Bulaşıcı hastalıklar kliniğindeki virolojik araştırmalar herkes tarafından edinilir daha büyük önemBu, öncelikle kliniği her zaman tipik olmayan viral enfeksiyonların oranındaki bir artıştan kaynaklanmaktadır. Aynı zamanda, tüm bulaşıcı hastalıklar için hızlı ve güvenilir virolojik teşhis yöntemleri geliştirilmemiştir, bunların çoğu zahmetlidir ve Özel durumlar, deney hayvanları, kültür ortamı ve eğitimli personel. Şu anda teşhis için viral enfeksiyonlar 3 ana araştırma türünü kullanır.
1. Viral antijen veya dokulardaki patognomonik değişiklikleri tespit etmek için enfeksiyöz materyalin mikroskobik incelenmesi. Teşhis amacıyla doğrudan mikroskobik muayene Hastalardan alınan bulaşıcı materyal sınırlı sayıda viral enfeksiyonla (kuduz, suçiçeği, sarı humma, uçuk, vb.) kullanılır. Floresan antikorlar kullanılarak viral antijenin saptanmasına dayanan yöntem daha geniş uygulama alanı kazanmıştır. İmmünofloresan yöntemi, ancak tüm teknik gereklilikler kesinlikle karşılanırsa güvenilir olabilir.
2. Virolojik yöntemler.
3. Hastalığın dinamiklerinde antikor titresindeki artışı belirlemeye yönelik serolojik çalışmalar. Serolojik araştırma yöntemleri laboratuvarda daha fazla mevcuttur.
Bu çalışmalar için, hastalığın akut döneminde ve nekahat döneminde (eşleştirilmiş serumlar) kan serumu alınması gerekir. İçin kan örnekleri serolojik araştırma antikoagülanlar ve koruyucular olmadan steril olarak alınır.
Virolojik araştırmanın ana aşamaları, virüslerin izolasyonu, tanımlanması, ana biyolojik özelliklerin karakterizasyonudur. Şu anda çeşitli virüs gruplarını izole etmek için tek bir metodoloji bulunmamaktadır. Bu, öncelikle, özelliklerinin çeşitliliğinden ve konakçı organizmanın dışındaki yetiştirme özelliklerinden kaynaklanmaktadır. Çalışma için biyosubstratlar (mukoza zarlarından, kan ve bileşenlerinden yıkamalar, beyin omurilik sıvısı, idrar ve dışkı, organ ve doku biyopsileri veya otopsi sırasında alınan parçalar) özel işlemlere tabi tutulduktan sonra pasajı yapılır. malzeme. Araştırma için alınan malzeme -20 ° C ile -70 ° C arasında değişen sıcaklıklarda saklanmalıdır. Ön teşhise bağlı olarak, malzemenin işlenmesinin kendine has özellikleri vardır, ancak her durumda, mukus, organ ve doku hücrelerinden veya bunların parçalarından, bakterilerden maksimum derecede saflaştırılmış bir substrat elde edildiği varsayılır. Bu, incelenen malzemenin özel bir aparatta homojenleştirilmesi veya bir porselen havanda, steril soğutulmuş (+4 C) eklenerek kuvars cam (organ ve doku parçaları) ile soğukta öğütülerek elde edilir. %
% 10-30'luk bir süspansiyon elde etmek için sodyum klorür çözeltisi ve ardından 1500-3000 rpm'de 10-15 dakika santrifüj. Bu şekilde elde edilen süpernatan, daha fazla araştırma için kullanılır.
Önce yoğun gelişme ve doku ve hücre kültürü yönteminin yaygın uygulamasına giriş, deney hayvanlarının veya tavuk embriyolarının enfeksiyonu kullanıldı. Bu yöntemler hala kullanımdadır. Hayvanları kullanarak virüslerin tespiti, deneyde tipik bir resim oluşturmanın mümkün olduğu durumlarda en uygunudur. bulaşıcı hastalık veya bazı tezahürleri. Bu nedenle, arbovirüs ve Coxsackie grubunun nedensel ajanları, emziren farelerin beyinlerinde enfeksiyon sırasında, grip - tavuk embriyolarının enfeksiyonu sırasında veya test materyalinin farelere intranazal uygulanması sırasında tespit edilebilir. Virolojik laboratuvarlarda son yıllarda en yaygın olarak kullanılan hücre ve doku kültürü yöntemi, adenovirüsleri, herpes virüslerini, solunum sinsitiyal virüslerini, miksovirüsleri ve diğerlerini izole etmeyi ve hastalığın etiyolojik teşhisini halihazırda gerçekleştirmeyi mümkün kılmaktadır. araştırmanın ilk aşamaları. Bunun nedeni, çoğu virüs ve hücrenin etkileşiminin iyi çalışılmış sitolojik özellikleridir. Bu nedenle, HeLa, Hep-2 hücrelerinin adenovirüs tip 2 içeren bir materyalle 3. günde enfeksiyonu, hücre tek tabakasının büyüme modelinde bir değişikliğe ve üzüm salkımları vb. Şeklinde tipik hücrelerin ortaya çıkmasına neden olur. , normal ışık mikroskobunda düşük büyütmede iyi tanımlanmıştır.
Enfeksiyöz bir hastalığın etiyolojik teşhisi için istisnai bir öneme sahip olan, test materyalinden virüs izolasyonunun standartlaştırılmasıdır; bu, çalışmanın bu aşamasında, fenotipik (öncelikle yaş) özelliklerini dikkate alarak genetik olarak saf doğrusal hayvanların kullanımını içerir. Bunun başlıca nedeni, çeşitli genetik çizgilerden ve yaşlardan deney hayvanlarının değişen dereceler virüslere duyarlı. Bu nedenle, BALB / c, A, CBA ve soy dışı hayvanlarda influenza virüsünün nörotropik bir WSN suşu ile farelerin intraserebral enfeksiyonu sırasında, duyarlılığın en yüksek olduğu ortaya çıktı; testin intranazal uygulama vakalarında aynı model oluşturuldu. malzeme. İçin gerekli son sonuçlar virüs izolasyonu üzerine yapılan çalışmalar, gizli virüs taşıyıcıları için hayvanlar, tavuk embriyoları, hücre ve doku kültürlerinin ön incelemesini içerir. Laboratuvar pratiğinde yaygın olarak kullanılan tavuk embriyoları, mikoplazmanın yanı sıra kuş lösemi virüsleri, kuş ensefalomiyeliti, enfeksiyöz sinüzit, psittakoz, Newcastle hastalığı, bazı bakteriyel enfeksiyonlara neden olan ajanlar (paratifoid ateşi vb.) İle enfekte olabilir. Hala daha bakteriyel ve özellikle viral ajanlar, hücre ve doku kültürünü kendiliğinden enfekte edebilir ve bunlarda yaşayabilir. Varlıkları, incelenen materyalin değerlendirmesini önemli ölçüde etkiler. Hücre kültüründe bazı mikoplazma türleri
hemaglütinasyona ve hemadsorpsiyona neden olabilir ve hatta virüsler tarafından oluşturulanlara benzer şekilde agar kaplaması altında plaklar oluşturabilir. Bir tipteki hücre kültürlerinin diğerleriyle kontaminasyonu da büyük önem taşır, çoğunlukla HeLa hücreleriyle ilişkilidir ve aynı odada farklı kültür türleriyle çalışırken, laboratuar cam eşyalarının kötü işlenmesi vb. İle gözlenir. Hücre kültürlerinin kontaminasyonu veya hayvanların bakteriyel ajanlarla enfeksiyonu, örneğin bir kural olarak, kendisini oldukça açık bir şekilde gösterir (hücrelerin tek tabakasının büyümesinin doğasındaki değişiklikler, kültür ortamının özellikleri, tavuk embriyolarının veya hayvanların ölümü semptomlar, vb.) ve sonuçların değerlendirilmesinde herhangi bir özel zorluk çıkarmaz. Gizli enfeksiyon biçimleriyle ilgili sorun, serolojik ve diğer yöntemlerin kullanılması gerektiğinde daha karmaşıktır. Bu talimatlar, bir virologun çalışmasında, özellikle hastalığın belirsiz vakalarının etiyolojik teşhisi yapılırken dikkate alınmalıdır.
Virolojik araştırma yöntemleri
virüslerin biyolojisini inceleme yöntemleri ve tanımlanması. Virolojide, viral partiküllerin moleküler yapısını, hücreye nüfuz etme yöntemlerini ve virüslerin üreme özelliklerini, viral yapının birincil yapısını kurmanın mümkün olduğu moleküler biyoloji yöntemleri yaygın olarak kullanılmaktadır. nükleik asitler ve proteinler. Viral nükleik asitlerin ve protein amino asitlerinin kurucu elemanlarının sırasını belirleme yöntemleri geliştirilmektedir. Nükleik asitlerin ve bunların kodladığı proteinlerin fonksiyonlarını nükleotid sekansıyla ilişkilendirmek ve viral enfeksiyonun patogenezinde önemli rol oynayan hücre içi süreçlerin nedenlerini belirlemek mümkün hale gelir.
Virolojik araştırma yöntemleri ayrıca immünolojik süreçlere (antijenin antikorlarla etkileşimi), virüsün biyolojik özelliklerine (hemaglütinasyon yeteneği, hemoliz, enzimatik aktivite), virüsün konakçı hücre ile etkileşiminin özelliklerine (sitopatik yapının doğası) dayanmaktadır. etki, hücre içi kapanımların oluşumu vb.) ...
Viral enfeksiyonların teşhisinde, virüslerin yetiştirilmesinde, izolasyonunda ve tanımlanmasında ve ayrıca aşı preparatlarının hazırlanmasında, doku ve hücre kültürü yöntemi yaygın olarak kullanılmaktadır. Birincil, ikincil, stabil nakledilebilir ve diploid hücre kültürleri kullanılır. Birincil kültürler, dokuyu proteolitik enzimlerle (tripsin, kolajenaz) dağıtarak elde edilir. Hücrelerin kaynağı, insan ve hayvan embriyolarının dokuları ve organları (genellikle böbrekler) olabilir. Bir besin ortamındaki hücre süspansiyonu, şilteler, şişeler veya Petri kapları olarak adlandırılan kaplara yerleştirilir; burada, kabın yüzeyine tutturulduktan sonra hücreler çoğalmaya başlar. Virüslerle enfeksiyon için genellikle bir hücre tek tabakası kullanılır. Besin sıvısı atılır, belirli seyreltmelerde viral bir süspansiyon eklenir ve hücreler ile temastan sonra, genellikle serumsuz taze besleyici ortam eklenir.
Çoğu birincil kültürün hücreleri alt kültürlenebilir; bu kültüre ikincil denir. Hücrelerin daha fazla geçişiyle, hızlı çoğalabilen fibroblast benzeri bir hücre popülasyonu oluşur, çoğu orijinal kromozom setini koruyan. Bunlar sözde diploid hücrelerdir. Hücrelerin seri kültürlenmesi ile kararlı sürekli hücre kültürleri elde edilir. Geçişler sırasında, heteroploid bir kromozom seti ile hızla bölünen homojen hücreler ortaya çıkar. Kararlı hücre hatları tek tabakalı ve süspansiyon olabilir. Tek katmanlı kültürler cam yüzeyde sürekli bir katman olarak büyür, süspansiyon kültürleri karıştırma cihazları kullanılarak çeşitli kaplarda süspansiyon olarak büyür. 40'tan türetilmiş 400'ün üzerinde hücre dizisi vardır. farklı şekiller hayvanlar (primatlar, kuşlar, sürüngenler, amfibiler, balıklar, böcekler dahil) ve insanlar.
Yapay besin ortamında, tek tek organ ve doku parçalarını (organ kültürü) yetiştirebilirsiniz. Bu tür kültürler, farklılaşmamış doku kültürlerinde (örneğin koronavirüsler) çoğalmayan virüslerin izolasyonu ve geçişi için özellikle önemli olan doku yapısını korur.
Enfekte hücre kültürlerinde virüsler, hücre morfolojisindeki bir değişiklik, spesifik olabilen bir sitopatik etki, inklüzyonların ortaya çıkışı, hücrede ve kültür sıvısında viral antijenleri belirleyerek; kültür sıvısında viral soyun biyolojik özelliklerinin oluşturulması ve doku kültürü, tavuk embriyoları veya hassas hayvanlarda virüslerin titre edilmesi; floresan mikroskobu kullanılarak sitokimyasal yöntemle moleküler hibridizasyon veya nükleik asit kümeleri yoluyla hücrelerdeki tek tek viral nükleik asitleri tespit ederek.
Virüsleri izole etmek zahmetli ve zaman alan bir süreçtir. Popülasyonda dolaşan virüsün türünü veya varyantını belirlemek için gerçekleştirilir (örneğin, influenza virüsünün serovaryantını, poliomiyelit virüsünün vahşi veya aşı suşunu vb. Belirlemek için); acil epidemiyolojik önlemlerin gerekli olduğu durumlarda; yeni virüs türleri veya çeşitleri ortaya çıktığında; gerekirse ön teşhisin doğrulanması; nesnelerdeki virüsleri belirtmek için çevre... Virüsleri izole ederken, insan vücudunda kalıcı olma olasılığını ve iki veya daha fazla virüsün neden olduğu karışık bir enfeksiyonun meydana gelme olasılığını dikkate alın. Bir viriondan elde edilen bir virüsün genetik olarak homojen bir popülasyonuna viral klon adı verilir ve elde etme sürecine klonlama denir.
Virüsleri izole etmek için, duyarlı laboratuar hayvanlarının enfeksiyonu, tavuk embriyoları kullanılır, ancak doku kültürü çoğunlukla kullanılır. Bir virüsün varlığı genellikle hücrelerin spesifik dejenerasyonu (sitopatik etki), semplast ve sinsit oluşumu, hücre içi inklüzyonların tespiti ve ayrıca immünofloresans, hemadsorpsiyon, hemaglütinasyon yöntemleri kullanılarak tespit edilen spesifik bir antijen ile belirlenir. hemaglutinating virüsler) vb. Bu işaretler ancak virüsün 2-3 geçişinden sonra tespit edilebilir.
Tavuk embriyoları, bazı Coxsackie virüslerinin ve bir dizi arbovirüsün - yeni doğmuş farelerin - izolasyonu için bir dizi virüsü, örneğin influenza virüslerini izole etmek için kullanılır. İzole edilmiş virüslerin tanımlanması, serolojik reaksiyonlar ve diğer yöntemler kullanılarak gerçekleştirilir.
Virüslerle çalışırken titreleri belirlenir. Virüs titrasyonu genellikle, doku dejenerasyonunun meydana geldiği, inklüzyonların ve virüse özgü antijenlerin oluştuğu aşılanmış sıvının en yüksek seyreltisini belirleyerek doku kültüründe gerçekleştirilir. Plak yöntemi, bir dizi virüsü titre etmek için kullanılabilir. Plaklar veya negatif virüs kolonileri, bir agar kaplaması altında tek katmanlı bir doku kültüründe virüs tarafından yok edilen hücrelerin odaklarıdır. Koloni sayıları izin verir nicel analiz virüsün bulaşıcı bir parçacığının bir plak oluşturması temelinde virüslerin bulaşıcı aktivitesi. Plaklar, kültürün hayati boyalar, genellikle nötr kırmızı ile boyanmasıyla saptanır; plaklar boyayı adsorbe etmez ve bu nedenle lekeli canlı hücrelerin arka planına karşı hafif lekeler olarak görülebilir. Virüs titresi, 1'de plak oluşturan birimlerin sayısı ile ifade edilir. ml.
Virüslerin saflaştırılması ve konsantrasyonu genellikle diferansiyel ultrasantrifüjleme ve ardından konsantrasyon veya yoğunluk gradyanlı santrifüj ile gerçekleştirilir. Virüsleri saflaştırmak için immünolojik yöntemler, iyon değişim kromatografisi, immünosorbentler vb. Kullanılır.
Viral enfeksiyonların laboratuar teşhisi, patojenin veya bileşenlerinin klinik materyalde saptanmasını; virüsün bu materyalden izolasyonu; serodiyagnostikler. Her bir vakada bir laboratuvar tanı yönteminin seçimi, hastalığın doğasına, hastalığın dönemine ve laboratuvarın yeteneklerine bağlıdır. Modern teşhis viral enfeksiyonlar, klinik materyali aldıktan birkaç saat sonra yanıt almanıza izin veren ekspres yöntemlere dayanmaktadır. erken tarihler hastalıktan sonra bunlar arasında elektron ve immün elektron mikroskobu, ayrıca immünofloresan, moleküler hibridizasyon, IgM antikorlarının tespiti vb.
Negatif kontrast boyama ile boyanan virüslerin elektron mikroskobu, virüslerin farklılaşmasına ve konsantrasyonlarının belirlenmesine izin verir. Viral enfeksiyonların teşhisinde elektron mikroskobu kullanımı, klinik materyaldeki viral partikül konsantrasyonunun yeterince yüksek olduğu durumlarla sınırlıdır (1'de 10 5 mlve daha yüksek). Bu yöntemin dezavantajı, aynı taksonomik gruba ait virüsleri ayırt etmenin imkansızlığıdır. Bu dezavantaj, immün elektron mikroskobu kullanılarak ortadan kaldırılır. Yöntem, viral partiküllere spesifik bir serum eklendiğinde immün komplekslerin oluşumuna dayanırken, aynı anda viral partikül konsantrasyonu varken bunları tanımlamayı mümkün kılar. Yöntem ayrıca antikorları tespit etmek için kullanılır. Ekspres teşhis amacıyla, doku özütlerinin, dışkıların, veziküllerden sıvıların, nazofarenks salgılarının elektron mikroskobik incelemesi yapılır. Elektron mikroskobu, virüsün morfogenezini incelemek için yaygın olarak kullanılır; yetenekleri, etiketli antikorların kullanımıyla genişletilir.
Virüse özgü nükleik asitlerin tespitine dayanan moleküler hibridizasyon yöntemi, genlerin tek kopyalarını tespit etmeyi mümkün kılar ve hassasiyet derecesinde eşit değildir. Reaksiyon, tamamlayıcı DNA veya RNA ipliklerinin (problar) hibridizasyonuna ve çift sarmallı yapıların oluşumuna dayanır. En ucuz prob, klonlanmış rekombinant DNA'dır. Prob, radyoaktif öncülerle (genellikle radyoaktif fosfor) etiketlenmiştir. Kolorimetrik reaksiyonların kullanımı umut vericidir. Moleküler hibridizasyon için birkaç seçenek vardır: nokta, blot hibridizasyonu, sandviç hibridizasyonu, yerinde hibridizasyon, vb.
LgM sınıfı antikorlar, G sınıfı antikorlardan daha erken ortaya çıkar (hastalığın 3-5. Gününde) ve birkaç hafta sonra kaybolur, bu nedenle tespitleri yeni transfer edilmiş bir enfeksiyonu gösterir. IgM antikorları, anti-μ-antiserumlar (anti-IgM ağır zincir serumları) kullanılarak immünofloresan veya enzime bağlı immünosorbent testi ile tespit edilir.
Virolojideki serolojik yöntemler, klasik immünolojik reaksiyonlara dayanır (bkz.İmmünolojik araştırma yöntemleri) : kompleman bağlanma reaksiyonları, hemaglutinasyonun inhibisyonu, biyolojik nötralizasyon, immünodifüzyon, indirekt hemaglutinasyon, radyal hemoliz, immünofloresans, enzim immünoassay, radyoimmunoassay. Birçok reaksiyon için mikro yöntemler geliştirilmiştir ve teknikleri sürekli olarak geliştirilmektedir. Bu yöntemler, bir dizi bilinen serumu kullanarak virüsleri tanımlamak için ve ikinci serumdaki antikorların birinciye kıyasla artışını belirlemek için serolojik teşhis için kullanılır (ilk serum hastalıktan sonraki ilk günlerde, ikinci serum - sonra alınır. 2-3 hafta). İkinci serumda antikorlarda dört kattan daha az bir artış tanısal değer taşır. IgM antikorlarının tespiti yeni bir enfeksiyonu gösteriyorsa, IgC antikorları birkaç yıl ve bazen ömür boyu devam eder.
Proteinlerin ön saflaştırması olmadan karmaşık karışımlarda virüslerin ve bunlara karşı antikorların tek tek antijenlerini tanımlamak için immünoblotlama kullanılır. Yöntem, proteinlerin poliakrilamid jelde elektroforez yoluyla fraksiyonasyonunu, ardından enzim immünoassay ile proteinlerin immünoindikasyonunu birleştirir. Proteinlerin ayrılması, antijenin kimyasal saflığı için gereksinimleri azaltır ve bireysel antijen-antikor çiftlerinin saptanmasına izin verir. Böyle bir görev, örneğin, viral proteinlerin yetersiz saflaştırılmasının bir sonucu olarak mevcut olan hücresel antijenlere karşı antikorların varlığından kaynaklanan yanlış pozitif enzim immünodeney reaksiyonlarına neden olan HIV enfeksiyonunun serodiyagnostiği ile ilgilidir. Hastaların serumlarında dahili ve harici viral antijenlere karşı antikorların tanımlanması, bir kişinin hastalığın evresini ve popülasyon analizinde viral proteinlerin değişkenliğini belirlemesine izin verir. HIV enfeksiyonu için immünoblotlama, tek tek viral antijenleri ve bunlara karşı antikorları tespit etmek için doğrulayıcı bir test olarak kullanılır. Popülasyonları analiz ederken, yöntem viral proteinlerin değişkenliğini belirlemek için kullanılır. Yöntemin büyük değeri, rekombinant DNA teknolojisi kullanılarak sentezlenen antijenleri analiz etme, boyutlarını ve antijenik determinantların varlığını belirleme olasılığında yatmaktadır.
Virolojik çalışmalar, virüsleri izole etmek ve özelliklerini incelemek ve ayrıca virüslerin belirli hastalıklarla etiyolojik ilişkisini kurmak için tasarlanmış çalışmalardır.
Araştırma materyali, baskın virüslerin hastanın vücudundaki yerine ve dış ortama salınma yollarına bağlı olarak alınır. Materyal steril bir kapta toplanır, mümkün olan en kısa sürede laboratuvara teslim edilir ve çalışmaya kadar donmuş veya buz üzerinde saklanır. Kullanımdan önce, virüs izolasyon malzemesi yabancı mikroflorayı bastırmak için işlenir ve büyük partikülleri uzaklaştırmak için maruz bırakılır.
Virüs izolasyonu, aşılanmış materyal ile laboratuar hayvanları, tavuk embriyoları ve doku kültürü enfekte edilerek gerçekleştirilir. İzolasyon yönteminin seçimi, hastalığın iddia edilen nedensel etkisine bağlıdır. Bu nedenle, doku kültürleri (bakınız), laboratuvar hayvanları için patojenik olmayan virüslerle çalışırken veya doku kültüründe hayvanların enfekte olduğu zamandan daha erken tespit edildiğinde kullanılır. Tavuk embriyoları, patojenleri, enfeksiyöz kabakulakları (amniyotik ve allantoik boşluklarda), (yumurta sarısında), çiçek hastalığını (koryonallantoik zarda) izole etmek için enfekte edilir.
Virüs izolasyonu için laboratuar hayvanlarından en çok beyaz fareler kullanılır, daha sonra tavşanlar, sıçanlar, kobaylar, maymunlar. Arbovirüsler için, aşılanmış materyalin kafaya veya pnömotropik virüsler için mukoza zarına en etkili şekilde sokulması solunum sistemi, çiçek hastalığı virüsleri için, yaralı korneada.
Virüs izolasyonu, hastalığın akut döneminde en etkilidir. Hastalığın viral yapısını belirlemede önemli bir nokta, hastalığın başlangıcında ve nekahat döneminde aynı hastadan tekrar tekrar alınan serumların serolojik çalışmalarının sonuçlarıdır. İkinci serumda izole edilmiş virüslere karşı antikorların birinciye göre 4 veya daha fazla titrede saptanması, virüslerin bu hastalıkla etiyolojik ilişkisini gösterir.
Erken ve hızlı yöntem Viral antijenlerin tespiti, florokrom etiketli antikorların antijen yüzeyindeki spesifik fiksasyonuna dayanan bir floresan antikor yöntemidir. Antijen üzerine adsorbe edilmiş antikorların parlak floresansı nedeniyle, antijen floresan mikroskopi (bkz.) İle kolayca tespit edilir. Floresan antikorlar yöntemi hastalardan alınan smearları, etkilenen dokuların histolojik kesitlerini, doku kültürü preparatlarını inceler. Temel cisimlerin tespiti için (virionlar) da kullanılır (bkz.). Diğer morfolojik yöntemlerden, etkilenen organ ve dokuların bölümlerindeki hücre içi viral inklüzyonları ortaya çıkarmak için kullanılanlar. Kapanımların saptanması enfeksiyonu gösterir ve bazı durumlarda viral bir hastalığın teşhisine katkıda bulunur. Hastaların kanındaki viral antikorları tespit etmek ve virüslerin antijenik yapısını incelemek için çeşitli kullanılır. Nötralizasyon reaksiyonu hemen hemen tüm viral enfeksiyonlarda kullanılır. Karışım duyarlı hayvanların vücuduna veya doku kültürüne verildiğinde immün antikorların virüslerin bulaşıcı özelliklerini nötralize etme kabiliyetine dayanır. Nötralizasyon indeksini belirlemek için, sabit bir serum dozu, farklı virüs seyreltileri ile karıştırılır ve antikorların titresini, sabit bir virüs dozu ile farklı serum seyreltilerini belirlemek için. Kontrol, hayvanların (veya doku kültürünün) normal serumlu bir virüs karışımı veya tuzlu su... Nötralizasyon reaksiyonu sadece antikorları tespit etmek için değil, aynı zamanda virüslerin tipini ve tipini belirlemek için de gerçekleştirilir.
Kompleman bağlanma testi [örneğin, Bordet-Zhangu reaksiyonu (bakınız)] hem viral antijenleri hem de antikorları saptamak için kullanılır. İlk durumda, bilinen bir bağışıklık serumu ve reaksiyonda antijenlerin varlığının etkileşime girdiği bir materyal: kan serumu, nazofaringeal yıkamalar, enfekte bir organizmanın doku özleri. İkinci durumda, bilinen bir antijen (diagnostik) ve hastanın veya iyileşme serumu.
RSC, influenza, çiçek hastalığı, adenovirüsler ve arbovirüslerin neden olduğu hastalıkları teşhis etmek için kullanılır.
İÇİNDE laboratuvar teşhisleri viral enfeksiyonlar üç ana yaklaşım vardır
1) materyalin viral antijen veya nükleik asitlerin varlığı açısından doğrudan incelenmesi;
2) virüsün klinik materyalden izolasyonu ve tanımlanması;
Klinik materyalin teşhisi için doğrudan yöntemler
Doğrudan yöntemler, bir virüsün, viral antijenin veya viral nükleik asidin (NK) doğrudan klinik materyalde tespit edilmesini sağlayan, yani en hızlı olan (2-24 saat) yöntemlerdir.
Elektron mikroskobu (EM). Bu yöntemi kullanarak gerçek virüsü tespit edebilirsiniz.
virüslere karşı spesifik antikorlar kullanan immün elektron mikroskobu (IEM). Antikorların virüslerle etkileşiminin bir sonucu olarak, negatif kontrasttan sonra tespit edilmesi daha kolay olan kompleksler oluşur.
İmmünofloresan reaksiyonu (RIF). Yöntem, boyaya bağlı antikorların kullanımına dayanmaktadır.
RIF yöntemi, akut solunum yolu viral enfeksiyonlarının etiyolojisini hızlı bir şekilde deşifre etmek için üst solunum yolunun mukoza zarından smear izlerinin analizinde yaygın olarak kullanılmaktadır.
Enzime bağlı immünosorbent deneyi (ELISA). Viral antijenlerin belirlenmesine yönelik immünoanaliz yöntemleri prensipte RIF'ye benzer, ancak antikorların boyalar yerine enzimlerle etiketlenmesine dayanır.
Radioimmunoassay (RIA). Yöntem, viral antijenin belirlenmesinde yüksek hassasiyet sağlayan antikorların radyoizotoplarla etiketlenmesine dayanmaktadır.
Moleküler yöntemler. Başlangıçta, viral genomu tespit etmek için klasik yöntem, oldukça spesifik bir NK hibridizasyon yöntemi olarak kabul edildi, ancak günümüzde, polimeraz kullanılarak viral genomların izolasyonu zincirleme tepki (PCR).
Nükleik asitlerin moleküler hibridizasyonu. Yöntem, çift sarmallı yapıların oluşumu ile tamamlayıcı DNA veya RNA ipliklerinin hibridizasyonuna ve bunların tanımlanmasına dayanmaktadır.
PCR, doğal DNA replikasyonu ilkesine dayanmaktadır. Yöntemin özü, termostabil bir Taq DNA polimeraz ve primerler adı verilen iki özel primer kullanılarak virüse özgü bir DNA dizisinin sentez (amplifikasyon) döngülerinin tekrarlanan tekrarında yatmaktadır.
Sitolojik yöntemlerin şu anda sınırlı tanı değeri vardır, ancak yine de bir dizi enfeksiyon için kullanılmalıdır. Otopsi, biyopsi, smear malzemeleri incelenir ve uygun işlemlerden sonra boyanır ve mikroskop altında analiz edilir.
Başarılı virüs izolasyonu için klinik malzeme iddia edilen hastalığın patogenezine göre ve mümkün olan en erken tarihte alınmalıdır.
Kural olarak, alınan:
- solunum yolu enfeksiyonları için - nazofaringeal lavaj;
- enterovirüs enfeksiyonları için - kızarma ve dışkı (reo-, enterovirüsler);
- deri ve mukoza zarının lezyonları ile - kazıntılar, veziküllerin içeriği (herpes, suçiçeği);
- ekzantemik enfeksiyonlarla - yıkamalar (kızamık, kızamıkçık);
- arbovirüs enfeksiyonları için - kan, beyin omurilik sıvısı.
Virüslerin izolasyonu için hücre kültürleri, laboratuar hayvanları ve tavuk embriyoları kullanılır. Süreç uzundur, bazen virüs tespit edilip bir veya birkaç yöntem kullanılarak tanımlanmadan önce birkaç geçiş gerektirir - nötrleştirme reaksiyonunda (RN), RIF, ELISA veya PCR'de.
Serodiagnostikler
Antijen - antikor reaksiyonuna dayalı serolojik teşhis, hem bunları hem de diğerlerini belirlemek için kullanılabilir ve viral enfeksiyonun etiyolojisini belirlemede rol oynar. olumsuz sonuçlar virüs izolasyonu.
CSC, geleneksel serolojik testlerden biridir ve birçok viral enfeksiyonu teşhis etmek için kullanılır. Reaksiyonda iki sistem yer alır: hastanın serum antikorları + standart virüs ve koyun eritrositleri + bunlara karşı antikorlar ve titre edilmiş tamamlayıcı. Antikorlar ve virüs eşleştiğinde, bu kompleks komplemana bağlanır ve koyun eritrositlerinin parçalanması meydana gelmez (pozitif reaksiyon). Negatif CSC ile tamamlayıcı, eritrositlerin parçalanmasını destekler. Bu yöntemin dezavantajı, yeterince yüksek olmayan duyarlılığı ve reaktiflerin standartlaştırılmasındaki güçlüğüdür, serumdaki antikorları belirlemek için ELISA gibi IF yöntemi kullanılır.
Viral yapıya sahip hastalıkların teşhisi için araştırma. Bu, virüsü tanımlamak, biyolojisini ve hayvan ve insan hücrelerini etkileme yeteneğini incelemek için gereklidir. Böylece patogenezi anlamak mümkün hale gelir viral hastalıklar ve buna göre doğru tedavi yöntemini seçin.
Teşhis nedir?
Canlı hücrelerde. Bunu araştırmak için, deneysel organizma düzeyinde yetiştirmek gerekir veya Bunun için, aşağıdaki ana yaklaşımlara sahip olan tıbbi uygulamada ve genel olarak mikrobiyolojide virolojik araştırma yöntemleri gerçekleştirilir:
- düz;
- dolaylı;
- serolojik.
Materyal, nükleik asitlerin, viral antijenin varlığı açısından doğrudan incelenebilir veya örneğin virüs, klinik materyalden izole edilebilir ve tanımlanabilir.
Hastalığın etiyolojisini belirleme, terapötik etkiyi izleme yeteneğine ek olarak, virolojik araştırma yöntemleri anti-salgın önlemlerde önemli bir rol oynar. İzolasyon ve kullanım için tavuk embriyoları, laboratuar hayvanları veya hücre kültürleri kullanılır.
Nasıl araştırılır?
En hızlısı doğrudan yöntemdir. Klinik materyalin kendisinde bir virüs, antijen veya NK (nükleik asit) tespitine izin verir. İki saatten bir güne kadar zaman alır.
- EM - elektron mikroskobu. Virüsü doğrudan tespit eder.
- IEM - Bağışıklık Elektron Mikroskobu. Virüslere karşı spesifik antikorlar kullanır.
- RIF - immünofloresanın reaksiyonu. Boyaya bağlı antikorları kullanır. Bu tür virolojik araştırma yöntemleri, üst solunum yolunun mukoza zarından lekeler alındığında ARVI etiyolojisinin (akut solunum yolu viral enfeksiyonları) hızlı bir şekilde çözülmesi için yaygın olarak kullanılmaktadır.
- ELISA - enzime bağlı immünosorbent testi - viral antijenlerin belirlenmesi, RIF'e benzer, ancak antikorların enzimlerle etiketlenmesine dayanır.
- RIA - radyoimmünoassay. Viral antijenin belirlenmesinde yüksek hassasiyet sağlamak için antikorların radyoizotop etiketlemesini kullanır.
- Moleküler - NK'nın hibridizasyonu veya PCR (polimeraz zincir reaksiyonu) kullanılarak virüs genomlarının izolasyonu.
- Sitoloji nadiren kullanılır, ancak bazı enfeksiyonlar için bu virolojik araştırma yöntemleri çok etkilidir. Biyopsiler, otopsiler ve smearlar boyama ve mikroskobik analiz için incelenir.
Araştırmanın amacı nedir?
Başarılı virüs izolasyonu için, klinik materyal patogeneze uygun olarak ve olabildiğince erken alınır. Genellikle bu süreç, belirli virolojik araştırma yöntemlerini uygulamadan önce birkaç geçiş gerektirir.
Mikrobiyoloji, mikroskobik canlıları inceler. Ve onun alanı sadece tıp değil. İçin temel bilimdir tarım, veterinerlik, uzay ve teknik endüstriler, jeoloji.
Ama elbette, her şey insan ve bu güzel gezegendeki gelişimi için yaratılmıştır. Bu nedenle tehlikeyi zamanında tespit etmek ve etkisiz hale getirmek çok önemlidir. Virüsler bakterilerden farklıdır. Bunlar vücuda giren ve yeni nesil oluşumuna neden olan yapılardır. Kristal gibi görünürler ve kendileri beslenmemelerine, büyümemelerine ve metabolik ürünler salmamalarına rağmen üreme sürecini kontrol etmeyi amaçlamaktadırlar.
Virüs, düştüğü herhangi bir canlı organizmada ciddi hastalığa neden olabilir. Artı, gelişebilir. Bu nedenle mikrobiyolojide virolojik araştırma yöntemleri geliştirilmeli ve iyileştirilmelidir çünkü insan uygarlığı bir bütün olarak tehdit altında olabilir.
Malzemeler
Tıpta virüslerin tespiti ve tanımlanması için kural olarak alınır:
- nazofarengeal lavaj (solunum yolu enfeksiyonları);
- kızarıklık ve dışkı ( enterovirüs enfeksiyonları);
- sıyrıklar, veziküllerin içeriği (deri lezyonları, herpes, su çiçeği gibi mukoza zarları);
- kızarıklıklar (kızamık, kızamıkçık gibi ekzantemik enfeksiyonlar);
- kan, beyin omurilik sıvısı (arbovirüs enfeksiyonları).
Aşamalar
Virolojik araştırma yönteminin tüm aşamaları şunları içerir:
- malzeme alımı;
- bir test sisteminin seçimi, alınması, uygulanabilirliğinin belirlenmesi;
- test sisteminin enfeksiyonu;
- virüs belirtisi;
- virüs türünün belirlenmesi.
Temel olarak, patojenik virüsler doku varlığı ve tip özgüllüğü ile ayırt edilir. Örneğin, yalnızca primatlarda (hücrelerinde) çoğalan çocuk felci virüsünü ele alalım. Buna göre, spesifik bir virüsü izole etmek için spesifik bir doku kültürü kullanılır. Bilinmeyen bir patojenden bahsediyorsak, aynı anda üç ve tercihen dört hücre kültürünü enfekte etmek tavsiye edilir.
Dolayısıyla belki bir tanesi hassas olacaktır. Virüsün enfekte kültürlerdeki varlığını belirlemek için, spesifik hücre dejenerasyonunun gelişimine, hücre içi inklüzyonlara, spesifik bir antijenin saptanmasına, pozitif hemaglütinasyon ve hemadsorpsiyon reaksiyonlarına bakarlar.
Tüm virolojik araştırma yöntemleri (doğrudan ve dolaylı, serolojik) iddia edilen enfeksiyonun özel durumu için en uygun olarak seçilmelidir.
Dolaylı yöntemler, virüs izolasyonuna ve tanımlanmasına dayanır. Yoğun emek gerektirir, zaman alır, ancak doğrudur.
Serodiagnostikler
Böyle bir teşhis, bir antijen-antikor reaksiyonuna dayalı bir yöntem anlamına gelir. Çoğu zaman, birkaç haftalık aralıklarla alınan eşleştirilmiş kan serumları kullanılır. Antikor titresindeki artış 4 kat veya daha fazla ise, reaksiyon pozitif kabul edilir. Virüsün tip özgüllüğünü belirlemek için, bir virüs nötralizasyon reaksiyonu kullanılır. Grup özgüllüğünü belirlemek için, bir tamamlayıcı bağlanma reaksiyonu elde etmeniz gerekir.
Yaygın olarak kullanılan farklı seçenekler enzim immunoassay, hemaglütinasyon inhibisyon reaksiyonu, pasif hemaglutinasyon, ters pasif hemaglütinasyon, RIF. Genetik mühendisliğinde bile, monoklonal antikorların üretilmesi için bir yöntem geliştirildi. Monoklonların dar özgünlüğü, çeşitli viral determinantlara karşı çoklu monoklonal antikorlar kullanılarak aşılabilir. Böylece, antijenlerin belirlenmesi ile çalışmanın özgüllüğü ve duyarlılığı artırıldı.
Bazı özellikler
Günümüzde bir virüsün canlı bir organizmaya girmesinden kaynaklanan enfeksiyonların immünolojik teşhisi için birçok farklı test sistemi oluşturulmuştur.
Dolayısıyla virolojik araştırma yöntemleri, virüsleri izole etmenin, özelliklerini incelemenin ve belirli hastalıklarla etiyolojik ilişkilerini kurmanın yollarıdır.
