İmmünoblot nedir? Bu yaygın bir yöntemdir laboratuvar teşhisi viral enfeksiyonlar kişi. HIV varlığını tespit etmenin en doğru ve güvenilir yollarından biri olarak kabul edilir. Güvenilirliği açısından, immünoblot sonuçlarının reddedilemez ve nihai olduğu kabul edildiğinden bile üstündür.
Genel bilgi
İmmünoblot - nedir bu? Bir kişide HIV enfeksiyonunu tanımak için, antikorların varlığı açısından kan serumunun laboratuvar testinden geçirilmesi gerekir. İmmünoblotlama tekniğine Western blot da denir. Ek bir uzman yöntem olarak insan viral enfeksiyonlarını tespit etmek için kullanılır. Kandaki HIV antikorlarının varlığını belirlemenizi sağlayan bir laboratuvar testi olan ELISA'yı doğrulamak gerekir. İmmünoblotlama ile tekrar kontrol edin pozitif test ELISA. En hassas, karmaşık ve pahalı olarak kabul edilir.
Amaç
İmmünoblot nedir? Bu, virüse karşı antikorların varlığı açısından kan serumunu test etmek için kullanılan bir laboratuvar yöntemidir. Çalışma sırasında bir uzman öncelikle viral proteinleri bir jel içerisinde ayırarak nitroselüloz membrana aktarıyor. İmmünoblotlama prosedürünün amacı HIV'i tespit etmektir. Farklı aşamalar. İlk aşamada, kendisini oluşturan kısımlardan saflaştırılan virüs elektroforeze tabi tutulur ve bileşiminde yer alan antijenler moleküler ağırlığa göre ayrılır.
Canlı bir hücrede çoğalır ve genetik bilgisini ona aktarır. Bu aşamada kişi, eğer enfeksiyon kapmışsa, HIV virüsünün taşıyıcısı haline gelir. Hastalığın özelliği şu ki uzun zamandır kendini hiç göstermeyebilir. Virüs lenfositleri yok eder, dolayısıyla kişinin bağışıklığı azalır ve vücut enfeksiyonlara karşı koyamaz hale gelir. HIV doğru ve zamanında tedavi edilirse hasta ileri yaşlara kadar yaşayacaktır. Terapi eksikliği kaçınılmaz olarak ölümcül sonuç. Enfeksiyon anından itibaren, ancak tedavi edilmezse, maksimum yaşam süresi on yıldan fazla değildir.
Özellikler
İmmünoblot analizi, birinci ve ikinci tip HIV antijenlerine karşı antikorların varlığını belirlemenizi sağlayan güvenilir bir yöntemdir. Bir kişiye virüs bulaşmışsa, iki hafta içinde antikorlar ortaya çıkar ve bu antikorlar çok daha sonra tespit edilebilir. HIV'in özelliği, antikor miktarının hızla artması ve hastanın kanında kalmasıdır. Bunlar mevcut olsa bile hastalık iki veya daha fazla yıl boyunca kendini göstermeyebilir. ELISA yöntemi, hastalığın varlığını her zaman doğru bir şekilde belirlemez; bu nedenle, enzim immünoanalizinin pozitif bir sonuç göstermesi durumunda, immünoblotlama ve PCR kullanılarak sonuçların doğrulanması gerekir.
Kullanım endikasyonları
“İmmünoblot”un ne olduğu zaten keşfedildi, ancak bu çalışma kimin için reçete ediliyor? İmmünoblotlama kullanılarak test edilmenin nedeni pozitif bir ELISA sonucudur. Ameliyat olacak hastalara enzim immunoassay yapılması gerekmektedir. Ayrıca hamilelik planlayan kadınların yanı sıra sağlık sorunları olan herkese de test yapılmalıdır. seks hayatı. ELISA sonuçları şüpheli ise HIV'li hastalara immünoblotlama reçete edilir. Aşağıdakiler doktora başvurmanın nedenleri olabilir: endişe verici semptomlar:
- ani kilo kaybı;
- zayıflık, performans kaybı;
- üç hafta süren bağırsak rahatsızlığı (ishal);
- vücudun dehidrasyonu;
- ateş;
- arttırmak Lenf düğümleri vücutta;
- kandidiyazis, tüberküloz, zatürre, toksoplazmoz gelişimi, herpesin alevlenmesi.
Hastanın test öncesi hazırlık yapmasına gerek yoktur venöz kan. Testten 8-10 saat önce yemek yememelisiniz. Kan bağışından bir gün önce alkollü veya kahveli içecekler içilmesi, yorucu fiziksel egzersiz yapılması veya kaygı yaşanması önerilmez.
Analiz nerede yapılmalı?
HIV testini nerede yaptırabilirim? ELISA ve immunoblot çalışmaları şehrin özel kliniklerinde yapılıyor, sonuçlar 24 saat içerisinde çıkıyor. Acil teşhis de mümkündür. Kamu sağlık kurumlarında, Rusya Federasyonu mevzuatına uygun olarak ELISA testleri ve immünoblotlama ücretsiz olarak yapılmaktadır. Kontrol edilmesi zorunludur bulaşıcı hastalıklar hamile kadınlar ve hastaneye kaldırılan veya ameliyat olan hastalar.
Araştırma nasıl yürütülüyor?
ELISA analizi nasıl yapılır? Pozitif/negatif immünoblot, enzim immünolojik testinin sonuçlarını doğrular veya çürütür. Araştırma prosedürü oldukça basittir. Uzman, beş dakikadan fazla sürmeyen venöz kanı alır. Örnek alındıktan sonra enjeksiyon bölgesi dezenfekte edilmeli ve yara bandı ile kapatılmalıdır. Örnekleme aç karnına yapılır, bu nedenle işlemden sonra bir bar bitter çikolata yemek veya tatlı bir sıcak içecek içmek zarar vermez.
Bir kamu sağlık kurumuna ücretsiz test için sevk edilmek üzere bir pratisyen hekime gitmeniz gerekir. Genel olarak immünoblotlama, örnekleme yöntemi açısından diğer kan testlerinden farklı değildir. Araştırma metodolojisi basittir. Bir kişinin kanında virüs varsa vücut onu yok edecek antikorlar üretmeye başlar. Her virüsün kendine ait antijen proteinleri vardır. Bu antikorların tespiti immünoblotlama tekniğinin temelidir.
Fiyat
Analizin maliyeti ne kadar? HIV için immünoblot ucuz bir test değildir. Ortalama olarak, enzim immünoassay yöntemlerini kullanan bir tarama muayenesinin maliyeti 500 ila 900 ruble arasındadır. İmmünoblotlama, maliyeti üç ila beş bin ruble arasında olan bir doğrulama çalışmasıdır. Daha karmaşık yöntemlerçok daha pahalıdır. Örneğin, yaklaşık 12.000 ruble ödemeniz gerekecek.
Sonucun yorumlanması
HIV enfeksiyonunu teşhis etmek için en yaygın yöntemler, enzime bağlı immünosorbent analizleri ve immünoblotlardır. Kan serumunda immün yetmezlik virüsüne karşı antikorları belirlemek için kullanılırlar. Enfeksiyonun varlığı genellikle iki testle doğrulanır: tarama ve doğrulama. Çalışma sonuçlarının yorumlanması, aynı zamanda tanı koyan ve tedaviyi öneren bir doktor tarafından yapılmalıdır. İmmünoblot pozitifse, bu, insan vücudunda bir virüsün mevcut olduğu anlamına gelir.
Olumlu bir sonuç bir sebep olmamalıdır. kendi kendine tedaviÇünkü her hasta hastalığın farklı bir tablosuna sahip olabilir. Niteliksel analiz tarama ve doğrulamayı içerir. Hastada virüs yoksa sonuç “negatif” olarak belirtiliyor. Tarama sonucu tespit edilmesi durumunda ek doğrulama çalışması yapılır. İmmünoblot, taramayı doğrulayan veya çürüten bir testtir. Test şeridinde belirli bölgelerde (proteinlerin yerleri) koyulaşma görülürse, HIV tanısı konur. Sonuçların şüpheli olması durumunda testler üç ay içerisinde gerçekleştirilir.
Aşağıdakilere uyarsanız bağışıklık yetersizliği virüsü enfeksiyonunu önleyebilirsiniz: belirli kurallar: Gündelik seksten kaçının, temas sırasında prezervatif kullanın, uyuşturucu kullanmayın. Hamile bir kadında hastalık tespit edilirse, ilgili hekimin tavsiyelerine harfiyen uymak ve virüs varlığı açısından muayene olmayı unutmamak önemlidir.
Kan bir damardan alınır. Daha sonra çalışma talimatlara göre devam eder:
- numune, elektroforetik ayırma için bir jel içine yerleştirilir, bu da virüse duyarlı spesifik proteinlerin elde edilmesini sağlar;
- işlenmiş jele nitroselüloz kağıt uygulanır;
- Hazırlanan numune kurutma aparatına yerleştirilir.
Belirli enzimleri tanımlamak için kağıdın laboratuvar testleri için uygun şekilde hazırlanması gerekir. Bunu yapmak için üzerine antikorlar ve etiketli bir radyoaktif konjugat uygulanır. Çalışmanın sonucu görsel olarak değerlendirilerek oluşturulan enzim zincirleri incelenir.
Sonuçların kodunun çözülmesi
Manipülasyondan sonra kağıt üzerinde çizgiler kalıyor. Konjugasyonun meydana geldiği, yani uygulanan ilacın virüs proteini ile reaksiyona girdiği yerde bulunurlar. Bu şekilde proteinin kısımlarını tespit edebilirsiniz:
- HIV-1'in çekirdeğinden – p17, p24, p55;
- patojen HIV-2 – p16, p26, p56.
İmmünoblotlama sonuçları, 3 HIV-1 veya HIV-2 proteininden 2'sinin tespit edilmesi durumunda pozitif kabul edilir. Western blot (çalışmanın ikinci adı) sıklıkla doğrulamak için kullanıldığından pozitif ELISA ardından reaksiyon spesifik proteinler açısından kontrol edilir: gp120/160, gp41 veya p24. Bunlar üç ana AIDS geninin (gag, pol ve env) bir parçasıdır. İlk tanı sırasında sadece p25, gp110/120 ve gp160 proteinleri için test yapılır, pozitif sonuç çıkması durumunda p24 için test yapılır. Proteinin bu kısmı virüsün erken aşamada tespit edilmesini sağlar.
Olumlu bir sonuç, daha karmaşık teşhisler aramanın bir nedenidir. Yalnızca 3 durumda yanlıştır:
- olan hastalarda yüksek seviye bilirubin;
- viral antijenlerle temas halinde;
- bağ dokusu patolojileri için.
Hastada AIDS proteinlerine karşılık gelen çizgiler yoksa sonuç negatif olarak değerlendirilir. Bu, kişinin HIV ile enfekte olmadığı veya pencere döneminde olduğu anlamına gelir. İkincisi, virüsün vücuda girmiş olabileceği, ancak henüz içinde gelişmediği anlamına gelir. Teşhis doğruluğunu arttırmak için test sistemleri kullanılır:
- Rekombinant-HIV;
- Antijen;
- Pepto ekran.
Bunları kontrol ettikten sonra, örnekte gp120, gp160, Sp4 proteinleri bulunmazsa sonuç negatif kabul edilir.
Başka bir yorumlama seçeneği daha var - tarafsız veya şüpheli bir sonuç. HIV ile enfekte bir partnerle cinsel temasta bulunanlarda ortaya çıkar. Kanlarında gp120 ve gp160 proteinlerine karşı antikorlar bulunur. Ayrıca enfeksiyon asemptomatik olduğunda, yani hareketsiz durumda olduğunda, lekeleme sırasında şüpheli bir cevap verilir.
Şüpheli bir sonucun iyice kontrol edilmesi önemlidir. Bu amaçla, kan serumunun dinamik bir çalışması, yani altı ay boyunca immünoblotlama ve ELISA yöntemleri kullanılarak düzenli kontroller kullanılır. Ayrıca atandı ek sınavlar, çünkü kanda otoantikorların ve bağışıklık komplekslerinin varlığı şunlara bağlı olabilir:
- bulaşıcı hastalıklar;
- kanserli tümörlerin varlığı;
- alerjiler.
İmmünoblotlama (immunoblot, Western Blot, western blot)- bir enzim bağlantılı immünosorbent tahlilini (ELISA), virüs antijenlerinin bir nitroselüloz şeridi (şerit) üzerine ön elektroforetik aktarımıyla birleştirir.
Bu güzel bilimsel isimde, "leke" büyük olasılıkla "leke" olarak çevrilmiştir ve "batı" olarak "batı" bu "lekenin" kağıt üzerinde soldan sağa yayılma yönünü yansıtmaktadır. coğrafi harita bu batıdan doğuya doğru yöne karşılık gelir.” "İmmun blot" yönteminin özü, immünoenzim reaksiyonunun, bir antijen karışımı ile değil, daha önce immünoforez ile nitroselüloz membranın yüzeyinde moleküler ağırlığa göre konumlandırılmış fraksiyonlara dağıtılan HIV antijenleri ile gerçekleştirilmesidir. Sonuç olarak, antijenik determinantların taşıyıcıları olan ana HIV proteinleri, enzime bağlı bir immünosorbent reaksiyonu sırasında ortaya çıkan ayrı şeritler halinde yüzey üzerine dağıtılır.
Immunoblot birkaç aşama içerir:
Şerit hazırlığı. Daha önce saflaştırılan ve bileşen bileşenlerine yok edilen immün yetmezlik virüsü (HIV), elektroforeze tabi tutulur ve HIV'i oluşturan antijenler, moleküler ağırlığa göre ayrılır. Daha sonra, kurutma yöntemi kullanılarak (fazla mürekkebin bir kurutma kağıdına sıkılmasına benzer), antijenler, artık gözle görülemeyen, HIV'e özgü bir antijen bantları spektrumu içeren bir nitroselüloz şeridine aktarılır.
Örnek inceleme. Test materyali (serum, hastanın kan plazması vb.) nitroselüloz şeridine uygulanır ve numunede spesifik antikorlar varsa, bunlar tam olarak karşılık gelen (tamamlayıcı) antijenik bantlara bağlanır. Daha sonraki manipülasyonların bir sonucu olarak, bu etkileşimin sonucu görselleştirilir, görünür hale getirilir.
Sonucun yorumlanması. Nitroselüloz plakanın belirli alanlarında bantların varlığı, test edilen serumda kesin olarak tanımlanmış HIV antijenlerine karşı antikorların varlığını doğrular.
Şerit A - Pozitif Kontrol
Şerit B - Zayıf Pozitif Kontrol
Şerit C - Negatif Kontrol
Şerit D - Pozitif örnek (HIV-1'e karşı antikorlar tespit edildi)
Şu anda immünoblotlama (immünoblot), test serumunda virüse özgü antikorların varlığını doğrulamanın ana yöntemidir. Bazı HIV enfeksiyonu vakalarında serokonversiyon meydana gelmeden önce spesifik antikorlar daha etkili bir şekilde tespit edilir. immünoblotlama ELISA'dan daha. İmmünoblotlama yöntemini kullanarak çalışırken, AIDS hastalarının serumlarında çoğunlukla gp 41'e karşı antikorların tespit edildiği ve önleyici amaçlarla incelenen kişilerde p24'ün tespit edilmesinin, HIV enfeksiyonu olup olmadığını belirlemek için ek araştırma gerektirdiği bulunmuştur. Genetik olarak tasarlanmış rekombinant proteinlere dayalı immünoblotlama test sistemlerinin, saflaştırılmış viral lizata dayalı geleneksel sistemlerden daha spesifik olduğu kanıtlanmıştır. Bir rekombinant antijen kullanıldığında, dağınık değil, açıkça tanımlanmış, kayıt ve değerlendirme için kolayca erişilebilen dar bir antijen şeridi oluşturulur.
HIV-1 ile enfekte olmuş kişilerin serumlarında aşağıdaki ana proteinlere ve glikoproteinlere karşı antikorlar ortaya çıkar: yapısal zarf proteinleri (env) - gp160, gp120, gp41; çekirdek (gag) - p17, p24, p55 ve ayrıca viral enzimler (pol) - p31, p51, p66. Env'ye karşı antikorlar HIV-2 için tipiktir - gp140, gp105, gp36; şaka - p16, p25, p56; pol - p68.
Reaksiyonun özgüllüğünü belirlemek için gerekli laboratuvar yöntemleri arasında en yaygın olarak tanınan, HIV-1 zarf proteinlerine (gp41, gp120, gp160 ve HIV-2 - gp36, gp105, gp140) karşı antikorların saptanmasıdır.
DSÖ, herhangi iki HIV glikoproteinine karşı antikorların immünoblotlama yoluyla tespit edildiği pozitif serumları dikkate almaktadır. Bu önerilere göre, zarf proteinlerinden yalnızca biriyle (gp 160, gp 120, gp 41) kombinasyon halinde veya diğer proteinlerle reaksiyon olmadan reaksiyon varsa, sonuç şüpheli kabul edilir ve bir test kullanılarak yeniden test yapılması önerilir. farklı bir seriden veya farklı bir şirketten kit. Bundan sonra bile sonuç şüpheli kalırsa, 6 ay süreyle gözlem önerilir (3 ay sonra araştırma).
Kullanılabilirlik olumlu tepki p24 antijeni ile olan antikorlar bazen ilk önce bu proteine karşı ortaya çıktığı için bir serokonversiyon periyodunu gösterebilir. Bu durumda klinik ve epidemiyolojik verilere bağlı olarak çalışmanın en az 2 hafta sonra alınan serum örneğiyle tekrarlanması önerilir ve HIV enfeksiyonunda eşleştirilmiş serumların test edilmesinin gerekli olduğu durum da tam olarak budur.
Env proteinleri ile reaksiyon olmaksızın gag ve pol proteinleri ile pozitif reaksiyonlar erken serokonversiyonu yansıtabilir ve aynı zamanda HIV-2 enfeksiyonunu veya spesifik olmayan bir reaksiyonu da gösterebilir. HIV-2 testi sonrasında bu sonuçları alan kişilere 3 ay sonra (6 ay içinde) tekrar test yapılır.
İmmünoblotlama (immunoblot, Western Blot, western blot)- bir enzim bağlantılı immünosorbent tahlilini (ELISA), virüs antijenlerinin bir nitroselüloz şeridi (şerit) üzerine ön elektroforetik aktarımıyla birleştirir.
Bu güzel bilimsel isimle, "leke" büyük olasılıkla "leke" olarak çevrilir ve "batı" - çünkü "batı" bu "leke" nin kağıt üzerindeki dağılım yönünü soldan sağa, yani bir kağıt üzerinde yansıtır. coğrafi harita bu batıdan doğuya doğru yöne karşılık geliyor. " "İmmun blot" yönteminin özü, immünoenzim reaksiyonunun, bir antijen karışımı ile değil, daha önce immünoforez ile nitroselüloz membranın yüzeyinde moleküler ağırlığa göre konumlandırılmış fraksiyonlara dağıtılan HIV antijenleri ile gerçekleştirilmesidir. Sonuç olarak, antijenik determinantların taşıyıcıları olan ana HIV proteinleri, enzime bağlı bir immünosorbent reaksiyonu sırasında ortaya çıkan ayrı şeritler halinde yüzey üzerine dağıtılır.
Immunoblot birkaç aşama içerir:
Şerit hazırlığı. Daha önce saflaştırılan ve bileşen bileşenlerine yok edilen immün yetmezlik virüsü (HIV), elektroforeze tabi tutulur ve HIV'i oluşturan antijenler, moleküler ağırlığa göre ayrılır. Daha sonra, kurutma yöntemi kullanılarak (fazla mürekkebin bir kurutma kağıdına sıkılmasına benzer), antijenler, artık gözle görülemeyen, HIV'e özgü bir antijen bantları spektrumu içeren bir nitroselüloz şeridine aktarılır.
Örnek inceleme. Test materyali (serum, hastanın kan plazması vb.) nitroselüloz şeridine uygulanır ve numunede spesifik antikorlar varsa, bunlar tam olarak karşılık gelen (tamamlayıcı) antijenik bantlara bağlanır. Daha sonraki manipülasyonların bir sonucu olarak, bu etkileşimin sonucu görselleştirilir, görünür hale getirilir.
Sonucun yorumlanması. Nitroselüloz plakanın belirli alanlarında bantların varlığı, test edilen serumda kesin olarak tanımlanmış HIV antijenlerine karşı antikorların varlığını doğrular.
Şerit A - Pozitif Kontrol
Şerit B - Zayıf Pozitif Kontrol
Şerit C - Negatif Kontrol
Şerit D - Pozitif örnek (HIV-1'e karşı antikorlar tespit edildi)
Şu anda immünoblotlama (immünoblot), test serumunda virüse özgü antikorların varlığını doğrulamanın ana yöntemidir. Bazı HIV enfeksiyonu vakalarında, serokonversiyon meydana gelmeden önce, spesifik antikorlar, ELISA'dan ziyade immünoblotlama ile daha etkili bir şekilde tespit edilir. İmmünoblotlama yöntemini kullanarak çalışırken, AIDS hastalarının serumlarında çoğunlukla gp 41'e karşı antikorların tespit edildiği ve önleyici amaçlarla incelenen kişilerde p24'ün tespit edilmesinin, HIV enfeksiyonu olup olmadığını belirlemek için ek araştırma gerektirdiği bulunmuştur. Genetik olarak tasarlanmış rekombinant proteinlere dayalı immünoblotlama test sistemlerinin, saflaştırılmış viral lizata dayalı geleneksel sistemlerden daha spesifik olduğu kanıtlanmıştır. Bir rekombinant antijen kullanıldığında, dağınık değil, açıkça tanımlanmış, kayıt ve değerlendirme için kolayca erişilebilen dar bir antijen şeridi oluşturulur.
HIV-1 ile enfekte olmuş kişilerin serumlarında aşağıdaki ana proteinlere ve glikoproteinlere karşı antikorlar ortaya çıkar: yapısal zarf proteinleri (env) - gp160, gp120, gp41; çekirdek (gag) - p17, p24, p55 ve ayrıca viral enzimler (pol) - p31, p51, p66. Env'ye karşı antikorlar HIV-2 için tipiktir - gp140, gp105, gp36; şaka - p16, p25, p56; pol - p68.
Reaksiyonun özgüllüğünü belirlemek için gerekli laboratuvar yöntemleri arasında en yaygın olarak tanınan, HIV-1 zarf proteinlerine (gp41, gp120, gp160 ve HIV-2 - gp36, gp105, gp140) karşı antikorların saptanmasıdır.
DSÖ, herhangi iki HIV glikoproteinine karşı antikorların immünoblotlama yoluyla tespit edildiği pozitif serumları dikkate almaktadır. Bu önerilere göre, zarf proteinlerinden yalnızca biriyle (gp 160, gp 120, gp 41) kombinasyon halinde veya diğer proteinlerle reaksiyon olmadan reaksiyon varsa, sonuç şüpheli kabul edilir ve bir test kullanılarak yeniden test yapılması önerilir. farklı bir seriden veya farklı bir şirketten kit. Bundan sonra bile sonuç şüpheli kalırsa, 6 ay süreyle gözlem önerilir (3 ay sonra araştırma).
p24 antijeni ile pozitif bir reaksiyonun varlığı, bazen bu proteine karşı antikorlar ilk önce ortaya çıktığı için bir serokonversiyon periyoduna işaret edebilir. Bu durumda klinik ve epidemiyolojik verilere bağlı olarak çalışmanın en az 2 hafta sonra alınan serum örneğiyle tekrarlanması önerilir ve HIV enfeksiyonunda eşleştirilmiş serumların test edilmesinin gerekli olduğu durum da tam olarak budur.
Env proteinleri ile reaksiyon olmaksızın gag ve pol proteinleri ile pozitif reaksiyonlar erken serokonversiyonu yansıtabilir ve aynı zamanda HIV-2 enfeksiyonunu veya spesifik olmayan bir reaksiyonu da gösterebilir. HIV-2 testi sonrasında bu sonuçları alan kişilere 3 ay sonra (6 ay içinde) tekrar test yapılır.
İmmünoblotlama –(İngilizce “leke” - spottan) - bilinen serumları (veya antijenleri) kullanarak antijenleri (veya antikorları) tanımlamak için bir yöntem. Jel elektroforezi ve ELISA'nın bir kombinasyonudur. Başlangıçta bakteri hücreleri veya viryonlar ultrason kullanılarak yok edilir ve daha sonra virüsün veya bakteri hücrelerinin tüm antijenleri elektroforez ile ayrılır ve özel bir nitroselüloz film üzerinde ticari bir reaktif elde edilir. İmmünoblotlama yapılırken, incelenen hastanın serumu bilinen antijenlere sahip bir filme uygulanır. Bağlanmamış antikorların inkübasyonu ve yıkanmasından sonra, ELISA'ya geçin - bir enzimle etiketlenmiş insan immünoglobulinlerine yönelik antiserum ve filme, enzimle etkileşime girdiğinde renk değiştiren bir kromojenik substrat uygulanır. Antijen-antikor-antiserum-immünoglobulin-enzim komplekslerinin varlığında taşıyıcı üzerinde renkli noktalar belirir. İmmünoblotlama yöntemi, antikorları ayrı ayrı tespit etmenizi sağlar. çeşitli antijenler patojen (örneğin, HIV enfeksiyonunda immünoblotlama gp120, gp24 ve diğer virüs antijenlerine karşı antikorları tespit eder).
Radyoimmünoanaliz (RIA)
Yöntem, radyonüklid etiketli bir antijen veya antikor kullanılarak bir antijen-antikor reaksiyonuna dayanmaktadır. Etiket olarak 125I, 14C, 3H, 51Cr ve diğer radyonüklidler kullanılmaktadır. Ortaya çıkan bağışıklık kompleksleri sistemden izole edilir ve radyoaktiviteleri sayaçlarda (β-radyasyonu) belirlenir. Radyasyonun yoğunluğu bağlı antijen ve antikor moleküllerinin sayısıyla doğru orantılıdır.
RIA'nın polistiren panellerin kuyucuklarına emdirilmiş etiketli antikorları veya antijenleri kullanan katı fazlı versiyonu yaygındır.
RIA mikropların, virüslerin antijenlerini tespit etmek için kullanılır. çeşitli hormonlar, enzimler, tıbbi maddeler, immünoglobulinlerin yanı sıra test materyalinde 10-12–10-15 g/l'lik küçük konsantrasyonlarda bulunan diğer maddeler.
Kontrol soruları
İmmün bakteriyoliz reaksiyonu: ne tür bir reaksiyondur; antijen nedir, antikor nedir, reaksiyon mekanizması, üretim yöntemleri, pratik kullanım. İmmün hemoliz reaksiyonu: gerekli bileşenler, prosedür; kontroller, pratik uygulama. Bir jelde lokal hemoliz reaksiyonu (Jerne reaksiyonu): reaksiyonun prensibi, formülasyon yöntemi, pratik uygulama. Kompleman fiksasyonu reaksiyonu: reaksiyon prensibi; bağışıklık serumu belirli bir antijenle etkileşime girdiğinde ne oluşur; Bu etkileşim sırasında tamamlayıcı mevcutsa ne olur? Antijen ile antikorlar arasında spesifik bir afinite yoksa komplemanın akıbeti ne olur? Tamamlayıcıya ne olduğunu belirlemek için hangi reaksiyon kullanılabilir? bu özel reaksiyonun neden kullanıldığı; RSC'nin görünür pozitif sonucu nedir? Neden? RSC'nin ilk aşamasında tamamlayıcının hangi özelliği kullanılır? İkinci aşamada mı? Eğer sonuç RSC hemolizdir, ne anlama gelir - pozitif veya olumsuz sonuç? Sonuçları açıklayın: RSK+ + + +, RSK+ + +, RSK+ +, RSK+. Birinci RSK sisteminin bileşenlerini ve ikinci RSK sisteminin bileşenlerini adlandırın. Test serumunun neden etkisiz hale getirilmesi gerekiyor? Kompleman nasıl titre edilir? Hemolitik serum: Ne içerir, nasıl elde edilir, titresi nedir ve nasıl belirlenir? RSC bileşenlerini elde etmek için hangi hayvanlar kullanılır? Soğukta RSC kurma metodolojisi. Aşağıdaki reaksiyonlardan hangisinin evrelemesi kompleman katılımını gerektirir: çökelme, topaklanma, aglütinasyon, eksik antikorların tespiti, immün bakteriyoliz, immün hemoliz, Jerne, RSC? İmmünofloresan reaksiyonu (RIF) - doğrudan Koons reaksiyonundaki olayların sırasını gösterir; gerekli malzemeler. Antijen nedir, antikor nedir, antikorlar neyle etiketlenir, reaksiyonun sonucu nasıl dikkate alınır, pozitif sonuç nasıl görünür? Pratik uygulama - Bu reaksiyon kullanılarak ne belirlenebilir? Dolaylı immünofloresan reaksiyonu - bu reaksiyon sırasındaki olayların sırasını, gerekli bileşenleri, antijenin ne olduğunu, hangi immün serumun kullanıldığını belirtin; pratik kullanım; Dolaylı RIF'nin doğrudan reaksiyona göre avantajı. Bağlantılı immünosorbent tahlili(ELISA) – reaksiyon prensibi; gerekli malzemeler; test edilen materyaldeki bir antijeni saptamak için bir reaksiyon gerçekleştirirken olayların sırasını belirtir; gerekli malzemeler; Sonuç olumlu olduğunda ne olur, nasıl görünür? Test serumundaki antikorları tespit etmek için ELISA gerçekleştirirken yapılacak işlemlerin sırasını belirtin; gerekli malzemeler; sonuç olumlu olursa ne olur? İmmünoblotlama – reaksiyon prensibi; ana aşamalar; gerekli malzemeler; sonucun nasıl dikkate alındığı; Reaksiyonun faydaları. Radyoimmunoassay (RIA) - reaksiyonun ana aşamaları nelerdir; Antikor veya antijenler neyle etiketlenir, sonuç nasıl dikkate alınır? İmmünoelektron mikroskobu - yöntemin prensibi; ana aşamalar; gerekli malzemeler; Antikorlar neyle etiketlenir? reaksiyonun sonucunun nasıl dikkate alındığı. Hareketsizleştirme reaksiyonları – yöntemin prensibi, ayarlama tekniği, bileşenler, sonuçların kaydedilmesi.
Bireysel çalışma sürecinde tamamlanması gereken görevler.
Bu konu kapsamında tartışılan reaksiyonlarla ilgili olarak "Bağışıklık reaksiyonları" tablosunu doldurun.
Bağışıklık reaksiyonları
Pratik bir ders sırasında öğrenci çalışması
RSK'nın 1. aşamasını kurarak çalışmaya hemen başlayın, ancak bunu daha sonra not defterinize yazın (aşağıya bakın).
1. İmmün hemoliz reaksiyonu. İmmün hemolizin gösteri reaksiyonunu görüntüleyin, diyagram şeklinde çizin, deney ve kontrol tüplerindeki sonucu açıklayın.
2. Tamamlayıcı fiksasyon reaksiyonu
a) RSK'yi tabloya göre ayrıştırın;
b) bir deftere RSC kurulumunun bir diyagramını tablo şeklinde çizin;
c) RSK'nın ikinci aşamasını koyun (ilk aşama dersin başına konur);
d) RSC için gerekli teşhis hazırlıklarını analiz etmek;
d) sonucu dikkate almak. Test serumunda spesifik antikorların varlığına ilişkin bir sonuç formüle edin.
3. İmmünofloresan reaksiyonu. Tabloyu inceleyin, not defterinizde reaksiyonun bir diyagramını yapın; teşhis serumlarına bakın; serumun ne içerdiğini, nasıl hazırlandığını, hangi reaksiyon için (doğrudan veya dolaylı RIF) kullanıldığını belirleyin. Floresan mikroskobunda RIF'in gösteri sonucuna bakın.
4. Enzime bağlı immünosorbent tahlili (ELISA). Defterinizde iki versiyonda bir reaksiyon oluşturmak için bir şema çizin: incelenen materyaldeki bir antijeni tespit etmek ve serumdaki antikorları tespit etmek için. HIV ve Hepatit B İçerik Kitini inceleyin. Her bir bileşenin ne içerdiğini ve ne için kullanıldığını tanımlayın.
5. İmmünoblotlama. Defterinizde reaksiyonun bir diyagramını yapın; gösteriyi izleyin - reaksiyonun sonucu.
6. Radyoimmünoanaliz (RIA). Defterinizde reaksiyonun bir diyagramını yapın.
7. İmmün elektron mikroskobu (IEM). Gösterimi izleyin - reaksiyonun sonucunu not defterinizde reaksiyonun bir şemasını çizin, antijeni (virüs) ve etiketli antikorları oklarla belirtin.
İmmünoblotlama, proteinleri tespit etmek için elektroforez ve ELISA veya RIA kombinasyonuna dayanan oldukça hassas bir yöntemdir. İmmünoblotlama şu şekilde kullanılır: teşhis yöntemi HIV enfeksiyonu vb. için
Genel anlamda immünoblotlama, kovalent bağlarla bağlandıkları katı bir membran desteğine aktarılan protein karışımının analizini ve ardından immün algılamayı ifade eder.
Substrata doğrudan uygulanan protein karışımını - nokta leke analizi - veya elektrofokuslama, disk elektroforezi veya iki boyutlu elektroforez - Western blot analizi ile ön fraksiyonlamasından sonra analiz edebilirsiniz.
Patojen antijenleri poliakrilamid jel elektroforezi kullanılarak ayrılır, daha sonra jelden aktifleştirilmiş kağıt veya nitroselüloz membrana aktarılır ve ELISA kullanılarak geliştirilir.
Şirketler bu tür şeritleri antijen "lekeleri" ile üretiyorlar. Bu şeritlere hastanın serumu uygulanır. . Daha sonra inkübasyondan sonra hasta bağlanmamış antikorlardan yıkanır ve bir enzimle işaretlenmiş insan immünoglobulinlerine karşı serum uygulanır. . Şerit üzerinde oluşan kompleks (antijen + hasta antikoru + insan Ig'sine karşı antikor), bir enzimin etkisi altında renk değiştiren bir kromojenik substrat eklenerek tespit edilir.
Bu metodoloji aynı zamanda hedef klonlanmış gen ürünlerini ifade eden bakteri, faj veya virüs klonlarının seçilmesi için de kullanılır.
Proteinlerin membrana transferi pasif olarak veya elektrotransfer ekipmanı kullanılarak gerçekleştirilir. Membrana protein transferinin verimliliği, proteinlerin moleküler ağırlığı, jel gözenekliliği, transfer süresi ve kullanılan tampon çözeltisinin (trans-tampon) bileşimi gibi birçok faktörden etkilenir.
Deneyin amaçlarına ve koşullarına bağlı olarak, transfer koşulları aşağıdakileri sağlayacak şekilde seçilir: en iyi sonuçlar. Substrat olarak nitroselüloz, poliviniliden diflorür (PVDF) veya pozitif yüklü naylon membranlar yaygın olarak kullanılır. Nitroselüloz 1 cm2 başına 80 – 100 µg proteine kadar bağlanabilmektedir.
Düşük molekül ağırlıklı proteinler (molekül ağırlığı 20 kDa'dan az olan) yıkama sonucunda kaybolabilir.Bu, karşılık gelen DNA kısıtlama fragmanlarının uzunluklarına dayalı olarak belirli genetik lokusların polimorfizminin ön çalışmasını mümkün kılar.
Ek olarak, Southern hibridizasyonunu kullanarak, hedef genin, iç kısmındaki belirli bir kısıtlama enzimi tarafından hidroliz bölgesine sahip olup olmadığını kolayca öğrenebilirsiniz; bu, incelenen genom bölgesinin klonlanması için en uygun stratejiyi seçmenize olanak tanır.
Benzer bir şema kullanılarak RNA molekülleri agaroz jelden nitroselüloz filtreye aktarılabilir. Bu yönteme Southern blotlamanın aksine Northern blotlama adı verildi çünkü Güney soyadı ingilizce dili"güney" anlamına gelir.
Proteinlerin jelden filtrelere aktarılmasına Western blotlama adı verildi. Sodyum dodesil sülfat (SDS) çözeltisinde denatüre edilmiş büyük proteinler (>100 kDa), eğer trans tamponunda etanol mevcutsa membrana zayıf bir şekilde aktarılabilir. Alkol, proteinlerin SDS-poliakrilamid jelden transferini önemli ölçüde iyileştirir, ancak jeldeki gözenekleri daraltır, bu da büyük proteinlerin tutulmasına yol açar.
PVDF membranı immün algılama için optimize edilmiştir ve çok düşük düzeyde spesifik olmayan bağlanma ile 160 μg/cm2'ye kadar spesifik olarak bağlanmış proteinleri tutabilme kapasitesine sahiptir.
İmmünoblotlama
Bu zarın önemli bir özelliği tekrar tekrar kullanılma olasılığıdır. Zeta-Probe naylon membranları, alkol yokluğunda SDS proteinlerini etkili bir şekilde bağlar ve bu bağlanma, sonraki tedavilere dirençlidir. Düşük molekül ağırlıklı proteinler de etkili bir şekilde tutulur. Zeta-Probe membranları, cm2 başına yaklaşık 480 μg proteinlik yüksek bağlama kapasitesiyle, test karışımlarında eser miktarda proteinin tespit edilmesini sağlar.
Antijen membran üzerinde immobilize edildikten sonra kalan bağlanma bölgeleri jelatin, sığır serum albümini veya yağsız süt solüsyonlarıyla bloke edilir.
Daha sonra membran, incelenen antijene karşı poliklonal veya monoklonal antikorlardan oluşan bir çözelti içinde inkübe edilir. Bağlanmamış antikorlar yıkandıktan sonra membran, alkalin fosfataz (AP) veya yaban turpu peroksidazı (HRP) enzimlerinin anti-tür antikorlarla (tavşan, fare veya insan immünoglobülinlerine karşı keçi antikorları) birleşimi olan ikincil antikorlardan oluşan bir çözelti içinde inkübe edilir. ) veya A proteinleri (Staphylococcus aureus proteini) veya G (Streptococcus sp. proteini), immünoglobulinlerin Fc bölgesi için yüksek afiniteye sahiptir.
Oluşan bağışıklık komplekslerinin tespiti kimyasal veya kemilüminesan olarak gerçekleştirilir. Substratlar Kimyasal reaksiyon Alkalin fosfataz konjugatları kullanırken 5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfat (BCIP) veya mavi tetrazolyum (NBT) kullanın ve yaban turpu peroksidaz konjugatları kullanırken 4-kloro-1-naftol ve hidrojen peroksit kullanın.
Enzimatik reaksiyonların bir sonucu olarak, antijen-antikor kompleksinin lokalizasyon bölgesinde membran üzerinde renkli bir bant veya nokta oluşur.
Bu yöntemin duyarlılığı AP konjugatları kullanıldığında 100 pg protein, HRP konjugatları kullanıldığında ise 100-500 pg'dir. İmmün komplekslerin kemilüminesan tespiti, 5 pg'dan daha az antijenin tespit edilmesine olanak tanır. Bu yöntemin prensibi, HRP'nin hidrojen peroksit ve siklik diasilhidrazin luminol ile reaksiyona girdiğinde, ışığa duyarlı bir film üzerine kaydedilebilen 428 nm dalga boyunda ışık yayılmasıdır.
İmmünoblotlama (IB) reaksiyonu ELISA temelinde geliştirildi. İmmünokimyasal analizlerin en spesifik ve duyarlı yöntemidir. İmmünoblotlama (İngiliz blot - blot, lekeden) ELISA'yı elektroforez ile birleştirir. HIV'e karşı karmaşık antikorları değil, bireysel yapısal proteinlerine (proteinler p24, glikoproteinler gp120, gp 41, vb.) karşı antikorları tespit etmek için kullanılır. HIV enfeksiyonunu teşhis etmek için uzman (doğrulayıcı) reaksiyonları ifade eder.
Reaksiyon birkaç aşamada gerçekleştirilir:
Virüs, bir poliakrilamid jel içinde elektroforeze tabi tutulan, yani antijenlerin moleküler ağırlığa göre fraksiyonlara ayrılmasına tabi tutulan antijenler (p24, gp120, gp 41, vb.) Bileşenler halinde yok edilir.
2. Jel bir nitroselüloz membran ile kaplanır ve antijen fraksiyonları elektroforez kullanılarak ona aktarılır. Nitroselüloz kurutma kağıdı gibi davranır. Membran şeritler halinde kesilir. Şirketler bu tür şeritleri antijen "lekeleri" ile üretiyorlar.
İmmünoblotlama - ek bir dolaylı yöntem
HIV antijenleriyle kaplı şeritler deneğin serumuna batırılır ve daha sonra bağlanmamış materyali çıkarmak için yıkanır.
4. Stripler peroksidaz ile işaretlenmiş antiglobulin serumu ile inkübe edilir ve yıkanır.
Substrat eklenir ve AG-AT kompleksinin lokalizasyon bölgesine karşılık gelen renkli fraksiyonların (noktaların) sayısı not edilir.
Stripin belirli alanlarında bantların varlığı, test edilen serumda kesin olarak tanımlanmış HIV antijenlerine karşı antikorların varlığını doğrular. Üç HIV antijeninden herhangi ikisine (p24, gp41 ve gp 120) karşılık gelen bantlar membran üzerinde görünüyorsa immünoblotlamanın sonucu pozitif kabul edilir (Şekil 37).
ÇİZİMLER
KULLANILAN REFERANSLARIN LİSTESİ
Ana literatür
Tıbbi mikrobiyoloji, viroloji ve immünoloji: tıp öğrencileri için bir ders kitabı. üniversiteler 2. baskı, rev. ve ek — 702 s. Ed. A.A. Vorobyova. M.: MIA, 2012.
2. Mikrobiyoloji, viroloji ve immünoloji: laboratuvar dersleri için bir el kitabı: ders kitabı/(V.B. Sboychakov ve diğerleri); tarafından düzenlendi V.B. Sboychakova, M.M. Karapats. – M.: GEOTAR-Media, 2014.- 320 s.: hasta.
3. Tıbbi mikrobiyoloji, immünoloji ve viroloji [Elektronik kaynak]: bal için ders kitabı.
üniversiteler - 760 s. — Erişim modu: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN9785299004250.html Korotyaev A.I., Babichev S.A. St.Petersburg: Spetslit, 2010.
4. Tıbbi mikrobiyoloji, viroloji ve immünoloji [Elektronik kaynak]: ders kitabı: 2 cilt / Cilt 1. - 448 s. — Erişim modu: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142241.html Zverev V.V., Boychenko M.N.
M.: Geotar Medya, 2010. .
5. Tıbbi mikrobiyoloji, viroloji ve immünoloji [Elektronik kaynak]: ders kitabı: 2 cilt halinde T. 2. - 480 s. Erişim modu: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142242.html Zverev V.V., Boychenko M.N. M.: Geotar Medya, 2010.
ek literatür
1. İmmünodiyagnostik reaksiyonlar: öğretici/ derleyen: G.K.Davletshina, Z.G.Gabidullin, A.A.Akhtarieva, M.M.Tuigunov, A.K.Bulgakov, T.A.Savchenko, R.F.
Khusnarizanova, Yu.Z. Gabidullin, M.M. Alsynbaev - Ufa: Rusya Sağlık Bakanlığı Yüksek Mesleki Eğitim Devlet Bütçe Eğitim Kurumu BSMU Yayınevi, 2016. - 86 s.
2. Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E.coli, Proteus bakterilerinin birlikte yetiştirilen varyasyonlarının patojenik potansiyelini belirleyen bazı özelliklerin özellikleri: bilimsel yayın / Yu.Z. Gabidullin, R.S. Sufiyarov, I.I. Dolgushin - Ufa, 2015. - 250 sn.
Ana sayfa » İmmünoblot – nedir bu? Bulaşıcı hastalıkların tanısında immünoblot
İmmünoblot - nedir bu? Bulaşıcı hastalıkların tanısında immünoblot
İmmünoblot nedir? Bu, insan viral enfeksiyonlarının laboratuvar tanısı için yaygın bir yöntemdir. HIV varlığını tespit etmenin en doğru ve güvenilir yollarından biridir.
Güvenilirlik açısından, enzime bağlı immünosorbent testinden (elisa) bile daha büyüktür. İmmünoblot sonuçları kesin ve kesin kabul edilir.
İmmünoblot - nedir bu? Bir kişinin HIV taşıdığını anlamak için, laboratuvar yöntemi Antikorların varlığı için kan serumu testleri.
Western blot bölümlerine Western blot bölümleri de denir. Ek bir uzman yöntem olarak insan viral enfeksiyonlarını tespit etmek için kullanılır. Bu, kanda HIV'e karşı antikorların varlığını belirlemenizi sağlayan bir laboratuvar testi olan ELISA'yı doğrulamak için gereklidir. İmmünoblot pozitif ELISA'yı tekrar kontrol eder.
En hassas, karmaşık ve pahalı olarak kabul edilir.
Hedef
İmmünoblot nedir? Bu teknik laboratuvar araştırması virüse karşı antikorların varlığı için kan serumu.
Sırasında özel araştırma jeldeki ve nitroselüloz membrandaki toplam viral proteinler.
İmmünoblotlama (hasta serumunda belirli patojen antijenlerine karşı antikorların tespiti)
Western blot kesiti prosedürünün amacı HIV enfeksiyonunu farklı aşamalarda belirlemektir. İlk aşamada, kendisini oluşturan parçalardan saflaştırılan virüs elektroforeze tabi tutulur ve içerdiği antijenler moleküler ağırlığa bölünür.
İnsan bağışıklık yetersizliği virüsü, genetik bilgisine gömülü canlı hücrelerde çoğalır. Bu aşamada kişi, eğer enfeksiyon kapmışsa, HIV virüsünün taşıyıcısı haline gelir.
Bu hastalığın özelliği uzun süre kendini göstermemesidir. Virüs lenfositleri yok eder, dolayısıyla kişinin bağışıklığı azalır ve vücut enfeksiyonlarla savaşamaz hale gelir.
HIV doğru ve hızlı bir şekilde tedavi edilirse hasta ileri bir yaşa kadar yaşayacaktır. Tedavi eksikliği kaçınılmaz olarak ölüme yol açar. Enfeksiyon anından itibaren, ancak tedavi olmaksızın, maksimum süre on yıldan fazla değildir.
Özellikler
İmmünoblot analizi, birinci ve ikinci tip HIV antijenlerine karşı antikorların varlığını belirlemenizi sağlayan güvenilir bir yöntemdir.
Bir kişiye enfeksiyon bulaşmışsa, iki hafta sonra antikorlar çok daha sonra tespit edilebilir. HIV'in bir özelliği de antikor miktarının hızla artması ve hastanın kanında kalmasıdır. Bunlar mevcut olsa bile hastalık iki veya daha fazla yıl boyunca kendini göstermeyebilir. ELISA yöntemi, hastalığın varlığını her zaman doğru bir şekilde göstermez; enzim immünoanalizinin pozitif bir sonuç göstermesi durumunda PCR ve Western blot bölümlerinin sonuçlarının doğrulanmasını gerektirir.
Endikasyonlar
Ne tür bir "bağışıklık lekesi" zaten keşfedildi, ancak çalışmada hangisi tanıtılıyor?
İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV) testinin nedeni bir immünoblottur. olumlu sonuç ELISA. Ameliyat olacak hastalarda enzim bağlantılı immünosorbent testinden geçmek gerekir. Ayrıca hamilelik planlayan kadınların yanı sıra rastgele davranan kadınların da analizini yapmalısınız. Elisa'nın sonuçları şüpheliyse, HIV enfeksiyonu olan hastalara Western blot bölümleri reçete edilir.
Aşağıdaki endişe verici semptomlar doktora başvurmanın nedeni olabilir: hızlı kilo kaybı; halsizlik, fonksiyon kaybı; üç hafta süren bağırsak bozuklukları (ishal); dehidrasyon; ateş; vücutta genişlemiş lenf düğümleri; kandidiyazis, tüberküloz gelişimi. , pnömoni, toksoplazmoz, herpesin alevlenmesi.
Hastanın venöz kan bağışlamadan önce hazırlık yapmasına gerek yoktur.
Testten 8-10 saat önce yemek yemeyin. Kan bağışından önceki gün alkol veya ağır kahveli içeceklerin tüketilmesi tavsiye edilmez. fiziksel egzersiz, heyecanlı hissediyorum.
Analiz nerede yapılmalı?
HIV testini nerede yaptırabilirim?
Şehirdeki özel kliniklerde yapılan immünoblot analizi ELISA, bir gün içinde sonuç veriyor. Acil teşhis de mümkündür. Kamu kurumlarında, Rusya Federasyonu mevzuatına uygun olarak Elisa ve Western blot bölümlerine ait tıbbi testler ücretsizdir.
Hamilelerde ve hastaneye yatması ya da ameliyat olması gereken hastalarda bulaşıcı hastalıklara yönelik zorunlu tarama Bu test nasıl yapılıyor?
ELISA nasıl yapılır? İmmünoblot pozitif/negatif, elisa sonuçlarını doğrular veya reddeder. Prosedür oldukça basittir. Uzman, beş dakikadan kısa süren venöz kanı toplar.
Örnekleme sonrasında enjeksiyon bölgesi dezenfekte edilmeli ve bir bandajla kapatılmalıdır. Örnekleme aç karnına yapılır, bu nedenle işlemden sonra bir bar bitter çikolata veya tatlı bir sıcak içecek yemekten zarar gelmez.
Bir kamu sağlık kurumuna ücretsiz test için sevk almak için bir terapisti ziyaret etmelisiniz.
Genel olarak immünoblot, toplama açısından diğer kan testlerinden farklı değildir. Araştırma metodolojisi basittir. Bir kişinin kanında bir virüs varsa vücut onu yok edecek antikorlar üretmeye başlar. Her virüs için birçok protein antijeni vardır. Bu antikorların tespiti Western blot kesit yönteminin temelini oluşturur. Fiyat
Analiz ne kadar sürüyor? HIV immünoblot en ucuz testlerden biridir.
Ortalama olarak, immünoassay tarama yöntemleri 500 ila 900 ruble arasında değişmektedir. Western blot bölümleri, maliyeti üç ila beş bin ruble arasında değişen testlerin incelenmesidir. Daha karmaşık yöntemler çok daha pahalıdır. Örneğin polimeraz analizi için zincirleme tepki(PCR) yaklaşık 12.000 ruble ödemeniz gerekecek.
Sonuçların yorumlanması
HIV enfeksiyonunu teşhis etmenin en yaygın yöntemleri, enzime bağlı immünosorbent tahlili ve immünoblottur.
Serumdaki insan immün yetmezlik virüsüne karşı antikorları belirlemek için kullanılırlar. Enfeksiyon genellikle iki testle doğrulanır: tarama ve doğrulama. Sonuçlar, teşhis koyan ve tedaviyi reçete eden bir doktor tarafından yorumlanmalıdır. İmmünoblot pozitifse, bu insan vücudunda bir virüs olduğu anlamına gelir.
Olumlu bir sonuç, bağımsız tedavi için bir neden olmamalıdır, çünkü her hastanın kendi hastalık tablosu olabilir.
Niteliksel analiz, tarama ve belgelendirmeyi içerir. Hastada virüs tespit edilmezse sonuç “negatif” oluyor. Bu sertifika tespit edildiğinde ek tarama çalışmaları yapılıyor. Taramayı doğrulayan veya çürüten immünoblot analizi. Test şeritleri belirli karanlık alanlarda görünüyorsa (proteinlerin lokalizasyonu), HIV tanısı konur.
Sonuçların şüpheli olması durumunda testler üç ay içinde gerçekleştirilir.
İnsan bağışıklık yetersizliği virüsü enfeksiyonunu önlemek için belirli kurallara uymanız mümkündür: gündelik cinsel temastan kaçının, temas sırasında prezervatif kullanın, uyuşturucu kullanmayın.
Hamile bir kadında hastalık tespit edilirse, ilgili doktorun tavsiyelerine uymak ve virüsün varlığını test etmeyi unutmamak önemlidir.
Western blotlama nedir?
Çeşitli dokuların kompleks karışımlarında veya ekstraktlarında protein tanımlaması sıklıkla karşılaşılan sorunlardan biridir. Spesifik antikorlar gibi bir araç kullanarak, incelenen proteini minimum zaman ve mali maliyetle belirlemek mümkündür.
Western blot yönteminde, ilk aşamada, bir protein karışımı, sodyum dodesil sülfat (SDS) varlığında elektroforez ile ayrılır, daha sonra elektroblotlama yoluyla bir nitroselüloz membrana aktarılır.
Bu yöntemin özü, elektroforezden sonra jelin, filtre kağıdı katmanları arasındaki nitroselüloz membran üzerine yerleştirilmesidir. Bu şekilde bir araya getirilen "sandviç", protein-SDS komplekslerinin jel plaka boyunca hareket etmesi ve nitroselüloz membranın yüzeyinde (spesifik olmayan sorpsiyonun bir sonucu olarak) hareketsiz kalması için bir elektrik alanına yerleştirilir.
Protein-SDS kompleksinin nitroselüloz membrana bağlanma kuvvetleri temel olarak elektriksel doğa ve bu etkileşim çok noktalıdır ve proteinlerin membran yüzeyinde "yayılmasına" yol açar. Böylece elektrotransferden sonra nitroselüloz üzerinde bir jelin poliakrilamid jeldekiyle aynı şekilde konumlandırılmış proteinlerle bir kopyasını elde ederiz.
SDS elektroforezi, proteinlerin jelden nitroselüloz membran üzerine elektrotransferi ve soğurulmasından sonra, bu kadar sert bir işlemden sonra protein için üçüncül bir yapının varlığından bahsetmek genel olarak doğruysa, proteinin üçüncül yapısı büyük ölçüde değişir. Bu nedenle, incelenen proteinin immünokimyasal tespiti için genellikle yalnızca protein molekülünün doğrusal bölgelerine özgü mono veya poliklonal antikorlar kullanılır.
51. Enzim immünolojik testi, immünoblotlama. Mekanizma, bileşenler, uygulama.
Konformasyonel epitoplara (veya alt birimler arası temasları içeren bölgelere) özgü antikorlar genellikle Western blotlamada kullanıma uygun değildir.
Protein transferinden sonra, membran sırasıyla incelenen proteine özgü antikorlarla ve ardından bir enzim (veya başka bir) etiketle konjuge edilmiş birincil antikorların Fc fragmanlarına özgü ikincil antikorlarla inkübe edilir (Şekil 1).
1 A). İncelenmekte olan antijene özgü birincil antikorların doğrudan etikete konjuge edilmesi durumunda ikincil antikorlara gerek yoktur (Şekil 1 B). İncelenen proteinin lokalizasyon bölgesinde oluşan bağışıklık kompleksleri, kromojenik bir substrat kullanılarak (etiketin türüne bağlı olarak) "tezahür edilir".
Yöntemin duyarlılığı ve özgüllüğü büyük ölçüde araştırmada hangi antikorların kullanıldığına bağlıdır.
Kullanılan antikorlar, yalnızca incelenen proteinin benzersiz bir amino asit dizisi karakteristiğine özgü olmalıdır. Aksi takdirde, antikorların birkaç protein molekülü ile etkileşimi (özellikle ham protein ekstraktları durumunda) mümkündür ve bu da membran üzerinde birkaç renkli bandın ortaya çıkmasına yol açacaktır.
Bu durumda incelenen proteinin tanımlanması genellikle zor, hatta imkansızdır.
Antikor seçerken akılda tutulması gereken ikinci önemli faktör afinitedir. Kullanılan antikorların afinitesi ne kadar yüksek olursa, protein bantları o kadar parlak ve net boyanır, yöntemin duyarlılığı da o kadar yüksek olur. Yüksek afiniteli antikorlar kullanıldığında 1 ng veya daha yüksek hassasiyet elde edilebilir.
Membrana bağlı bir antijen ile antikorlar arasındaki etkileşimin sonucunu görselleştirmek için, belirli koşullar altında belirli bir sinyal üretebilen ajanlarla konjuge edilmiş ikincil antikorlar kullanılır.
Tipik olarak böyle bir madde olarak bir enzim (peroksidaz veya fosfataz) kullanılır; reaksiyon ürünü renklidir ve membran üzerinde çözünmeyen bir çökelti şeklinde çökelir.
Ayrıca Bu method floresan etiketlerin kullanılması mümkündür.
Pirinç. 1. İncelenmekte olan proteinin immünokimyasal boyama şeması: A - bir enzim etiketine konjuge edilmiş ikincil antikorların kullanılması; B - birincil antikor doğrudan bir enzim etiketine konjuge edilir.
Protokol:
I. Jel ve membran hazırlama ve protein elektrotransferi
Elektroforezden sonra poliakrilamid jel, kurutma tamponu (25 mM Tris, pH 8.3, 192 mM glisin, %10 etanol) içeren bir banyoya yerleştirilir.
Kurutma kaseti şeklinde kesilmiş ve kurutma tamponu ile nemlendirilmiş iki yaprak filtre kağıdı kasetin anoda bakacak kısmına yerleştirilir. Daha sonra filtre kağıdının üzerine aynı tamponla önceden nemlendirilmiş nitroselüloz membran yerleştirilir ve membran ile kağıt arasında hava kabarcığı kalmamasına dikkat edilir.
Bundan sonra jel tekrar döndürülerek membranın üzerine dikkatlice yerleştirilmelidir. Özel dikkat jel ve membran arasında hava kabarcıklarının olmaması için. Sandviç oluşumu, jelin yüzeyine yerleştirilen iki kat nemlendirilmiş filtre kağıdı ile tamamlanır (Şekil 2). Elde edilen sandviç bir kasete sıkıştırılır ve membran anoda bakacak şekilde elektrotların arasına yerleştirilir.
Pirinç. 2. Proteinlerin membrana elektrotransferinin şeması.
II. Elektrik transferi
Proteinlerin bir nitroselüloz membrana elektrotransferi, 25 mM Tris, pH 8.3, 192 mM glisin, %10 etanol içeren bir tampon içinde 100 V sabit voltajda 30-50 dakika süreyle gerçekleştirilir.
Elektrotransferin süresi transfer edilen proteinlerin boyutuna bağlıdır; protein ne kadar büyükse elektrotransfer o kadar uzun sürer. Elektrotransferin kalitesi ve protein bantlarının konumu, nitroselüloz membranın %1'lik Ponceau S'nin %0,3'lük çözeltisiyle boyanmasıyla değerlendirilir. asetik asit. İmmünokimyasal boyamadan önce membran birkaç kez zayıf alkalin ile yıkanmalıdır. sulu çözelti Proteinlere bağlı boyayı uzaklaştırmak için tri.
III. Nitroselüloz membran üzerinde immobilize edilmiş proteinlerin immünokimyasal boyanması
Spesifik olmayan antikor bağlanma bölgelerini bloke etmek için membran, PBST içerisinde 30 dakika boyunca oda sıcaklığında sürekli karıştırılarak inkübe edilir (örn. daha iyi engelleme%10 yağsız süt tozu içeren PBST çözeltisi kullanılabilir).
Bloklamanın ardından membran, 1-10 μg/ml spesifik antikor içeren PBST içerisinde sürekli karıştırılarak oda sıcaklığında bir saat süreyle inkübe edilir.
Optimum antikor konsantrasyonu ampirik olarak seçilir ve antikorların antijenle etkileşiminin afinitesine bağlıdır.
İnkübasyonun sonunda membranı 5 kez PBST ile yıkayın ve yaban turpu peroksidazına konjuge edilmiş ikincil antikorlardan oluşan bir çözeltiye aktarın. Konjugatın seyreltilmesi genellikle üretici tarafından ambalajın üzerinde belirtilir veya araştırmacı tarafından ampirik olarak seçilir. Membranı ikincil antikor çözeltisinde 1 saat boyunca sürekli karıştırarak inkübe edin.
İyice yıkandıktan sonra (tamponu en az 5-6 kez değiştirin), PBST membranı, 10 ml 0,1 M Tris-HCl içinde 3 mg diaminobenzidin (DAB) ve 10 ul %30 hidrojen peroksit içeren kromojenik bir substrat çözeltisine aktarılır. , pH 7.6.
Kuluçkalama 5-10 dakika karıştırılarak gerçekleştirilir. Substrat ile inkübasyonun tamamlanmasından sonra membran PBST ile yıkanmalı, filtre kağıdı ile kurutulmalı ve hemen elektronik kopya, renkli tarama. Membran tamamen kurursa boyalı protein şeritleri soluklaşır ve görüntü daha az parlak ve kontrastlı hale gelir.
Not: DAB zehirlidir ve potansiyel kanserojendir. Sadece lastik eldivenlerle çalışın!
