentacijos metu, o jų koncentracija palaikoma keičiant koncentruotų tirpalų pašarų greitį peristaltiniais siurbliais, naudojant gravimetrinį valdiklį.

Netirpaus interferono kaupimasis stebimas fazių kontrasto mikroskopu, 15% poliakrilamido gelio elektroforeze (SDS-PAAG) ir atvirkštinės fazės didelio efektyvumo chromatografija (RF HPLC). Fermentacija sustabdoma pasiekus maksimalų optinį tankį (~ 25–30 pu) ir sustabdžius interferono sintezę. Fermentacijos pabaigoje kultūrinis skystis yra atskiriamas centrifuguojant srautiniu rotoriu, kurio sukimosi greitis yra 5000–10000 aps / min. Biomasė supakuota į plastikinius maišelius ir užšaldyta esant minus 70 ° C temperatūrai.

2 etapas. Netirpios interferono formos išskyrimas ir gryninimas

300–400 g sušaldytos E. coli SX50 štamo biomasės yra suspenduojamos 3000 ml 1 buferio (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 0,1% Triton X100). Suspensija praleidžiama per Gaulino tipo pratekėjimo homogenizatorių, palaikoma 900 barų ir centrifuguojama pratekančiame rotoriuje esant 15 000 aps / min. Gautos nuosėdos panašiomis sąlygomis plaunamos paeiliui 2 (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 3 M karbamidas) ir 3 buferiu (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA), o galiausiai interferono nuosėdos suspenduojamos 200 ml. ml buferio 3. Šiuo atveju netirpios interferono formos išskyrimas ir gryninimas trunka ne ilgiau kaip 5 valandas.

3 etapas. Interferono ištirpinimas ir renaturacija

Į netirpios interferono formos suspensiją, gautą ankstesniame etape, įpilama sauso guanidino hidrochlorido iki 6 M koncentracijos, ditiotreitolio - iki 50 mM, Tris-HCl (pH 8,0) iki 50 mM, NaCl iki 150 mM, o Triton X100 iki 0,1%. kambario temperatūroje 2 val., netirpi medžiaga yra atskiriama sterilizuojant filtravimą per membranas, kurių porų skersmuo yra 0,22 mikrono.

Interferono pertvarkymas atliekamas lėtai praskiedžiant gautą tirpalą 100-200 kartų 4 buferiu (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 0,1 mM EDTA). Tada renaturacinis mišinys inkubuojamas nuolat maišant 12-15 valandų 4-8 ° C temperatūroje. Tada pridedama magnio sulfato iki 1 mM koncentracijos ir sujungta medžiaga pašalinama sterilizuojant filtruojant per membraninį filtrą, kurio porų skersmuo yra 0,22 mikrono.

4 etapas. Chromatografinis interferono gryninimas

Chromatografinis interferono gryninimas atliekamas trimis etapais.

1. Pirmame etape gautas renatūruotas interferonas išgryninamas afininės chromatografijos būdu, naudojant chelatinę Sepharose Fast Flow dervą (Amersham Biosciences), imobilizuotą Cu +2 jonais. Tuo tikslu interferono tirpalas užpilamas kolonėle, kurioje greitai kaupiasi Culate 2 Chelates Sepharose Fast Flow, ir interferonas išplaunamas 0,1 M citrinos rūgšties buferiu, pH 2,2.

2. Antrame chromatografinio gryninimo etape interferono tirpalas užpilamas CM Sepharose Fast Flow katijonų mainų derva (Amersham Biosciences), o interferonas išplaunamas tirpalų gradientu (0,0–0,5 M NaCl) 50 mM Na (CH 3 COO) buferiu, pH 5,5.

3. Interferono monomerinės formos gryninimas iš interferono polimerinių formų liekanų atliekamas trečiame interferono gryninimo etape, filtruojant geliu ant Superdex 75 dervos (Amersham Biosciences). Chromatografija atliekama 50 mM Na (CH3COO) buferiu, pH 5,0, kuriame yra 0,15 M NaCl.

Aprašytas interferono išskyrimo ir gryninimo metodas leidžia gauti 4-8 g labai išgryninto interferono per vieną izoliacijos ciklą 7-10 dienų iš biomasės, gautos iš 10 l kultūrinės terpės. Gauto interferono kokybė visiškai atitinka „Europos farmakopėjos“ reikalavimus interferono alfa-2b medžiagai, būtent:

Interferono koncentracija yra ne mažesnė kaip 2 × 108 TV / ml;

Specifinis interferono aktyvumas yra ne mažesnis kaip 2,0 × 10 8 TV / mg;

Elektroforetinis preparato grynumas mažinant ir nesumažinant, dažant gelius sidabru, yra ne mažesnis kaip 99%;

Izoliuoto interferono izoelektrinis taškas yra maždaug pH 5,8–6,3;

Išskirto interferono peptidų žemėlapis iš esmės nesiskiria nuo CRS interferono alfa Europos standarto peptidų žemėlapio;

Kaip parodyta iš aukščiau pateiktų pavyzdžių, teigiama išradimų grupė suteikia galimybę gauti gana didelį interferoną alfa-2b naudojant palyginti paprastą ir patikimą technologiją.

PRAŠYMAS

1. Rekombinantinė plazmidės DNR pSX50, koduojanti rekombinantinio žmogaus alfa-2b interferono sintezę, b e s i s k i r i a n t i tuo, kad jos dydis yra 3218 bazinių porų (bp) ir susideda iš šių fragmentų: seka nuo 1 iki 176 nukleotido (bp) apima fragmentą. DNR dydis 176 bp, kuriame yra triptofano promotorius (P trp), seka nuo 177 iki 194 nt. apima sintetinį 18 bp dydžio DNR fragmentą, kuriame yra Shine Delgarno seka, atsakinga už vertimo inicijavimą, seka nuo 195 iki 695 nt. apima 501 bp dydžio DNR fragmentą, kuriame yra alfa-2b-interferono genas su nukleotidų pakaitais: 37 (A\u003e C), 39 (G\u003e T), 40 (A\u003e C), 42 (G\u003e T), 67 ( A\u003e C), 69 (G\u003e T), 70 (A\u003e C), 72 (A\u003e T), 96 (G\u003e A), 100 (A\u003e C), 102 (A\u003e T), 114 (A \u003e C), 120 (C\u003e G), 126 (G\u003e A), 129 (G\u003e A), 330 (C\u003e G), 339 (G\u003e A), 342 (G\u003e A), 487 (A\u003e C), 489 (A\u003e T), 495 (G\u003e A), seka nuo 696 iki 713 n. apima sintetinį 18 bp dydžio DNR fragmentą, kuriame yra sintetinis polilinkeris, seka nuo 714 iki 1138 bp. apima plazmidės pKK223-3 DNR fragmentą nuo 4129 iki 4553 nt. dydis - 425 bp, kuriame yra griežto transkripcijos terminatoriaus rrnBT 1 T2 seka, seka nuo 1139 iki 1229 nt. apima plazmidės pUC19 DNR fragmentą nuo 2487 iki 2577 nt. dydžio 91 bp, turinčio β-laktomazės geno promotorių (geno atsparumas ampicilinui - Amp R), seka nuo 1230 iki 2045 nt. apima plazmidės pUC4K DNR fragmentą su 720 nt. iki 1535 m dydis 816 bp, kuriame yra kan geno struktūrinis regionas, seka nuo 2046 bp. iki 3218 n. apima plazmidės pUC19 DNR fragmentą nuo 1625 iki 453 nt. dydis 1173 bp, turintis seką, atsakingą už plazmidės (ori) ir lac promotoriaus (P lac) replikaciją.

2. Bakterijų štamas Eschcerichia coli SX50, transformuotas rekombinantine plazmidė pagal 1 punktą - rekombinantinio žmogaus leukocitų alfa-2b-interferono gamintojas.

3. Žmogaus alfa-2b-interferono gavimo būdas, apimantis Escherichia coli SX5 padermės auginimą pagal 2 punktą mitybinėje terpėje nuolat pridedant maistinių substratų biosintezės metu, mechaniškai sunaikinant mikroorganizmo ląsteles esant 700-900 barų slėgiui, interferono tirpinimą buferiniame guanidino hidrochlorido tirpale. , interferono renaturacija fiziologiniuose buferiniuose tirpaluose, esant chaotropiniams agentams, trijų pakopų chromatografinis interferono gryninimas chelatinėse Sepharose Fast Flow dervose, imobilizuotose Cu +2 jonais, jonų mainų chromatografija CM Sepharose Fast Flow jonų mainų dervose ir gelio filtravimo chromatografija ant Superdex 75 dervų. ...

4. Būdas pagal 3 punktą, besiskiriantis tuo, kad auginimas atliekamas mitybinėje terpėje su sumažintu triptofano kiekiu, nuolat pridedant maistinių substratų, geriau gliukozės ir mielių ekstrakto.

5. Būdas pagal 3 punktą, besiskiriantis tuo, kad prieš ištirpinant interferoną, jis yra išvalomas pašalinant tirpius ląstelių komponentus, įskaitant DNR, RNR, baltymus, lipopolisaharidus, plaunant buferiniais tirpalais, turinčiais Triton XI 00 tipo ploviklių, karbamidą.

6. Būdas pagal 3 punktą, besiskiriantis tuo, kad po kiekvieno chromatografinio gryninimo sterilizacija filtruojama per filtrus, kurių porų dydis yra 0,22 μm.

2018-02-02T17: 43: 00 + 03: 00

Įrodytas interferono alfa 2b veiksmingumas

Pirmą kartą apie interferoną - natūralų žmogaus kūno baltymą, pasaulis sužinojo 1957 m., Kai mokslininkai Alikas Isaacsas ir Jeanas Lindenmannas atrado tokį reiškinį kaip interferencija - sudėtingas biologinių procesų mechanizmas, kurio dėka kūnas sugeba kovoti su įvairiomis ligomis. Bet praėjusiame amžiuje jie turbūt nė neįtarė, kad šis baltymas taps pagrindiniu daugelio vaistų komponentu.

Interferonai yra baltymai, kuriuos gamina organizmo ląstelės, kai į juos patenka virusai. Jų dėka suaktyvėja genai, atsakingi už apsauginių tarpląstelinių molekulių sintezę, kurios suteikia antivirusinį poveikį slopindamos viruso baltymų sintezę ir užkertant kelią jo dauginimuisi. Kitaip tariant, šie baltymai (jie dar vadinami citokinais) mūsų kūne veikia kaip galingi gynėjai, saugantys mūsų sveikatą ir yra budrūs, kad prireikus galėtų nedelsdami atstumti virusų užpuolimą ir nugalėti ligą.

Norėdami apsaugoti kūną, užkrėstą virusais, interferoną gamina beveik visos mūsų kūno ląstelės. Be to, jo formavimąsi gali skatinti ne tik virusai, bet ir bakteriniai toksinai, todėl šis baltymas veiksmingas ir sergant kai kuriomis bakterinėmis infekcijomis. Taigi galima daryti išvadą, kad šis citokinas yra labai svarbus žmogaus imuninės sistemos komponentas. Be jo žmonija būtų seniai nugalėta daugybe virusų ir bakterijų.

Interferonų tipai

Interferonai yra suskirstyti į tris tipus: alfa, beta ir gama, kuriuos gamina skirtingos ląstelės.

• Interferonas alfa suaktyvina vadinamąsias natūralias žudiko ląsteles - leukocitus, naikinančius virusus, bakterijas ir kitus „priešo“ sukėlėjus.
• Interferonas beta gaminamas fibroblastuose, epitelio ląstelėse ir makrofaguose, kurie absorbuoja infekcijos sukėlėjus.
• Gama interferoną gamina T limfocitai, jo, kaip ir kitų rūšių, pagrindinė funkcija yra imuniteto reguliavimas.

Kaip ARVI įrodytas interferono veiksmingumas?

Kaip žinote, gydytojai, skirdami terapiją, remiasi savo patirtimi ir jau sukurta žinių sistema. Tačiau medicina sparčiai tobulėja: kiekvienais metais pasaulyje sukuriami nauji veiksmingi gydymo metodai ir patentuojami nauji vaistai. Todėl prireikė susisteminti naujausius medicinos pasiekimus ir atradimus, dėl kurių buvo parengtos klinikinės gairės ir gydymo standartai. Šie dokumentais pagrįsti algoritmai, pagrįsti įrodyta klinikine patirtimi, apibūdina ligų, kurių reikia laikytis, diagnozavimo, gydymo, reabilitacijos ir prevencijos instrukcijas, kurios padeda gydytojui priimti sprendimus dėl terapijos taktikos pasirinkimo konkrečioje situacijoje.

Pavyzdžiui, medicinos pagalbos vaikams teikimo ARVI ir gripo problemomis klausimais kūrėjų grupę sudaro apie 40 žmonių ir apima vadovaujančius Rusijos specialistus infekcinių ligų srityje iš įvairių institucijų ir įvairių skyrių. Logiška, kad specialistai skiria ypatingą dėmesį vaistams, kurie kuo greičiau sugeba įveikti ligas ir tuo pačiu turi minimalų šalutinį poveikį. Dabar mes kalbame apie vaistus, kurių sudėtyje yra interferono, kurie padeda kovoti su ARVI suaugusiesiems ir vaikams.

Kaip minėta aukščiau, jų gebėjimas kovoti su virusais buvo atrastas tyrinėjant mokslininkų Izaoko ir Lindenmanno intervencijas. Jie apibūdino interferoną kaip „baltymą, žymiai mažesnį nei imunoglobulinai, kurį gamina organizmo ląstelės po užkrėtimo gyvais ar inaktyvuotais virusais; galinčios slopinti įvairių virusų augimą tokiomis dozėmis, kurios nėra toksiškos ląstelėms “. Šiandien yra žinoma, kad šiuos baltymus gali gaminti beveik visos organizmo ląstelės, reaguodamos į svetimos informacijos patekimą, nepriklausomai nuo jos etiologijos (virusai, grybeliai, bakterijos, tarpląsteliniai patogenai, onkogenai). Pagrindinis jų biologinis poveikis slypi šios svetimos informacijos atpažinimo ir pašalinimo procesuose. Kitaip tariant, šios apsauginės molekulės „geba“ švelniai ir tiksliai sunaikinti virusus, kurie užėmė ląsteles, nepažeisdami pačių ląstelių. Tai patvirtino daugybė mokslinių tyrimų.

Kalbant apie vaistų, kuriuose yra interferonų, vartojimo būdus, čia būtina paminėti keletą niuansų. Viena iš pagrindinių interferono terapijos problemų yra „pristatyti“ veiksmingą vaisto dozę nesukeliant neigiamų padarinių. Kai kuriais atvejais į raumenis ar į veną suleidžiant vaistus, kurių sudėtyje yra interferono, atsiranda šalutinis poveikis, pasireiškiantis karščiavimu, šaltkrėčiu, galvos skausmais ir kitais nepageidaujamais reiškiniais. Šie simptomai nėra kritiški organizmui ir greitai išnyksta, tačiau gydymo metu jie sukelia diskomfortą.

Žvakučių, kurių sudėtyje yra alfa-2b-interferonas, naudojimas leido sumažinti šalutinį gydymo interferonu poveikį arba iš viso išsiversti. Remiantis moksliniais tyrimais, rektalinis rekombinantinio žmogaus interferono skyrimas pirmosiomis ARVI ligos dienomis sumažina karščiavimo trukmę, kovoja su peršalimu ir leidžia greitai įveikti ligą 2. Intranazinis vaistų vartojimas (kai vaistas tepamas ant nosies gleivinės), kuriame yra alfa-2b-interferono, papildo gydymą ir užtikrina optimalų terapijos poveikį. Vienas iš vaistų, tinkamų kovoti su gripu ir kitomis ūmiomis kvėpavimo takų virusinėmis infekcijomis bet kurioje ligos stadijoje, yra VIFERON. Jis tiekiamas žvakučių (žvakių), gelio ir tepalo pavidalu.

Trumpos vaistų, kuriuose yra alfa-2b-interferono, vartojimo ir toleravimo instrukcijos

Kas gali vartoti VIFERON vaistus:

• suaugusiems;
• vaikai nuo pirmųjų gyvenimo dienų;
• nėščiosioms nuo 4 nėštumo savaitės.

Mokslo bendruomenės pripažinimas

Interferonas alfa-2b (VIFERON) yra įtrauktas į tris federalinius medicinos priežiūros standartus kaip rekomenduojamą vaistą gripo ir ARVI gydymui, taip pat į tris federalinius protokolus šioms ligoms gydyti. 1 Jei atsižvelgsime ne tik į gripą ir ARVI, bet ir į kitas ligas, tada standartų ir rekomendacijų, susijusių su šiuo vaistu, skaičius yra dar didesnis - interferonas (VIFERON) yra įtrauktas į 30 federalinių suaugusiųjų ir vaikų medicininės priežiūros teikimo federalinių standartų, patvirtintų Rusijos Federacijos Sveikatos apsaugos ministerijos, taip pat 21 Protokolas (klinikinės gairės) dėl medicininės priežiūros teikimo suaugusiesiems, įskaitant nėščias moteris ir vaikus.

Vaisto principas

Žmogaus rekombinantinis alfa-2b-interferonas, kuris yra VIFERON preparato dalis, pasižymi antivirusinėmis, imunomoduliacinėmis savybėmis ir slopina RNR ir DNR turinčių virusų replikaciją. Antivirusinis gripo gydymas gali būti pradedamas bet kurioje ligos fazėje. Tai padės pagerinti būklę ir užkirsti kelią komplikacijų išsivystymui 2. VIFERON preparate yra visuotinai pripažintų labai aktyvių antioksidantų: žvakėse jie yra vitaminai E ir C, tepaluose - vitaminas E, gelyje - vitaminas E, citrinos ir benzenkarboksirūgštys. Atsižvelgiant į tokį antioksidantų palaikymą, pastebimas interferonų antivirusinio aktyvumo padidėjimas.

Vaistų testų rezultatai

Pagrindinėse Rusijos klinikose VIFERON buvo atliktas visas klinikinių tyrimų ciklas, apimantis daugybę įvairių ligų. Tyrimų rezultatas įrodė VIFERON terapinio ir profilaktinio efektyvumo veiksmingumą sergant įvairiomis infekcinėmis ir uždegiminėmis ligomis suaugusiems ir vaikams, įskaitant naujagimius, ir nėščioms moterims. Moksliškai įrodyta, kad sudėtinga išsiskyrimo sudėtis ir forma suteikia VIFERON išskirtines farmakokinetines savybes ir ilgesnį interferono veikimą, nesant šalutinio poveikio, būdingo rekombinantinių interferonų parenteraliniams preparatams 3.

Dėl kokių ligų naudojami vaistai, kurių pagrindą sudaro interferonas?alfa-2 b

VIFERON preparatas žvakučių, gelio ir tepalo pavidalu yra naudojamas šioms ligoms gydyti:

• SARS, įskaitant gripą;
• herpesas;
• papilomos viruso infekcija;
• enterovirusinė infekcija;
• laringotracheobronchitas;
• lėtinis B, C, D hepatitas, įskaitant tuos, kuriuos komplikuoja kepenų cirozė;
• bakterinė vaginozė;
• kandidozė;
• mikoplazmozė;
• ureaplazmozė;
• gardnereliozė.

VIFERON vaisto vartojimas kaip kompleksinio antivirusinio gydymo dalis gali sumažinti antibakterinių ir hormoninių vaistų terapines dozes, taip pat sumažinti toksinį šios terapijos poveikį.

Bendras gydytojas

1. http://www.rosminzdrav.ru, Rusijos Federacijos Sveikatos apsaugos ministerijos įsakymas, http://www.raspm.ru; http://www.niidi.ru; http://www.pediatr-russia.ru; http://www.nnoi.ru
2. I. V. Nesterova „Interferono vaistai klinikinėje praktikoje: kada ir kaip“, „Lankantis gydytojas“, 2017 m. Rugsėjis.
3. "VIFERON yra sudėtingas antivirusinis ir imunomoduliuojantis vaistas infekcinėms ir uždegiminėms ligoms gydyti perinatologijoje". (Vadovas gydytojams), Maskva, 2014 m.

Naudoti šaltiniai: http://www.lsgeotar.ru