HAN: interferon alfa 2b

Üretici firma: Sikor Biyoteknoloji A.Ş.

Anatomik-terapötik-kimyasal sınıflandırma: interferon alfa-2b

RK'deki kayıt numarası: RK-BP-5 No 012842

Kayıt Dönemi: 18.06.2014 - 18.06.2019

KNF (ilaçlar, Kazakistan Ulusal İlaç Formülasyonuna dahildir)

ALO (Ücretsiz Ayakta İlaç Temini Listesine Dahildir)

BİRİM (Tek Distribütörden satın alınacak garantili tıbbi bakım hacmi kapsamındaki İlaçlar Listesine dahil edilmiştir)

Kazakistan Cumhuriyeti'ndeki maksimum satın alma fiyatı: 33 116.64 KZT

Talimatlar

Ticari unvan

Realdiron

Uluslararası tescilli olmayan isim

interferon alfa

Dozaj formu

Enjeksiyonluk çözeltinin hazırlanması için liyofilize toz, 1.000.000 IU, 3.000.000 IU, 6.000.000 IU, 9.000.000 IU ve 18.000.000 IU

Birleştirmek

Bir şişe içerir

aktif madde: interferon alfa-2b insan rekombin-

1 milyon IU, 3 milyon IU, 6 milyon IU, 18 milyon IU

yardımcı maddeler: dekstran 60, sodyum klorür, disodyum hidrojen fosfat dodekahidrat, sodyum dihidrojen fosfat dihidrat

Açıklama

Beyaz toz veya gözenekli kütle

Farmoterapötik grup

İmmünomodülatörler. interferonlar. interferon alfa

ATX kodu L03AB05

farmakolojik özellikler

farmakokinetik

İntramüsküler uygulamadan sonra maksimum interferon-alfa 2b konsantrasyonunun başlama süresi 2 saattir ve subkutan uygulamadan sonra 12 saate kadar sürer - 7.3 saat, 20 saat sonra ilaç tespit edilmez.

Kas içi enjeksiyon ile T1 / 2 (yarı ömür) yaklaşık 2-3 saattir. Biyoyararlanım %80'dir.

İlaç organlar ve dokular üzerinde eşit olarak dağıtılır. Böbreklerde ve küçük bir oranda karaciğerde biyotransforme edilmiştir. Kısmen değişmeden, esas olarak böbrekler yoluyla atılır.

farmakodinamik

İnterferon alfa-2b, rekombinant DNA aracılığıyla elde edilen yüksek oranda saflaştırılmış bir proteindir. Molekülün polipeptit yapısı, biyolojik aktivitesi ve farmakolojik özellikleri, insan lökosit interferon alfa-2b ile aynıdır. Antiviral, antiproliferatif, antitümör ve immünomodülatör etkileri vardır.

İlaç, hücre yüzeyindeki ilgili reseptörlerle etkileşerek hücre içinde karmaşık bir değişim zincirini başlatır. Bu süreçlerin hücrede viral replikasyonun önlenmesi, hücre proliferasyonunun inhibisyonu ve interferonun immünomodülatör etkisi ile ilişkili olduğu varsayılmaktadır. İnterferon alfa-2b, makrofajların fagositik aktivitesinin yanı sıra T hücrelerinin ve NK'nin (Doğal Öldürücüler) sitotoksik aktivitesini uyarma yeteneğine sahiptir. İlacın terapötik etkisini belirleyen interferonun bu özellikleridir.

Kullanım endikasyonları

Yetişkinlerde kombinasyon tedavisinin bir parçası olarak. viral hastalıklar

- kullanımı imkansız ise kronik aktif hepatit B

pegile interferonlar

- kullanımı imkansız ise kronik hepatit C

pegile interferonlar

Onkolojik hastalıklar - tüylü hücreli lösemi - kronik miyeloid lösemi - böbrek kanseri - malign melanom.

Uygulama yöntemi ve dozaj

Realdiron'un solüsyonu kas içinden veya deri altından uygulanır. Kullanmadan önce, şişenin içeriği enjeksiyon için 1 ml su içinde çözülür. İlacın çözeltisi, yabancı kapanımlar olmadan şeffaf olmalıdır. Kronik aktif hepatit B'de Realdiron, 6 ay boyunca haftada üç kez 3 milyon IU'da uygulanır. Tedaviden sonra 3 ay içinde HBsAg'de klinik, biyokimyasal düzelme ve/veya kaybolma olmazsa ilaç kesilir.

Kronik hepatit C'de Realdiron, 6 ay boyunca haftada 3 kez 3 milyon IU reçete edilir. İlacın bir aylık tedaviden sonra uygulanmasından sonra, kan plazmasındaki ALT aktivitesinde% 50 azalma olmazsa, ilacın dozu haftada 3 kez 6 milyon IU'ya çıkarılır. 3 aylık tedaviden sonra klinik, biyokimyasal iyileşme olmazsa, ilaç iptal edilmelidir.

Tüylü hücreli lösemi ile 2 ay boyunca günde 3 milyon IU enjekte edilir; hematolojik remisyona ulaştıktan sonra - haftada 3 kez 3 milyon IU.

Kronik miyeloid lösemide, günde 3 milyon IU'luk bir başlangıç dozu kas içinden veya deri altından uygulanır. İyi toleransla, ilacın dozu her hafta günde maksimum 9 milyon IU doza çıkarılır. Lökosit sayısı stabilize olduğunda, bu doz haftada üç kez uygulanabilir. Tedavinin kesilmesi gerektiği durumlar dışında (örneğin, hastalığın hızlı ilerlemesi veya ilaç intoleransı ile) tedavi süresi süresiz olarak gerçekleştirilir.

Böbrek kanseri için Realdiron 10 gün boyunca günde 3 milyon IU'da kullanılır. İyi toleransla, ilacın dozu her hafta günde maksimum 18 milyon IU doza çıkarılır. 3 aylık tedaviden sonra 6 ay boyunca haftada üç kez 18 milyon IU ile idame tedavisine başlanır.

Malign melanomda, günde 3 milyon IU'luk bir başlangıç dozu kas içinden veya deri altından uygulanır. İyi toleransla, ilacın dozu her hafta maksimum günde 9-18 milyon IU'ya yükseltilir. Klinik etkiyi elde ettikten sonra haftada 3 kez 9-18 milyon IU idame tedavisine geçerler. Evre I-II malign melanomun cerrahi olarak çıkarılmasından sonra Realdiron ile adjuvan tedavi, nüksetme süresini uzatabilir.

Yan etkiler

sıklıkla

Ateş, yorgunluk, halsizlik, baş ağrısı, kas ağrısı, titreme, titreme, grip benzeri semptom

Anoreksiya, mide bulantısı

daha az sıklıkta

Tat değişikliği, stomatit, ağız kuruluğu, diş yüzeyinde ve ağız mukozasında hasar, kusma, ishal, kabızlık, gevşek dışkı, karın ağrısı

Alopesi, kaşıntı, kuru cilt, döküntü

Sırt ağrısı, kas-iskelet ağrısı, göğüs ağrısı, miyozit, artralji

Depresyon, intihar düşünceleri ve eylemleri, intihar

Özellikle geceleri aşırı terleme

Sinirlilik, uykusuzluk, uyuşukluk, kaygı, konsantrasyon azalması, duygusal değişkenlik, baş dönmesi

Arteriyel hipotansiyon, hipertansiyon

seyrek

Enjeksiyon bölgesinde iltihaplanma, kızarıklık, tahriş

Heyecan, sinirlilik, halüsinasyonlar dahil psikoz, saldırgan davranış, ajitasyon, bilinç bozukluğu, nöropati, polinöropati, periferik nöropati, parestezi, hipostezi, konvülsiyonlar, bilinç kaybı

Herpes simpleks dahil viral enfeksiyon

eritem

Konjonktivit, göz ağrısı, bulanık görme, retinal kanamalar, retinopatiler, fokal retinal değişiklikler, bir arter veya retinal vende obstrüksiyon, görme keskinliğinde azalma veya görme alanı kısıtlılığı, optik nörit, optik disklerde ödem

Lakrimal bezlerin işlev bozukluğu

Epistaksis, burun tıkanıklığı, sinüzit, rinit

Migren

Öksürük, farenjit, pulmoner infiltratlar, pnömoni, dispne, solunum bozuklukları

Kilo kaybı

Taşikardi, çarpıntı

Azalmış libido, adet düzensizlikleri (amenore, menoraji)

İştah artışı, glossit, diş eti kanaması

Rabdomiyoliz (bazen şiddetli)

İşitme bozukluğu veya kaybı

Yüz ödemi, böbrek yetmezliği, nefrotik sendrom, böbrek

başarısızlık, hiperürisemi

Hiper ve hipotiroidizm, hepatotoksisite (ölümler dahil)

lökopeni

Diş ve periodontal bozukluklar (diş kaybına yol açanlar dahil)

seyrek

İştah artışı, diabetes mellitus, hiperglisemi, hipertrigliseridemi, kolit, hepatomegali, pankreatit

Serebrovasküler iskemi, serebrovasküler kanamalar

Sarkoidoz veya sarkoidozun alevlenmesi

Alerjik reaksiyonlar, eritema multiforme, Stevens-Johnson sendromu, toksik epidermal nekroliz

Trombositopeni, lenfositopeni, aplastik anemi

lenfadenopati

uyuşukluk

Enjeksiyon yeri nekrozu

Otoimmün ve immün aracılı bozukluklar, dahil. idiyopatik trombositopenik purpura, romatoid artrit, sistemik lupus eritematozus, vaskülit ve Vogt-Kayanagi-Harada sendromu

Kulaklarda gürültü

Miyokard enfarktüsü, aritmi (genellikle kardiyovasküler hastalık öyküsü olan veya daha önce kardiyotoksik ilaçlarla tedavi gören hastalarda), geri dönüşümlü geçici kardiyomiyopati (kardiyovasküler sistem öyküsü olmayan hastalarda not edilir)

Zatürre

seyrek(monoterapi veya ribavirin ile kombinasyon halinde)

Kırmızı kemik iliğinin tam aplazisi

Laboratuvar parametrelerindeki değişiklikler (reçete yazarken daha sık not edilir)

günde 10 milyon IU'dan fazla dozlarda ilaç): granülosit sayısında azalma,

hemoglobin seviyesinde bir azalma, ALT, AST aktivitesinde bir artış (kronik viral hepatit hariç tüm endikasyonlar için kullanıldığında gözlenir), alkalin fosfataz, LDH, kreatinin seviyesi ve serum üre nitrojeni

Çocuklarda, ribavirin ile kombinasyon tedavisi dahil (ribavirin ile kombinasyon tedavisi alan hastaların ≥ %1'i)

Sıklıkla

Anemi, nötropeni

hipotiroidizm

Depresyon, duygusal değişkenlik, uykusuzluk, sinirlilik, baş ağrısı, baş dönmesi

Anoreksiya, bulantı, kusma, karın ağrısı, ishal

alopesi, döküntü

Artralji, miyalji

Enjeksiyon bölgesinde inflamatuar reaksiyonlar: ağrı, hiperemi

Halsizlik, ateş, titreme, grip benzeri semptomlar, halsizlik, viral enfeksiyon, farenjit

Gecikmiş fiziksel gelişim (yaşa göre gecikmiş büyüme ve/veya vücut ağırlığı)

sıklıkla

solgunluk

burun kanaması

Bakteriyel enfeksiyon, pnömoni, mantar enfeksiyonu, herpes simpleks

Neoplazmalar, sınıflandırılmamış

Trombositopeni, lenfadenopati

Hipertiroidizm, virilizm

Hipertrigliseridemi, hiperürisemi

Ajitasyon, tremor, uyuşukluk, agresif reaksiyon, anksiyete, apati, sinirlilik, davranış bozukluğu, somnambulizm, intihar düşünceleri, konfüzyon, anormal rüyalar, uyku bozukluğu, hiperkinezi, disfoni, parestezi, hiperestezi, hipostezi, dikkat konsantrasyonunda azalma

Konjonktivit, göz ağrısı, bulanık görme, gözyaşı bezi disfonksiyonu

Raynaud hastalığı

Öksürük, dispne, orta kulak iltihabı, burun tıkanıklığı, burun mukozasında tahriş, burun akıntısı, hapşırma, takipne

Gastrointestinal bozukluklar, iştah artışı, kabızlık, gevşek dışkı, rektal bozukluklar, dispepsi, gastroözofageal reflü, gastroenterit, glossit, stomatit, dahil. ülseratif, diş ağrısı, karaciğer fonksiyon bozukluğu

Karın sağ üst kadranda, göğüste ağrı

Akne, egzama, tırnak değişiklikleri, kuru cilt, cilt çatlakları, ışığa duyarlılık reaksiyonları, makülopapüler döküntü, cilt pigmentasyonundaki değişiklikler, eritem, terleme, hematom, kaşıntı

İdrar yolu enfeksiyonları, idrar bozuklukları, enürezis

Adet düzensizlikleri, amenore, menoraji, vajinal bozukluklar, vajinit, testis ağrısı (erkeklerde)

Kontrendikasyonlar

Etkin maddeye veya yardımcı maddelerden herhangi birine karşı aşırı duyarlılık

Kontrolsüz kalp problemleri öyküsü, yakın zamanda miyokard enfarktüsü, şiddetli kardiyak aritmiler dahil olmak üzere şiddetli kalp hastalıkları

İçlerinde tümör metastazları da dahil olmak üzere şiddetli böbrek veya karaciğer hastalığı, ribavirin ile kombinasyon halinde uygulandığında, kreatinin klerensi 50 ml / dak'nın altında olan böbrek yetmezliği

Dekompanse karaciğer sirozu

Şiddetli siroz veya karaciğer yetmezliği olan kronik hepatit

Geçmişte immünosupresanlar veya glukokortikosteroidlerle tedavi edilen kronik hepatit

Otoimmün hastalıklar, dahil. mevcut veya otoimmün hepatit öyküsü

Standart tedavilerle kontrol edilmeyen tiroid bozuklukları

Çocuklarda ve ergenlerde önceden var olan zihinsel veya tıbbi öykü

Kronik hepatit C'li 3 yaşın altındaki çocuklar

Ribavirin ile kombinasyon halinde uygulandığında hamilelik ve emzirme

Ribavirin ile kombinasyon halinde uygulandığında, ribavirin kullanım talimatlarında belirtilen kontrendikasyonlar da dikkate alınmalıdır.

İlaç etkileşimleri

İnterferon alfa, karaciğer mikrozomal enzimlerini (sitokrom P-450) inhibe eder, bu nedenle birçok ilacın (teofilin vb.) metabolizmasını bozarak kandaki konsantrasyonlarını artırabilir.

Merkezi sinir sisteminden advers reaksiyon riski nedeniyle, interferon alfa ile birlikte narkotik, hipnotikler ve sedatifler çok dikkatli kullanılmalıdır.

Realdiron ve diğer ilaçlar arasındaki ilaç etkileşimi tam olarak çalışılmamıştır. Realdiron, potansiyel olarak miyelosupresif etkiye sahip ilaçlarla kombinasyon halinde dikkatli kullanılmalıdır.

Realdiron ve zidovudin'in eşzamanlı kullanımı ile lökosit sayısında azalma üzerinde sinerjik bir etki gözlemlenebilir. Bu tür bir tedaviyi alan hastalar, zidovudin monoterapisi ile beklenenden daha sık doza bağımlı nötropeni vakaları yaşadı. Realdiron'u ribavirin veya zidovudin ile kombinasyon tedavisinin bir parçası olarak alan hastalarda anemi riski artar.

Realdiron'un antiretroviral ilaçlarla kombinasyon halinde kullanılmasının etkileri bilinmemektedir.

İnterferonlar oksidatif metabolik süreçleri etkileyebilir. Oksidasyon yoluyla metabolize edilen ilaçlarla (ksantin türevleri - aminofilin ve teofilin dahil) aynı anda kullanıldığında bu dikkate alınmalıdır. Realdiron'un teofilin ile eşzamanlı kullanımı ile, ikincisinin kan serumundaki konsantrasyonunu kontrol etmek ve gerekirse dozaj rejimini ayarlamak gerekir.

Farmasötik etkileşimler

Realdiron, %0,9 sodyum klorür çözeltisi dışındaki diğer tıbbi maddelerle karıştırılmamalıdır.

Özel Talimatlar

Hepatit B

Hepatit B hastaları için tedaviye başlamadan önce, kronik hepatiti doğrulamak ve lezyonun boyutunu belirlemek için karaciğer biyopsisi yapılması ve ayrıca ensefalopati öyküsü veya özofagus varislerinden kanama olmadığından emin olunması önerilir. asit veya dekompansasyonun diğer klinik belirtileri.

Realdiron ile tedaviye başlamadan önce aşağıdaki göstergelere odaklanmak gerekir:

bilirubin normu

protrombin zamanı yetişkinler - en fazla 3 saniye uzatma

çocuklar - 2 saniyeden fazla uzatma

lökositler ≥ 4000 / mm3

trombosit yetişkinleri ≥ 100.000 / mm3

çocuklar ≥ 150.000 / mm3

Hepatit C

Optimal tedavi yolu, ribavirin ile kombinasyon tedavisidir. Realdiron ile monoterapi, esas olarak hoşgörüsüzlük durumunda veya ribavirin kullanımına kontrendikasyonların varlığında gerçekleştirilir.

Realdiron'u kronik hepatit C için ribavirin ile kombinasyon tedavisinin bir parçası olarak kullanırken, ribavirin'in tıbbi kullanımına ilişkin talimatları da okuyun.

Kronik hepatit C'li tüm hastalar için bir karaciğer biyopsisi önerilir, ancak bazı durumlarda (örneğin, viral genotip 2 ve 3 olan hastalar), histolojik doğrulama olmadan tedavi mümkündür.

Yetişkinler. Realdiron ile tedaviye başlamadan önce, aşağıdaki göstergelere odaklanırken, ensefalopati, özofagus varislerinden kanama, asit veya diğer klinik dekompansasyon belirtileri olmadığından emin olmak gerekir:

bilirubin ≤ 2 mg / dL

albümin stabil ve normal sınırlar içinde

protrombin süresinin yetişkinlerde 3 saniyeden fazla, çocuklarda 2 saniyeden fazla uzaması

lökositler ≥ 3000 / mm3

trombositler ≥ 70.000 / mm3

serum kreatinin normal veya normale yakın

Realdiron böbrek fonksiyon bozukluğu olan hastalarda (kreatinin klerensi > 50 ml/dk) ribavirin ile birlikte kullanıldığında, anemi olasılığı göz önünde bulundurularak tam kan sayımı, kan ve idrar kreatinin izlenmelidir. 50 yaş üstü hastalarda bu izlem haftada bir kez yapılmalıdır.

Monoterapi.

Realdiron ile tedavi sırasında tiroid fonksiyon bozukluğu mümkündür - hipotiroidizm veya hipertiroidizm. Realdiron kullanımına başlamadan önce kan serumundaki tiroid uyarıcı hormon (TSH) düzeyi belirlenmeli ve tiroid bezinin ultrasonu yapılmalıdır. Herhangi bir anormallik tespit edilirse, uygun tedavi yapılmalıdır.

HIV ve hepatit C virüsü ile birlikte enfeksiyon için başvuru

Ayrıca HIV ile enfekte olan ve oldukça aktif antiretroviral tedavi (HAART) alan hastalarda laktik asidoz riski artabilir. HAART'a Realdiron ve ribavirin tedavisi eklenirken dikkatli olunmalıdır.

Ayrıca HIV ve hepatit C virüsü ile enfekte olan ve HAART alan sirozlu hastalarda karaciğer dekompansasyonu ve ölüm riskinde artış olabilir.

Alfa interferonların tek başına veya ribavirin ile kombinasyon halinde ek kullanımı, bu hasta kategorisinde yukarıdaki riski artırır.

Diş ve periodontal bozukluklar

Laboratuvar araştırması

Realdiron ile tedaviye başlamadan önce ve tedavi sırasında periyodik olarak, tüm hastalar periferik kan resmi (lökosit formülü ve trombosit sayısının belirlenmesi ile), kan biyokimyasal parametreleri (elektrolit seviyesinin belirlenmesi, karaciğer enzimleri dahil olmak üzere) için izlenir. ALT, bilirubin, albümin ve kreatinin dahil toplam protein ve fraksiyonlar). Realdiron ile tedaviden önce ve tedavi sırasında kan sayımı seviyesi normal aralıkta olmalıdır.

Kronik hepatitli hastaların tedavisi sırasında, aşağıdaki laboratuvar parametreleri izleme şeması önerilir: 1, 2, 4, 8, 12, 16 hafta ve ardından tüm tedavi süresi boyunca ayda bir. ALT, tedavi başlangıcından önceki değerin iki katı veya daha fazla bir değere yükselirse, karaciğer yetmezliği belirtileri görülmedikçe Realdiron ile tedaviye devam edilebilir. Bu durumda 2 haftada bir ALT, protrombin zamanı, alkalin fosfataz, albümin ve bilirubin tayini yapılmalıdır.

Malign melanomlu hastalarda karaciğer fonksiyonu ve lökosit sayısı (bir formül ile) remisyon indüksiyonu sırasında haftalık ve idame tedavisi sırasında aylık olarak izlenmelidir.

Ani aşırı duyarlılık

Geçici bir deri döküntüsünün ortaya çıkması, tedavinin kesilmesini gerektirmez.

eşlik eden hastalıklar

Realdiron, ciddi kronik hastalık öyküsü olan hastalara dikkatle reçete edilir: kronik obstrüktif akciğer hastalığı, ketoasidoz eğilimi olan diabetes mellitus. Kanama bozukluğu olan hastalarda ilacı kullanırken özel dikkat gösterilmelidir.

(tromboflebit, pulmoner emboli) veya şiddetli miyelosupresyon ile.

eş zamanlı kemoterapi

Realdiron'un diğer kemoterapi ilaçlarıyla (örneğin sitarabin, siklofosfamid, doksorubisin, teniposid) kombinasyon halinde kullanımı, kombine kullanım nedeniyle yaşamı tehdit edebilen veya ölüme neden olabilen toksik etki riskini (şiddeti ve süresi) artırır. . Artan toksisite riskinden dolayı, Realdiron ve eşlik eden kemoterapötik ajanların dozunu dikkatli bir şekilde seçmek gerekir.

Otoantikorlar ve otoimmün hastalıklar

Realdiron ile tedavi, otoantikorların ortaya çıkmasına ve otoimmün hastalıkların gelişmesine yol açabilir. Kalıtsal yatkınlığı olan veya otoimmün hastalıkların semptomlarının geliştiğinden şüphelenilen hastalar, erken teşhis için sürekli izlenmelidir. Kronik hepatit C'li hastalarda Vogt-Koyanagi-Harada sendromundan şüpheleniliyorsa, antiviral tedavi kesilmeli ve kortikosteroid tedavisinin gerekliliği tartışılmalıdır.

Ateş

Ateş, interferon tedavisinde sık görülen grip benzeri sendromun bir belirtisi olabilir, ancak diğer nedenler ekarte edilmelidir.

Realdiron ile tedavi sırasında ortaya çıkabilecek grip benzeri sendromlu vücut ısısını azaltmak ve baş ağrısını azaltmak için ateş düşürücü tedavi kullanılması önerilir.

Bozulmuş karaciğer fonksiyonu için başvuru

Toksik hepatite bağlı ölümler nadirdir. Realdiron kullanımının arka planında karaciğer fonksiyon bozukluğu belirtileri ortaya çıkarsa, hastanın dikkatli gözleme ihtiyacı vardır ve semptomların ilerlemesiyle birlikte ilaç kesilmelidir.

Sentetik karaciğer fonksiyonu azalmış (örneğin, azalmış albümin veya uzamış protrombin zamanı), ancak tedaviye başlamak için uygunluk kriterlerini karşılayan kronik hepatit B hastalarında, tedavi sırasında aminotransferaz seviyeleri yükselirse, klinik dekompansasyon gelişme riski artabilir. Bu tür hastaları tedavi etmeden önce, olası risklere göre Realdiron kullanmanın avantajları belirlenmelidir.

Allogreftlerin reddi

Ön kanıtlar, interferon alfa tedavisinin böbrek nakli reddi riskini artırabileceğini düşündürmektedir. Alfa interferon tedavisi ile nedensel bir ilişki kurulmamış olmasına rağmen karaciğer nakli reddi de bildirilmiştir.

hidrasyon

Realdiron ile tedavi edilirken, bazı durumlarda dehidrasyonun neden olduğu arteriyel hipotansiyon gözlendiğinden (ek sıvı uygulaması gerektirebilir) vücudun yeterli hidrasyonunu sağlamak gerekir.

kardiyovasküler sistem

Kardiyovasküler hastalık öyküsü (kronik kalp yetmezliği, miyokard enfarktüsü ve/veya aritmiler) olan hastalar, Realdiron reçete edilirken dikkatli tıbbi gözetim gerektirir. Realdiron ile tedavi durdurulduktan sonra bazen geri dönüşümlü gelişen izole kardiyomiyopati vakaları bildirilmiştir. Kalp hastalığı öyküsü olan hastaların yapması önerilir.

Realdiron ile tedavi öncesi ve sırasında EKG. Esas olarak supraventriküler aritmiler, nadiren ve ağırlıklı olarak kardiyovasküler hastalık öyküsü olan veya önceden kardiyotoksik ilaçlarla tedavi gören hastalarda meydana geldi. Bu tür ritim bozuklukları, kural olarak, standart tedaviye yanıt verir, ancak doz değişikliğini veya Realdiron'un kesilmesini gerektirebilir.

Solunum sistemi

Ateş, öksürük, nefes darlığı veya diğer solunum semptomları olan herhangi bir hastanın göğüs röntgeni çekilmelidir. İnfiltratlar bulunursa veya akciğer fonksiyonunun ihlali varsa, hastanın dikkatli bir şekilde izlenmesi ve gerekirse Realdiron ile tedavinin iptal edilmesi gerekir. Bu tür değişiklikler, alfa interferon tedavisi alan kronik hepatit C'li hastalarda daha sık meydana geldi, ancak aynı zamanda alfa interferon tedavisi alan kanserli hastalarda da geliştiğine dair vakalar rapor edildi. İnterferon alfa ile tedavinin zamanında iptali ve kortikosteroid kullanımı, olumsuz pulmoner reaksiyonların kaybolmasına yol açar. Ek olarak, Shosaikoto'nun (bir Çin bitkisel ilacı) alfa interferon ile birlikte kullanımıyla bu semptomların daha sık ortaya çıktığı bildirilmiştir.

Ruhsal bozukluklar ve merkezi sinir sistemi (CNS). Realdiron ile tedavi sırasında ve hatta tedavinin bitiminden sonra, özellikle 6 ay boyunca bazı hastalarda depresyon, intihar düşünceleri ve intihar girişimleri gibi ciddi merkezi sinir sistemi bozuklukları gözlenmiştir. Realdiron'u ribavirin ile birlikte alan çocuklar ve ergenler arasında, intihar düşünceleri ve intihar girişimleri yetişkin hastalara kıyasla daha sık gözlenmiştir (%2.4'e karşı %1). Yetişkin hastalarda, çocuklarda ve ergenlerde, örneğin depresyon, duygusal kararsızlık ve uyuşukluk gibi diğer zihinsel bozukluklar da gözlendi. Bu semptomlar ortaya çıktığında, bu advers olayların potansiyel şiddeti dikkate alınmalıdır. Semptomlar devam ederse veya kötüleşirse veya intihar düşünceleri veya saldırgan davranışlar tespit edilirse, tedavinin kesilmesi ve hastaya uygun psikiyatrik bakım sağlanması önerilir.

Akıl veya akıl sağlığı sorunları öyküsü olan hastalar. Geçmişte ruhsal bozuklukları veya bozuklukları olan çocuklarda ve ergenlerde interferon alfa-2b kullanımı kontrendikedir ("Kontrendikasyonlar" bölümüne bakınız).

Alkol ve uyuşturucu bağımlılığının yanı sıra geçmişte mevcut ruhsal bozuklukları veya bozuklukları olan yetişkin hastalar için Realdiron ile tedavinin gerekli olduğuna karar verildiyse, tedaviye ancak uygun bir bireysel tanıdan sonra ve zihinsel durumun sürekli izlenmesi altında başlanmalıdır. .

İnterferon tedavisi, hepatit C virüsü bulaşmış hastalarda, mevcut veya önceden ruhsal bozuklukları olan hastalarda ruhsal bozuklukların semptomlarını ve ayrıca alkol ve uyuşturucu bağımlılığını şiddetlendirebilir. Bu tür rahatsızlıkları olan hastalarda interferon tedavisi gerekiyorsa, interferon tedavisinin başarılı olması için mental semptomların uygun tedavisi yapılır. Ayrıca, hasta davranışlarının ve ruhsal bozuklukların belirtilerinin sıklığının bireysel olarak taranmasını zorunlu kılmak zorunludur. Bu hastalarda psikiyatrik semptomların başlamasından veya gelişmesinden önce ön tedavi önerilmektedir.

Oftalmik bozukluklar

Tedaviye başlamadan önce tüm hastalar oftalmolojik muayeneden geçmelidir. Yeni veya mevcut oftalmik bozukluklarda kötüleşme görüldüğünde Realdiron ile tedaviyi bırakın.

Tiroid değişiklikleri

Tiroid bezinin işlev bozukluğu varsa, ilaç tedavisi ile TSH içeriği normal düzeyde tutulabiliyorsa Realdiron ile tedaviye başlanabilir veya devam edilebilir. Realdiron kullanımının durdurulması, tedavi sırasında bozulan tiroid fonksiyonunun normalleşmesine yol açmaz.

Metabolik bozukluklar

Hipertrigliserideminin ciddi formlara gelişmesi veya ilerlemesi vakaları ile bağlantılı olarak, kan lipidlerinin seviyesinin kontrol edilmesi önerilir.

Diğer

İnterferon alfa ile tedavi sırasında tarif edilen sedef hastalığı ve sarkoidoz alevlenmesi vakaları göz önüne alındığında, Realdiron bu tür hastalarda sadece beklenen yararın potansiyel riskten daha ağır basması durumunda kullanılmalıdır.

Pediatride uygulama

Çocuklarda kombinasyon tedavisine başlama kararı, hem hastalık progresyonu belirtileri (karaciğerdeki inflamatuar sürecin aktivitesi ve fibroz) hem de virolojik yanıt, HCV genotipi ve viral yük gelişimi için prognostik faktörler dikkate alınarak bireysel olarak verilmelidir. Kombinasyon tedavisinin, bir yıl boyunca tedavi gören bazı çocuklarda büyüme geriliğine, kilo alımına neden olabileceği ve bunun geri döndürülebilirliği tam olarak anlaşılmadığı akılda tutulmalıdır. Bu bağlamda, tedavi sırasında ve tedavinin tamamlanmasından sonraki 6 ay boyunca çocukların fiziksel gelişimlerinin izlenmesi önerilir.

Bodur büyüme riskini azaltmak için, mümkünse çocuk ergenlik döneminde hızlı büyümeden sonra tedavi edilmelidir. Uzun süreli tedavinin ergenlik üzerindeki etkisine dair bir kanıt yoktur.

Üreme fonksiyonu üzerindeki etkisi

Realdiron alan kadınların serumunda östradiol ve progesteron konsantrasyonlarında bir azalma olduğu bildirilmiştir. Bu nedenle Realdiron, tüm tedavi süresi boyunca etkili doğum kontrolü kullanırlarsa üreme çağındaki kadınlarda kullanılabilir. Realdiron, üreme çağındaki erkeklerde de dikkatli kullanılır.

Gebelik ve emzirme

Realdiron'un hamilelik sırasında kullanımına ilişkin yeterli veri yoktur. Realdiron, anneye sağlayacağı potansiyel yarar, fetüse yönelik potansiyel tehdide ağır basıyorsa hamilelik sırasında kullanılmalıdır.

Bebek üzerindeki olası olumsuz etkiler nedeniyle, emzirmeyi bırakma veya ilacı bırakma kararı, annenin bu tedaviye ihtiyaç duyma derecesi dikkate alınarak verilmelidir.

İlacın araç veya potansiyel olarak tehlikeli makine kullanma yeteneği üzerindeki etkisinin özellikleri.

Hastayı terapi sırasında olası zayıflık, uyuşukluk, bilinç bozukluğu gelişimi konusunda uyarmak ve araç kullanmaktan veya karmaşık ekipman kullanmaktan kaçınmayı önermek gerekir.

aşırı doz

Şu anda, aşırı dozda uyuşturucu vakası bildirilmemiştir.

Doz aşımı durumunda semptomatik tedavi endikedir.

Bu bölüm sunar interferon alfa 2b ve alfa 2a kullanım talimatları lineer, basit veya kısa ömürlü olarak da adlandırılan ilk nesil. Bu ürünlerin tek avantajı nispeten düşük maliyetleridir.

1943'te W. ve J. Heyle, sözde girişim fenomenini keşfettiler. İnterferonun ilk fikri şuydu: virüslerin çoğalmasını engelleyen bir faktör. 1957'de İngiliz bilim adamı Alik Isaacs ve İsviçreli araştırmacı Jean Lindenman bu faktörü tanımladılar, açıkça tanımladılar ve interferon adını verdiler.

İnterferon (IFN), insan vücudunda üretilen bir protein molekülüdür. Sentezi için bir "tarif" (interferon geni) insan genetik aygıtında kodlanmıştır. İnterferon, bağışıklık sisteminin işleyişinde önemli rol oynayan sinyal molekülleri olan sitokinlerden biridir.

IFN'nin keşfinden bu yana yarım yüzyıl boyunca bu proteinin düzinelerce özelliği araştırıldı. Tıbbi açıdan, ana olanlar antiviral ve antitümör fonksiyonlardır.

İnsan vücudu yaklaşık 20 tür - bütün bir aile - interferon üretir. IFN iki türe ayrılır: I ve II.

Tip I IFN'ler - alfa, beta, omega, teta - vücuttaki çoğu hücre tarafından virüslerin ve diğer bazı ajanların etkisine yanıt olarak üretilir ve salgılanır. IFN tip II, yabancı maddelerin etkisine yanıt olarak bağışıklık sistemi hücreleri tarafından üretilen interferon gamayı içerir.

Başlangıçta, interferon preparatları yalnızca donör kan hücrelerinden elde edildi; onlara lökosit interferonları deniyordu. 1980'de rekombinant veya genetiğiyle oynanmış interferonlar dönemi başladı. Rekombinant ilaçların üretimi, insan donör kanından veya diğer biyolojik hammaddelerden benzer ilaçların üretilmesinden çok daha ucuz hale geldi; üretimleri, enfeksiyon kaynağı olarak hizmet edebilecek donör kanı kullanmaz. Rekombinant müstahzarlar yabancı safsızlıklar içermez ve bu nedenle daha az yan etkiye sahiptir. Terapötik potansiyelleri, benzer doğal preparatlardan daha yüksektir.

Viral hastalıkların, özellikle hepatit C'nin tedavisi için, esas olarak interferon alfa (IFN-a) kullanılır. "Basit" ("kısa ömürlü") interferonlar alfa 2b ve alfa 2a ile pegile (peginterferon alfa-2a ve peginterferon alfa-2b) arasında ayrım yapın. "Basit" interferonlar AB ve ABD'de pratik olarak kullanılmamaktadır, ancak ülkemizde nispeten düşük maliyetleri nedeniyle oldukça sık kullanılmaktadır. Hepatit C tedavisinde "kısa" IFN-a'nın her iki formu da kullanılır: interferon alfa-2a ve interferon alfa-2b (bir amino asitte farklılık gösterir). Basit interferonlu enjeksiyonlar genellikle gün aşırı yapılır (peginterferonlarla - haftada bir). Gün aşırı uygulandığında kısa ömürlü IFN'lerle tedavinin etkinliği, peginterferonlardan daha düşüktür. Bazı uzmanlar, AVT'nin etkinliği biraz daha yüksek olduğu için günlük "basit" IFN enjeksiyonlarını önermektedir.

"Kısa" IFN'lerin aralığı oldukça geniştir. Farklı üreticiler tarafından farklı isimler altında üretilirler: Roferon-A, Intron A, Laferon, Reaferon-EC, Realdiron, Eberon, Interal, Altevir, Alfarona ve diğerleri.
En çok araştırılan (sırasıyla pahalı) Roferon-A ve Intron-A'dır. Virüsün genotipine ve diğer faktörlere bağlı olarak ribavirin ile kombinasyon halinde IFN verileriyle tedavinin etkinliği %30 ila %60 arasında değişmektedir. Basit interferon üreticilerinin ana markalarının bir listesi ve açıklamaları tabloda verilmiştir.

Tüm interferonlar buzdolabında saklanmalıdır (+2 ila +8 santigrat derece). Isıtılmamalı veya dondurulmamalıdırlar. İlacı sallamayın veya doğrudan güneş ışığına maruz bırakmayın. İlaçları özel kaplarda taşımak gerekir.

Buluş, genetik mühendisliği, biyoteknoloji, tıp, farmakoloji ile ilgilidir. İfadesi laktoz ve triptofan promotörleri ve transkripsiyon terminatörünün kontrolü altında olan insan lökosit alfa-2b interferonunun sentezini kodlayan yeni rekombinant çok kopyalı plazmit DNA pSX50. Alıcı E. coli BL21 suşunun hücrelerinin rekombinant plazmit DNA pSX50 ile transformasyonunun bir sonucu olarak, E. coli SX50 suşu elde edildi - 0,9'a varan bir üretkenliğe sahip rekombinant insan lökosit alfa-2b interferon üreticisi. 1 litre kültür ortamından 1.0 g alfa-2b interferon. Rekombinant alfa-2b interferon elde etme yöntemi, E. coli SX50'nin oluşturulan rekombinant suşunun kullanımına ve biyosentez, mekanik, mekanik sırasında sürekli besin substratlarının eklenmesiyle azaltılmış triptofan içeriğine sahip bir besleyici ortam üzerinde derin ekiminin sağlanmasına dayanır. mikroorganizma hücrelerinin yüksek basınçta yok edilmesi, konsantre guanidin hidroklorür çözeltisi içinde toplanmış proteinin çözünmesi, ardından interferonun kaotropik ajanlar varlığında fizyolojik tampon çözeltilerinde renatürasyonu ve Chelating Sepharose gibi reçineler üzerinde interferonun üç aşamalı kromatografik saflaştırılması kullanılarak saflaştırılması Cu +2 iyonları ile immobilize edilmiş Fast Flow, CM Flow gibi iyon değişim reçineleri üzerinde iyon değişim kromatografisi ve Superdex 75 tipi reçineler üzerinde Seph jel filtrasyon kromatografisi Yöntem, göre %99'dan fazla saflıkta bir interferon maddesi elde etmeyi mümkün kılar. indirgeyici ve indirgeyici olmayan koşullar altında elektroforez verilerine jelleri gümüşle boyarken ve RF HPLC'ye göre %98'den fazla ve pirojensiz (LAL testi) 1 litre kültür ortamından en az 400-800 mg miktarlarda. 3 n. ve 3 s.p f-ly, 6 hasta.

RF patenti 2242516 için çizimler

Buluş, biyoteknolojik yollarla elde edilen genetiğiyle oynanmış ilaçlarla, yani tıbbi amaçlar için rekombinant insan lökosit interferon alfa-2b'nin (bundan böyle interferon olarak anılacaktır) endüstriyel üretim yöntemlerinin yanı sıra Escherichia coli (E. coli) ve plazmit üreten rekombinant suşlarla ilgilidir. DNA, interferon sentezini kodlar.

İnterferonlar, viral bir enfeksiyona veya diğer patojenlere yanıt olarak hücreler tarafından üretilen ve salgılanan 15.000 ila 21.000 dalton moleküler ağırlığa sahip protein molekülleridir. Üç ana interferon grubu vardır: alfa, beta ve gama. Kendi başlarına bu gruplar homojen değildir ve interferonun birkaç farklı moleküler türünü içerebilir. Bu nedenle, ilgi çeken ve tıpta antiviral, antiproliferatif ve immünomodülatör ajanlar olarak yaygın olarak kullanılan 14'ten fazla genetik interferon alfa çeşidi tanımlanmıştır.

Virüsler ve diğer indükleyiciler tarafından indüklenen insan donör kan lökositlerinden insan lökosit interferonunun üretilmesi için bilinen yöntemler (SU1713591, RU 2066188, RU 2080873).

İnterferon üretmeye yönelik bu yöntemlerin ana dezavantajı, nihai ürünün hepatit B ve C virüsü, immün yetmezlik virüsü vb. gibi insan virüsleri ile kontaminasyon olasılığıdır.

Şu anda, mikrobiyolojik sentez yoluyla interferon elde etme yöntemi daha umut verici olarak kabul edilmektedir, bu da hedef ürünün nispeten ucuz bir hammaddeden önemli ölçüde daha yüksek verimle elde edilmesini mümkün kılmaktadır. Bu durumda kullanılan yaklaşımlar, bakteri ekspresyonu için optimal olan yapısal gen varyantlarının yanı sıra ekspresyonunu kontrol eden düzenleyici elementlerin yaratılmasını mümkün kılar.

Başlangıç mikroorganizmaları olarak Pichia pastoris, Pseudomonas putida ve Escherichia coli suşlarının çeşitli yapıları kullanılır.

Bir interferon üreticisi olarak P. pastoris kullanmanın dezavantajı (JN Garcia, JA Aguiar ve diğerleri. // Pichia pastoris'te insan IFN-2b'sinin yüksek düzeyde ifadesi. // Biotecnologia Aplicada, 12 (3), 152-155, 1995 ), bu tür mayaların fermantasyonu için son derece zor koşullar, biyosentez sürecinde indükleyicinin, özellikle metanolün konsantrasyonunu kesinlikle koruma ihtiyacı. Ps kullanmanın dezavantajı. putida (SU1364343, SU1640996, SU1591484, RU1616143, RU2142508), düşük ekspresyon seviyesindeki fermentasyon işleminin karmaşıklığıdır (1 litre kültür ortamı başına 10 mg interferon). Escherichia coli suşlarının kullanılması daha verimlidir (Semin. Oncol., 1997, Iun; 24 (3 Ek 9): S9-41-S9-51).

Çok sayıda plazmit ve bunlara dayalı interferon eksprese eden E. coli suşu bilinmektedir: Z-pBR322 (Psti) HclF-11-206 veya Z-pBR 322 (Pstl) / HclN SN plazmitli E. coli suşları ATCC 31633 ve 31644 35 -AHL6 (SU 1764515), E. coli suşu pINF-AP2 (SU 1312961), E. coli suşu pINF-F-Pa (AU 1312962), plazmit p280 / 21FN ile E. coli SG 20050 suşu (Kravchenko V.V. ve ark. Bioorganic chemistry, 1987, cilt 13, No. 9, sayfa 1186-1193), plazmit pINF14 (SU 1703691) içeren E. coli SG 20050, plazmit pINF16 (RU 2054041) ile E. coli SG 20050 ve diğerleri Bu suşların kullanımına dayanan teknolojilerin dezavantajı, kararsızlıklarının yanı sıra yetersiz interferon ekspresyonu seviyesidir.

Kullanılan suşların özelliklerinin yanı sıra, işlemin etkinliği büyük ölçüde interferonun izolasyonu ve saflaştırılması için kullanılan teknolojiye bağlıdır.

Ps hücrelerinin kültivasyonu dahil, interferon üretimi için bilinen bir yöntem. putida, biyokütlenin yok edilmesi, polietilenimin ile muamele, amonyum sülfat ile fraksiyonlama, fenilsilokrom C-80 üzerinde hidrofobik kromatografi, lizatın pH fraksiyonasyonu, konsantrasyonu ve diafiltrasyonu, selüloz DE-52 üzerinde iyon değişim kromatografisi, bir pH gradyanında elüsyon, selüloz -52 üzerinde iyon değişimi eluenti, bir filtre kasetinden geçirilerek konsantrasyon ve Sephadex G-100 (SU 1640996) üzerinde jel filtrasyonu. Bu yöntemin dezavantajı, karmaşık çok aşamalı fermantasyona ek olarak, nihai ürünün elde edilmesinde çok aşamalı işlemdir.

E. coli suşu SG 20050 / pIF16'nın, termostatlı bir çalkalayıcıda şişelerde LB-su içinde kültivasyonu, biyokütlenin santrifüjlenmesi, bir tampon solüsyonu ile yıkanması ve yok etmek için sonikasyon dahil olmak üzere interferon üretmenin bir yöntemi de bilinmektedir. hücreler. Elde edilen lizat santrifüjlenir, tampon içinde 3M üre çözeltisi ile yıkanır, tampon içinde bir guanidin klorür çözeltisi içinde çözülür, sonikasyona tabi tutulur, santrifüjlenir, oksidatif sülfitoliz, 8 M üreye karşı diyaliz, renatürasyon ve CM-52 selüloz üzerinde son iki aşamalı kromatografi ve Sephadec RU 2054041). Bu yöntemin dezavantajları, izolasyon ve saflaştırma işleminin ana aşamalarının nispeten düşük verimliliğidir. Bu özellikle, ürünün ultrasonik tedavisi, diyaliz ve interferon veriminin kararsızlığına yol açan oksidatif sülfitoliz ve ayrıca bu yöntemin endüstriyel interferon üretimi için kullanılmasının imkansızlığı için geçerlidir.

En yakın analog (prototip) olarak, insan lökosit interferonunu üretmek için bir yöntem belirtilebilir; bu, rekombinant bir E. coli suşunun yetiştirilmesinden, elde edilen biyokütlenin -70 ° C'den yüksek olmayan bir sıcaklıkta dondurulmasından, buzun çözülmesinden, hücrelerin yok edilmesinden oluşur. bir mikroorganizmanın lizozim ile ayrıştırılması, DNaz lizatına sokularak DNA ve RNA'nın uzaklaştırılması ve izole edilmiş çözünmeyen interferon formunun deterjanlarla bir tampon çözeltisi ile yıkanarak saflaştırılması, interferon çökeltisinin guanidin hidroklorür çözeltisi içinde çözülmesi, renatürasyon ve tek aşamalı saflaştırma iyon değişim kromatografisi. Üretici olarak, üç promotör içeren rekombinant plazmit pSS5 kullanılarak elde edilen E. coli SS5 suşu kullanıldı: Plac, Pt7 ve P trp ve nükleotid ikameleri ile birlikte alfa-interferon geni.

Bu plazmidi içeren E. coli suşu SS5 tarafından interferon ekspresyonu, üç promotör tarafından kontrol edilir: Plac, P t7 ve P trp. İnterferonun ekspresyon seviyesi, 1 litre hücre süspansiyonu başına yaklaşık 800 mg'dır (RU 2165455).

Bu yöntemin dezavantajı, hücrelerin enzimatik yıkımının, mikroorganizmanın DNA ve RNA'sının kullanımının düşük üretilebilirliği ve interferonun tek aşamalı kromatografik saflaştırılmasıdır. Bu, interferon salım sürecinin kararsızlığına neden olur, kalitesinde bir düşüşe yol açar ve interferonun endüstriyel üretimi için yukarıdaki şemayı kullanma olasılığını sınırlar. Bu plazmitin ve buna dayanan suşun dezavantajları, T7 RNA polimeraz geninin lac operon altında yer aldığı E. coli BL21 (DE3) suşunda T7 fajının güçlü bir regüle edilmemiş promotörünün plazmitinde kullanılmasıdır. destekleyici ve her zaman "akar". Sonuç olarak, interferon sentezi hücrede sürekli olarak meydana gelir, bu da plazmitin ayrışmasına ve suşun hücrelerinin canlılığının azalmasına ve bunun sonucunda interferon veriminde bir azalmaya yol açar.

Bu buluşun amacı, yüksek seviyede interferon biyosentezi olan yeni bir rekombinant plazmit DNA'yı kullanarak bir rekombinant endüstriyel E. coli üretici suşunu inşa etmek ve tıbbi amaçlar için bir interferon maddesi üretmek için, kalite olarak aşağıdakilere tekabül eden etkili bir endüstriyel teknoloji geliştirmektir. interferon alfa-2b maddesi için "Avrupa Farmakopesi".

Bu sorun, VKPM B-8550 numaralı Federal Devlet Üniter Girişimi GosNII Genetics'in Tüm Rusya endüstriyel suşları koleksiyonunda saklanan bir rekombinant plazmit DNA pSX50 ve bir Escherichia coli SX50 suşu yaratılarak çözüldü.

ayrıca rekombinant E. coli SX50 suşunun kullanımına dayalı rekombinant alfa-2b interferon üretmeye ve biyosentez sırasında sürekli besin substratlarının eklenmesiyle azaltılmış triptofan içeriğine sahip bir besleyici ortam üzerinde derin ekimini sağlamaya yönelik bir yöntem, mekanik yıkım yüksek basınçta mikroorganizma hücrelerinin parçalanması, konsantre bir guanidin hidroklorür çözeltisi içinde toplanmış proteinin çözünmesi, ardından interferonun kaotropik ajanlar varlığında fizyolojik tampon çözeltilerinde renatürasyonu ve Şelatlayıcı Sefaroz Hızlı Akış reçineleri üzerinde interferonun üç aşamalı kromatografik saflaştırılması Cu +2 iyonları ile immobilize edilmiş tip, CM Flow tipi iyon değişim reçineleri üzerinde iyon değişim kromatografisi ve Superdex 75 reçineleri üzerinde CM Sepharose jel filtrasyon kromatografisi.

Buluşa göre, ekspresyonu laktoz ve triptofan promotörlerinin ve transkripsiyon terminatörünün kontrolü altında olan insan lökosit alfa-2b interferonunun sentezini kodlayan yeni bir rekombinant çok kopyalı plazmit DNA pSX50 sağlanmaktadır. Plazmid pSX50, 3218 baz çiftine (bp) sahiptir ve aşağıdaki parçalarla karakterize edilir:

1 nükleotitten 176 nükleotite (nt) kadar olan dizi, triptofan promotörünü (P trp) içeren 176 bp'lik bir DNA fragmanını içerir;

177 n'den dizi 194 N. translasyonun başlatılmasından sorumlu Shine Delgarno dizisini içeren 18 bp'lik sentetik bir DNA parçasını içerir;

AD 195'ten itibaren sıralanmıştır 695 N'ye kadar aşağıdaki nükleotid ikameleri ile interferon geninin dizisini içeren 501 bp'lik bir DNA fragmanını içerir: 37 konumunda, A'dan C'ye bir değişiklik, 39. konumda, G'den T'ye bir değişiklik, 40. konumda bir değişiklik, A'dan bir değişiklik C'ye, 42 konumunda, G'den T'ye bir değişiklik, 67 konumunda, A'nın C ile değiştirilmesi, 69 konumunda, G'nin T ile değiştirilmesi, 70 konumunda, A'nın C ile değiştirilmesi, 72 konumunda, A ile T, 96 konumunda, G'nin A ile değiştirilmesi, 100 konumunda, A'nın C ile değiştirilmesi, 102 konumunda A'nın T'ye değiştirilmesi, 114 konumunda A'nın C'ye değiştirilmesi, 120 konumunda C'nin G'ye değiştirilmesi, 126 konumunda G'yi A olarak değiştir, 129 konumunda G'yi A olarak değiştir, 330 konumunda C'yi G olarak değiştir, 339 konumunda G'yi A ile değiştir, 342 konumunda G'yi A ile değiştir, 487 konumunda A'yı C ile değiştir, 489 konumunda A'nın T ile değiştirilmesi, 495 konumunda G'nin A ile değiştirilmesi;

696 n'den dizi. 713 N'ye kadar sentetik bir poli-bağlayıcı içeren 18 bp'lik sentetik bir DNA parçasını içerir;

714 n'den dizi. 1138 yılına kadar 4129 nt ile plazmit pKK223-3'ün bir DNA parçasını içerir. 4553 N'ye kadar. katı transkripsiyon sonlandırıcı rrnBT 1 T 2 dizisini içeren 425 bp boyutunda;

MS 1139'dan dizi MS 1229'a kadar 2487 nt ile plazmit pUC19'un bir DNA fragmanını içerir. 2577'ye kadar 91 bp büyüklüğünde, β-laktoz geninin promotörünü içeren (ampisilin direnç geni - Amp R);

MS 1230'dan dizi 2045'e kadar 720 nt ile plazmit pUC4K'nın bir DNA parçasını içerir. 1535 yılına kadar kan geninin yapısal bölgesini içeren boyut 816 bp;

2046 AD'den dizi 3218'e kadar 1625 ila 453 nt plazmit pUC19'un bir DNA parçasını içerir. 1173 bp büyüklüğünde, plazmit (ori) ve lac promotörünün (P lac) replikasyonundan sorumlu diziyi içerir.

Şekil 1-5, plazmit pSX50'nin yapım şemalarını ve fiziksel haritasını göstermektedir.

Şekil 6, plazmit pSX50 için tam nükleotid dizisini gösterir.

Escherichia coli SX50 suşu, geleneksel genetik mühendisliği teknolojisi kullanılarak Escherichia coli BL21 hücrelerinin pSX50 plazmidi ile dönüştürülmesiyle elde edildi. E. Coli SX50 suşu aşağıdaki özelliklerle karakterize edilir.

Kültürel ve morfolojik özellikler

Hücreler küçük, düz, kalınlaşmış çubuk şeklinde, gram negatif, sportif değil. Hücreler basit besin ortamlarında iyi büyür. Difco agarda büyürken yuvarlak, pürüzsüz, dışbükey, bulutlu, parlak, düzgün kenarlı gri koloniler oluşur. Sıvı ortamda (glikoz içeren minimal bir ortamda veya LB et suyunda) büyürken yoğun, eşit bir pus oluştururlar.

Fiziko-biyolojik işaretler

Aerobe. Büyüme için sıcaklık aralığı, optimum pH 6.5-7.5 ile 4-42 ° C'dir.

Azot kaynağı olarak hem amonyum ve nitrat formlarındaki mineral tuzlar hem de amino asitler, pepton, tripton, maya özütü vb. formundaki organik bileşikler kullanılır.

Karbon kaynağı olarak amino asitler, gliserin, karbonhidratlar kullanılır. Antibiyotik direnci. Hücreler kanamisine direnç gösterir (100 μg/ml'ye kadar).

Escherichia coli 8X50 suşu bir interferon üreticisidir.

Suşun saklanması için ortamın yöntemi, koşulları ve bileşimi

Yağ altında 20 μg / ml'lik bir konsantrasyona kanamisin ilavesiyle L-arape'de, eksi 70 ° C sıcaklıkta ampullerde% 15 gliserol ve karşılık gelen antibiyotikleri içeren L-et suyunda, ampullerde liyofilize bir durumda artı 4 ° C'lik bir sıcaklık

Escherichia coli SX50 suşu, Bergi's Guide (1974) tarafından Escherichia coli türünün bir suşu olarak tanımlanmıştır.

Alfa-2b interferonun endüstriyel üretimi için bir yöntem

Önerilen yöntemin bir özelliği, interferonu fermantasyon sırasında biriken çözünmeyen formdan izole etmenize izin veren, izolasyon sürecinin işlem akış şemasını önemli ölçüde basitleştirebilen ve hedef ürünün verimini artırabilen teknolojinin geliştirilmesidir.

Yöntem, biyosentez sürecinde, tercihen azaltılmış bir triptofan içeriği ile, besin substratlarının, tercihen glikoz ve maya ekstraktının sürekli eklenmesiyle, bir besin ortamında Escherichia coli SX50 suşunun kültivasyonunu içerir. 700-900 bar yüksek basınç, interferonun tampon guanidin hidroklorür solüsyonunda çözünmesi, interferonun kaotropik ajanların varlığında fizyolojik tampon solüsyonlarında renatürasyonu, ardından Cu ile immobilize edilmiş Chelating Sepharose Fast Flow reçineleri üzerinde interferonun üç aşamalı kromatografik saflaştırılması +2 iyon, Superdex 75 tipi CM tipi jel Sepharose Flow reçinelerinin iyon değişim reçineleri üzerinde iyon değişim kromatografisi.

İnterferon elde etmenin bireysel aşamaları için en uygun koşullar aşağıdaki gibidir:

Fermentasyon, tüm süreç boyunca sürekli substrat ilavesiyle gerçekleştirilir, bu da yüksek düzeyde interferon ekspresyonuna yol açar;

Hücrelerin yok edilmesi, Gaulin tipi bir parçalayıcıda 900 barlık bir basınçta gerçekleştirilir;

Çözünür hücresel bileşenlerin (DNA, RNA, proteinler, lipopolisakaritler, vb.) çıkarılması, çözünmeyen interferon formunun deterjan içeren tampon çözeltileri (Triton XI00, üre, vb.) ile yıkanmasıyla gerçekleştirilir;

Ortaya çıkan interferon içeren çökelti, 6 M guanidin hidroklorürden oluşan bir tampon çözeltisi içinde çözülür;

İnterferonun renatürasyonu, kaotropik ajanlar içeren fizyolojik bir tampon solüsyonunda gerçekleştirilir;

İnterferonun üç aşamalı kromatografik saflaştırması, bir CM Sepharose Fast Flow katyon değişim reçinesi üzerinde Cu +2 iyonları ile hareketsizleştirilmiş Şelatlayıcı Sepharose Fast Flow üzerinde ve bir Superdex 75 tipi reçine üzerinde jel filtrasyon kromatografisi üzerinde gerçekleştirilir;

Her kromatografik saflaştırmadan sonra, gözenek boyutu 0,22 μm olan pirojen içermeyen filtreler aracılığıyla sterilizasyon filtrasyonu gerçekleştirilir.

Tarif edilen yöntemin uygulanması sonucunda interferon verimi, 1 litre kültür ortamından yaklaşık 400-800 mg interferondur. Elde edilen ürünün kalitesi, alfa-2b interferon maddesi için "Avrupa Farmakopesi" standartlarını ve gerekliliklerini karşılamaktadır.

Önerilen yöntem ile prototip arasındaki temel farklar şunlardır:

Biyosentez sırasında 1 litre kültür ortamından daha büyük miktarda interferon elde etmeyi mümkün kılan daha yüksek üretkenliğe sahip bir suş yapısının kullanılması;

Çözünmeyen interferon formunun daha saf bir ekstraktını daha kısa sürede ve daha az kayıpla elde etmenizi sağlayan hücre biyokütlesinin etkili mekanik imhasının kullanılması;

Kaotropik ajanların mevcudiyetinde renatürasyon sırasında fizyolojik tampon solüsyonlarının kullanılması, doğru şekilde renatüre edilmiş interferon formunun verimini arttırır;

İnterferonun üç aşamalı kromatografik saflaştırılması, jelleri gümüşle boyarken indirgeyici ve indirgeyici olmayan koşullarda elektroforeze göre %99'dan fazla saflıkta ve RF HPLC'ye göre %98'den fazla ve pratik olarak pirojensiz interferon maddesi elde etmeyi mümkün kılar ( LAL testi).

Talep edilen buluş grubunun özü ve avantajları aşağıdaki örneklerle gösterilmektedir.

Örnek 1. Rekombinant plazmit pSX50'nin yapısı

Plazmit pSX50 oluşturma yöntemi aşağıdaki adımları içerir:

Vektör plazmid pSX10'un yapımı;

1. plazmid pSX3'ün yapısı (2641 bp)

2. vektör plazmid pSX10'un (2553 bp) yapımı

Rekombinant plazmit pSX41'in (3218 bp) oluşturulması;

Rekombinant plazmit pSX43'ün (3218 bp) oluşturulması;

Rekombinant plazmit pSX45'in (3218 bp) oluşturulması;

Rekombinant plazmit pSX50'nin (3218 bp) oluşturulması.

Vektör plazmid pSX10'un yapımı

Vektör plazmidi pSX10, ampisiline direnç sağlayan beta-laktoz geninin kodlama dizisinin, kan geninin kodlama dizisi ile değiştirildiği ve plazmid pKK223-3'ten bir transkripsiyonel sonlandırıcı içerdiği bir vektör pUC19'dur.

Vektör plazmid pSS10'un yapımı iki aşamada gerçekleştirilir:

amp geninin kodlama bölgesinin kan geninin kodlama bölgesi ile değiştirildiği bir plazmit pUC19 olan plazmit pSX3'ün (2641 bp) elde edilmesi;

Bir pSX3 plazmidi olan rüzgar plazmidi pSX10'un (2553 bp) elde edilmesi, içinde transkripsiyon sonlandırıcı rBT1 T2'yi kodlayan bir DNA fragmanı BamHI bölgesinin arkasına eklenir.

Plazmit pSX3 elde etmek için, PCR (polimeraz zincir reaksiyonu) ile beş tur DNA amplifikasyonu gerçekleştirilir. İlk tur sırasında, bir şablon olarak plazmit pUC19'un DNA'sı kullanılarak, 1828 bp'lik bir DNA parçasının amplifikasyonu gerçekleştirilir. (parça PU1-PU2) primerleri kullanarak:

Bu ve sonraki PCR reaksiyonları aşağıdaki koşullar altında gerçekleştirilir: 20 mM Tis-HCl, pH 8.8, 10 mM (NH4)2S04, 10 mM KCl, 2 tM MgCl2, %0.1 Triton X100, 0.1 mg/ml BSA, her dNTP'den 0.2 mM, 1.25 birim. Pfu DNA polimeraz, 100 ng DNA. Amplifikasyon işlemi şu aşamalardan oluşur: 95 °C'de 5 dakika ısıtma, 35 PCR döngüsü (95 °C'de 30 saniye, 56 °C'de 30 saniye, 72 °C'de 2 dakika) ve 72 °C'de 10 dakika inkübasyon °C Amplifikasyondan sonra (ve sonraki amplifikasyonlardan sonra), DNA fragmanı, %1 agaroz jel içinde elektroforez ile saflaştırılır. İkinci ve üçüncü turlar sırasında, bir şablon olarak pUC4K plazmit DNA'sı kullanılarak, 555 bp'lik bir DNA parçası amplifiye edilir. (parça KM1-KM2) primerleri kullanarak:

ve 258 bp'lik bir DNA parçasının amplifikasyonu. (KMZ-KM4) primerler ile

PCR'nin beşinci turunda, fragmanlar (PU1-PU2) ve (KM1-KM4) aşağıdaki koşullar altında birleştirilir: 95 ° C'de 5 dakika ısıtma, 5 PCR döngüsü (30 saniye 95 ° C, 30 saniye 56 ° C, 10 dk 72°C) ve 72°C'de 10 dk inkübasyon. Son PCR'den sonra elde edilen DNA, doğrudan E. coli DH5 suşunun hücrelerine dönüştürülür ve 20 µg/ml kanamisin içeren LA ortamına kaplanır. 37°C'de 12 saat inkübasyondan sonra klonlar taranır, plazmit DNA izole edilir ve restriksiyon analizi yapılır. Sonuç olarak, 2641 bp büyüklüğünde plazmit pSX3 elde edilir.

Vektör plazmiti pSX10'u elde etmek için, PCR ile üç tur DNA amplifikasyonu gerçekleştirilir. İlk tur sırasında, bir şablon olarak plazmit pSX3'ün DNA'sı kullanılarak, 2025 bp'lik bir DNA parçasının amplifikasyonu gerçekleştirilir. (parça 10.1-10.2) primerleri kullanarak:

İkinci tur sırasında, bir şablon olarak plazmit pKK223-3'ün DNA'sı kullanılarak, 528 bp'lik bir DNA parçasının amplifikasyonu gerçekleştirilir. (parça KK1-KK2) primerleri kullanarak:

PCR'nin üçüncü turunda, fragmanlar (10.1-10.2) ve (KK1-KK2) aşağıdaki koşullar altında birleştirilir: 95 ° C'de 5 dakika ısıtma, 5 PCR döngüsü (30 sn 95 ° C, 30 sn 56 °) C, 10 dk 72°C) ve 72°C'de 10 dk inkübasyon. Son PCR'den sonra elde edilen DNA, doğrudan E. coli DH5 suşunun hücrelerine dönüştürülür ve 20 µg/ml kanamisin içeren LA ortamına kaplanır. 37°C'de 12 saat inkübasyondan sonra klonlar taranır, plazmit DNA izole edilir ve restriksiyon analizi yapılır. Sonuç olarak, 2553 bp büyüklüğünde plazmit pSX10 elde edilir.

Rekombinant plazmit pSX41'in yapımı

Rekombinant plazmit pSX41, vektör plazmiti pSX3'ün (2529 bp) bir Hind III - BamHI DNA parçası, Hind III - EcoRI, E. coli triptofan operon promotörünü (P trp) kodlayan 168 bp'lik bir DNA parçası, EcoRI-XbaI sentetik DNA parçası 20 bp kodlayan SD dizisi (Shine-Delgarno) ve insan interferon alfa 2b genini kodlayan 501 bp'lik XbaI-BamHI DNA parçası.

Vektör plazmiti pSX3'ün (2529 bp) bir DNA parçası olan Hind III - BamHI'yi elde etmek için, plazmit pSX3'ün DNA'sı HindIII ve BamHI kısıtlama enzimleri ile işlenir, ardından %1 agaroz jel içinde elektroforetik saflaştırma yapılır. Triptofan operon promotörünü (P trp) kodlayan 168 bp'lik Hind III EcoRI DNA fragmanı, bir şablon olarak toplam E. coli DNA'sı ve TRP1 ve PRP2 primerleri kullanılarak PCR ile elde edildi, ardından amplifiye fragmanın Hindlll ve restriksiyon enzimleri ile işlenmesi takip edildi. EcoRI:

SD dizisini (Shine-Delgarno) kodlayan 20 bp'lik bir sentetik DNA parçası olan EcoRI-Xbal'i elde etmek için aşağıdaki tamamlayıcı oligonükleotitler sentezlenir:

İnsan interferon alfa 2b genini kodlayan bir 501 bp XbaI-BamIII DNA fragmanı, bir şablon olarak toplam insan DNA'sı ve IFN1 ve IFN2 primerleri kullanılarak PCR ile elde edilir, ardından amplifiye fragmanın kısıtlama endonükleazları Xbal ve BamIII ile muamelesi yapılır:

Daha sonra elektroforetik olarak saflaştırılmış parçalar birleştirilir, T4 faj ligaz enzimi ile bağlanır, DNA, E. coli DH5 türünün hücrelerine dönüştürülür ve 20 ug / ml kanamisin içeren LA ortamı üzerine kaplanır. 37°C'de 12 saat inkübasyondan sonra klonlar elenir, plazmit DNA izole edilir, restriksiyon analizi yapılır ve DNA'nın birincil yapısı belirlenir. Sonuç olarak, 3218 bp'lik bir plazmit pSX41 elde edilir. Ardından, hedef ürünün ekspresyon seviyesini arttırmak için interferon geninin aşamalı mutagenezi gerçekleştirilir. İnterferon geninin mutajenezi, karşılık gelen amino asitleri kodlayan E. coli'de nadiren bulunan üçlülerin, genellikle aynı amino asitleri kodlayan E. koli'de bulunan üçlülerle değiştirilmesinden oluşur. İnterferon geninin DNA mutagenezi, PCR ile gerçekleştirilir.

Rekombinant plazmit pSX43'ün yapısı

Rekombinant plazmit pSX43'ü elde etmek için, bir şablon olarak plazmit pSX41'in DNA'sı ve IFN3 ve IFN4 primerleri kullanılarak PCR ile bir tur DNA amplifikasyonu gerçekleştirilir:

PCR, aşağıdaki koşullar altında gerçekleştirilir: 95 °C'de 5 dakika ısıtma, 20 PCR döngüsü (95 °C'de 30 saniye, 56 °C'de 30 saniye, 72 °C'de 10 dakika) ve 72 °C'de 20 dakika inkübasyon °C PCR'den sonra elde edilen DNA, doğrudan E. coli DH5 suşunun hücrelerine dönüştürülür ve 20 µg/ml kanamisin içeren LA ortamına kaplanır. 37°C'de 12 saat inkübasyondan sonra klonlar elenir, plazmit DNA izole edilir, restriksiyon analizi yapılır ve DNA'nın birincil yapısı belirlenir. Sonuç olarak, 3218 bp boyutunda plazmit pSX43 elde edilir.

Rekombinant plazmit pSX45'in yapısı

Rekombinant plazmit pSX45'i elde etmek için, bir şablon olarak plazmit pSX43'ün DNA'sı ve IFN5 ve IFN6 primerleri kullanılarak PCR ile bir tur DNA amplifikasyonu gerçekleştirilir:

Rekombinant plazmit pSX50'nin yapımı.

Rekombinant plazmit pSX50'yi elde etmek için, bir şablon olarak plazmit pSX45'in DNA'sı ve IFN7 ve IFN8 primerleri kullanılarak PCR ile bir tur DNA amplifikasyonu gerçekleştirilir:

Örnek 2. Bir E. coli SX50 suşunun elde edilmesi - interferon üreticisi

İnterferon E. coli SX50 üreten suş, E. coli BL21 suşunun hücrelerinin rekombinant plazmit pSX50 ile dönüştürülmesiyle elde edilir. İnterferon üreten suş, 30 L'lik bir fermenterde 25.0-30.0 o.u optik yoğunluğa büyütülür. %1 asit kazein hidrolizatı (Difco), %1 glukoz, 40 μg/ml kanamisin içeren M9 ortamında, 38-39 °C sıcaklıkta. Fermantasyon sırasında, besin substratı, bir gravitometrik kontrolör kullanılarak sürekli olarak eklenir.

Örnek 3. E. coli SX50 suşundan interferon izole etme yöntemi

İnterferon 4 aşamada elde edilmiştir:

Aşama 1. E. coli SX50 suşunun yetiştirilmesi.

2. aşama. Çözünmeyen interferon formunun izolasyonu ve saflaştırılması.

Sahne 3. İnterferonun çözünmesi ve renatürasyonu.

4. Aşama İnterferonun kromatografik saflaştırılması.

Aşama 1. E. coli SX50 suşunun yetiştirilmesi

26 ° C'de 12 saat boyunca 3 l zengin LB ortamı hacminde E. coli SX50 suşunun yetiştirilen aşısı, M9, %1 kazein hidrolizatı, 1 içeren 27 l steril ortam içeren bir fermentere aseptik olarak verilir. % glikoz, 1 mM MgCl2, 0.1 mM CaCl2, 40 mg/ml kanamisin. Bir fermenterde yetiştirme, %40 sodyum hidroksit çözeltisi ile otomatik titrasyon yoluyla pH'ı 7 ± 0.15'te koruyarak 38-39 °C'lik bir sıcaklıkta gerçekleştirilir. Doygunluğun % 50 ± 10'u aralığındaki çözünmüş oksijen konsantrasyonu, karıştırıcının hızı 100 ila 800 rpm arasında ve hava beslemesi 1 ila 15 l / dak arasında değiştirilerek korunur. Substratların konsantrasyonu, özellikle glikoz ve maya özütü, fermantasyon sırasında ölçülür ve konsantrasyonları, bir gravimetrik kontrolör kullanılarak peristaltik pompalar aracılığıyla konsantre çözeltilerin besleme hızı değiştirilerek korunur.

Çözünmeyen interferon birikimi, faz kontrast mikroskobu, %15 poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAAG) ve ters fazlı yüksek performanslı kromatografi (RF HPLC) ile izlenir. Maksimum optik yoğunluğa (~ 25-30 pu) ulaşıldıktan ve interferon sentezi durdurulduktan sonra fermantasyon durdurulur. Fermentasyonun sonunda kültür sıvısı, 5000-10000 rpm dönüş hızında bir akış rotorunda santrifüjleme ile ayrılır. Biyokütle plastik torbalarda paketlenir ve eksi 70 °C'de dondurulur.

2. aşama. Çözünmeyen interferon formunun izolasyonu ve saflaştırılması

E. coli SX50 soyunun 300-400 g donmuş biyokütlesi, 3000 ml tampon 1 (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM EDTA, %0.1 Triton X100) içinde süspanse edilir. Süspansiyon, Gaulin tipi bir akış homojenleştiriciden geçirilir, 900 bar'da tutulur ve 15.000 rpm'de bir akış rotorunda santrifüjlenir. Elde edilen çökelti benzer koşullar altında sırayla tampon 2 (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 3 M üre) ve tampon 3 (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA) ve son olarak interferon ile yıkanır. çökelti 200 ml tampon 3 içinde süspanse edilir. Bu durumda, çözünmeyen interferon formunun izolasyonu ve saflaştırılması süresi 5 saatten fazla değildir.

Sahne 3. İnterferonun çözünmesi ve renatürasyonu

Önceki aşamada elde edilen çözünmeyen interferon formunun süspansiyonuna, 6 M'lik bir konsantrasyona kuru guanidin hidroklorür eklenir, 50 mM'lik bir konsantrasyona ditiyotreitol, 50 mM'lik bir konsantrasyona kadar Tris-HCl pH 8.0, NaCl eklenir. 150 mM'lik bir konsantrasyona ve Triton X100, %0,1'lik bir konsantrasyona kadar, oda sıcaklığında 2 saat inkübe edilir.Çözünmemiş malzeme, 0.22 mikron gözenek çaplarına sahip membranlardan sterilize edilerek süzülerek ayrılır.

İnterferonun renatürasyonu, elde edilen solüsyonun tampon 4 (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 100 mM NaCl, 0.1 mM EDTA) ile 100-200 kez yavaş yavaş seyreltilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra renatürasyon karışımı, 4-8 ° C sıcaklıkta 12-15 saat boyunca sürekli karıştırılarak inkübe edilir. Daha sonra, 1 mM'lik bir konsantrasyona magnezyum sülfat eklenir ve agrege olan malzeme, gözenek çapı 0.22 mikron olan bir membran filtreden süzme ile sterilize edilerek çıkarılır.

4. Aşama interferonun kromatografik saflaştırılması

İnterferonun kromatografik saflaştırılması üç aşamada gerçekleştirilir.

1. Elde edilen renatüre interferon, Cu +2 iyonları ile hareketsiz hale getirilmiş bir Chelating Sepharose Fast Flow reçinesi (Amersham Biosciences) üzerinde afinite kromatografisiyle ilk aşamada saflaştırılır. Bunun için Cu +2 Şelatlayıcı Sefaroz Hızlı Akışlı bir kolona bir interferon solüsyonu uygulanır ve interferon 0.1 M sitrik asit tamponu, pH 2.2 ile ayrıştırılır.

2. Kromatografik saflaştırmanın ikinci aşamasında, bir CM Sepharose Fast Flow katyon değişim reçinesi (Amersham Biosciences) üzerine bir interferon solüsyonu uygulanır ve interferon, 50'lik bir tamponda bir solüsyon gradyanı (0.0-0.5 M NaCl) ile ayrıştırılır. mM Na (CH3COO), pH 5.5.

3. İnterferonun monomerik formunun interferonun polimerik formlarının tortularından saflaştırılması, interferonun bir Superdex 75 reçinesi (Amersham Biosciences) üzerinde jel filtrasyonu ile saflaştırılmasının üçüncü aşamasında gerçekleştirilir. Kromatografi, 0.15 M NaCl içeren 50 mM Na (CH3COO) tamponu, pH 5.0 içinde gerçekleştirilir.

Tarif edilen interferonun izolasyonu ve saflaştırılması yöntemi, 10 litre kültür ortamından elde edilen biyokütleden 7-10 gün boyunca bir izolasyon döngüsünde 4-8 g yüksek oranda saflaştırılmış interferon elde edilmesini sağlar. Elde edilen interferonun kalitesi, interferon alfa-2b maddesi için "Avrupa Farmakopesi" gerekliliklerine tam olarak uygundur, yani:

İnterferon konsantrasyonu 2 × 108 IU / ml'den az değildir;

İnterferonun spesifik aktivitesi 2.0 x 108 IU / mg'dan az değildir;

Jellerin gümüş ile boyanması sırasında indirgeyici ve indirgeyici olmayan koşullar altında preparasyonun elektroforetik saflığı %99'dan az değildir;

İzole interferonun izoelektrik noktası pH 5.8-6.3 aralığındadır;

İzole edilmiş interferonun peptit haritası, interferon alfa 2b CRS için Avrupa standardına yönelik peptit haritasından temel olarak farklı değildir;

Yukarıdaki örneklerden aşağıdaki gibi, talep edilen buluş grubu, nispeten basit ve güvenilir bir teknoloji ile yüksek verimde interferon alfa-2b elde etmeyi mümkün kılar.

İDDİA

1. Rekombinant insan alfa-2b interferonunun sentezini kodlayan rekombinant plazmit DNA pSX50, 3218 baz çifti (bp) boyutuna sahip olması ve aşağıdaki parçalardan oluşması ile karakterize edilir: 1 ila 176 nükleotit (bp) dizisini içerir. 176 bp büyüklüğünde, triptofan promotörünü (P trp) içeren, 177'den 194 nt'ye kadar dizili DNA parçası. translasyonun başlatılmasından sorumlu olan Shine Delgarno dizisini içeren 18 bp'lik sentetik bir DNA fragmanı içerir, dizi 195 ila 695 nt arasındadır. 37 (A>C), 39 (G>T), 40 (A>C), 42 (G>T), 67 (A>C) ile interferon alfa-2b genini içeren 501 bp'lik bir DNA parçasını içerir. ), 69 (G> T), 70 (A> C), 72 (A> T), 96 (G> A), 100 (A> C), 102 (A> T), 114 (A> C) , 120 (C> G), 126 (G> A), 129 (G> A), 330 (C> G), 339 (G> A), 342 (G> A), 487 (A> C), 489 (A> T), 495 (G> A), 696'dan 713'e kadar dizi. 714 ila 1138 bp arasında bir sentetik polibağlayıcı içeren 18 bp'lik sentetik bir DNA fragmanını içerir. 4129 ila 4553 nt arasında plazmit pKK223-3'ün bir DNA fragmanını içerir. katı transkripsiyon sonlandırıcı rrnBT 1 T 2 dizisini içeren 425 bp boyutunda, 1139 ila 1229 nt arası dizi. 2487'den 2577 nt'ye kadar plazmit pUC19'un bir DNA fragmanını içerir. 91 bp boyutunda, β-laktoz geninin promotörünü (ampisilin -Amp R'ye karşı gen direnci) içeren, 1230 ila 2045 nt arası dizi. 720 nt ile plazmit pUC4K'nın bir DNA parçasını içerir. 1535 yılına kadar Kan geninin yapısal bölgesini içeren boyut olarak 816 bp, 2046 bp'den dizi. 3218'e kadar 1625 ila 453 nt plazmit pUC19'un bir DNA parçasını içerir. 1173 bp büyüklüğünde, plazmit (ori) ve lac promotörünün (P lac) replikasyonundan sorumlu diziyi içerir.

2. İstem l'e göre rekombinant plazmit ile transforme edilmiş bakteri suşu Eschcerichia coli SX50 - rekombinant insan lökosit interferon alfa-2b üreticisi.

3. İstem 2'ye göre Escherichia coli SX5 suşunun biyosentez sırasında besin substratlarının sürekli eklenmesiyle bir besin ortamında kültivasyonu, 700-°C'lik bir basınçta mikroorganizma hücrelerinin mekanik olarak yok edilmesini içeren bir insan interferon alfa-2b elde etme yöntemi. 900 bar, interferonun bir guanidin hidroklorür tampon solüsyonunda çözünmesi, interferonun kaotropik ajanlar varlığında fizyolojik tampon solüsyonlarında renatürasyonu, Cu +2 iyonları ile immobilize edilmiş Chelating Sepharose Fast Flow reçineleri üzerinde interferonun üç aşamalı kromatografik saflaştırılması, iyon değişimi CM Sepharose Fast Flow iyon değişim reçineleri üzerinde kromatografi ve Superdex 75 reçineleri üzerinde jel filtrasyon kromatografisi ...

4. Yetiştirmenin, besin substratlarının, tercihen glikoz ve maya ekstraktının sürekli eklenmesiyle azaltılmış triptofan içeriğine sahip bir besin ortamında gerçekleştirildiği, istem 3'e göre yöntem.

5. İstem 3'e göre yöntem olup, bu yöntemde, interferonun çözülmesinden önce, DNA, RNA, proteinler, lipopolisakaritler dahil olmak üzere çözünür hücresel bileşenlerin çıkarılması, Triton XI 00, üreler gibi deterjanlar içeren tampon çözeltileri ile yıkanması yoluyla saflaştırılmaktadır.

6. İstem 3'e göre yöntem olup, bu yöntemde, her kromatografik saflaştırmadan sonra, sterilizasyon filtrasyonu, gözenek boyutu 0,22 um olan filtreler aracılığıyla gerçekleştirilir.

2018-02-02T17: 43:00 + 03:00

interferon alfa 2b'nin kanıtlanmış etkinliği

Bilim adamları Alik Isaacs ve Jean Lindenmann, parazit gibi bir fenomen keşfettiklerinde, insan vücudunun doğal bir proteini olan interferon'u ilk kez dünya, 1957'de öğrendi - vücudun mümkün olduğu karmaşık bir biyolojik süreç mekanizması. çeşitli hastalıklarla savaşmak için. Ancak geçen yüzyılda muhtemelen bu proteinin birçok ilacın ana bileşeni olacağından şüphelenmediler.

İnterferonlar, virüsler içlerine girdiğinde vücut hücreleri tarafından üretilen proteinlerdir. Onlar sayesinde, virüs proteinlerinin sentezini baskılayarak ve çoğalmasını önleyerek antiviral etki sağlayan koruyucu hücre içi moleküllerin sentezinden sorumlu olan genler aktive edilir. Başka bir deyişle, vücudumuzdaki bu proteinler (bunlara sitokinler de denir), sağlığımızı koruyan ve gerekirse virüs saldırılarını hemen püskürtmek ve hastalığı yenmek için kesinlikle uyanık olan güçlü savunucular olarak hareket eder.

Virüs bulaşmış vücudu korumak için vücudumuzdaki hemen hemen tüm hücreler tarafından interferon üretilir. Ayrıca oluşumu sadece virüsler tarafından değil bakteriyel toksinler tarafından da uyarılabilir, bu nedenle bu protein bazı bakteriyel enfeksiyonlarda da etkilidir. Böylece, bu sitokinin insan bağışıklık sisteminin çok önemli bir bileşeni olduğu sonucuna varılabilir. Onsuz, insanlık çok sayıda virüs ve bakteri tarafından uzun süre yenilmiş olurdu.

interferon türleri

İnterferonlar, farklı hücreler tarafından üretilen alfa, beta ve gama olmak üzere üç tipe ayrılır.

İnterferon alfa, virüsleri, bakterileri ve diğer "düşman" ajanlarını yok eden doğal öldürücü hücreleri - lökositleri aktive eder.
İnterferon beta, bulaşıcı ajanları emen fibroblastlarda, epitel hücrelerinde ve makrofajlarda üretilir.
İnterferon gama, T-lenfositler tarafından üretilir, ana işlevi ve diğer türleri, bağışıklığın düzenlenmesidir.

ARVI'da interferonun etkinliği nasıl kanıtlanmıştır?

Bildiğiniz gibi, faaliyetlerinde, doktorlar terapiyi reçete ederken deneyimlerine ve önceden kurulmuş bilgi sistemine güvenirler. Ancak tıp hızla gelişiyor: Dünyada her yıl yeni etkili tedavi yöntemleri geliştiriliyor ve yeni ilaçlar patentleniyor. Bu nedenle, klinik kılavuzlar ve tedavi standartları ile sonuçlanan tıptaki en son gelişmeleri ve keşifleri sistematik hale getirmek gerekli hale geldi. Kanıtlanmış klinik deneyime dayanan bu belgelenmiş algoritmalar, takip edilmesi gereken hastalıkların teşhisi, tedavisi, rehabilitasyonu ve önlenmesi için talimatları tanımlar ve doktorun belirli bir durumda tedavi taktiklerinin seçimi konusunda karar vermesine yardımcı olur.

Örneğin, ARVI ve grip sorunu konusunda çocuklara tıbbi bakım sağlama konularında, geliştiriciler grubu yaklaşık 40 kişiden oluşuyor ve çeşitli kurumlardan ve çeşitli bölümlerden bulaşıcı hastalıklar alanında önde gelen Rus uzmanlarını içeriyor. Uzmanların, hastalıklarla mümkün olduğunca çabuk baş edebilen ve aynı zamanda minimum yan etkiye sahip ilaçlara özel önem vermesi mantıklıdır. Şimdi yetişkinlerde ve çocuklarda ARVI ile savaşmaya yardımcı olan interferon içeren ilaçlardan bahsediyoruz.

Yukarıda bahsedildiği gibi, virüslerle savaşma yetenekleri, bilim adamları Isaacs ve Lindenmann tarafından yapılan müdahale çalışmasıyla keşfedildi. İnterferonu “canlı veya inaktive virüslerle enfeksiyondan sonra vücuttaki hücreler tarafından üretilen immünoglobulinlerden önemli ölçüde daha küçük bir protein; hücreler için toksik olmayan dozlarda çeşitli virüslerin büyümesini baskılayabilir." Günümüzde bu proteinlerin, etiyolojisine (virüsler, mantarlar, bakteriler, hücre içi patojenler, onkogenler) bakılmaksızın yabancı bilgilerin girişine yanıt olarak vücudun hemen hemen tüm hücreleri tarafından üretilebildiği bilinmektedir. Ve asıl biyolojik etkileri, bu yabancı bilgilerin tanınması ve kaldırılması süreçlerinde yatmaktadır. Başka bir deyişle, bu koruyucu moleküller, hücrelere zarar vermeden hücreleri işgal eden virüsleri nazikçe ve doğru bir şekilde yok edebilir. Bu, sayısız bilimsel çalışma ile doğrulanmıştır.

İnterferon içeren ilaçları kullanma yöntemlerine gelince, burada bazı nüanslardan bahsetmek gerekiyor. İnterferon tedavisinin ana sorunlarından biri, ilacın etkili dozunu olumsuz sonuçlara neden olmadan "vermektir". Bazı durumlarda, interferon içeren ilaçların intramüsküler veya intravenöz uygulanması, ateş, titreme, baş ağrısı ve diğer istenmeyen fenomenler şeklinde yan etkilere yol açar. Bu semptomlar vücut için kritik değildir ve kısa sürede kaybolur, ancak tedavi sırasında rahatsızlığa neden olurlar.

İnterferon alfa-2b içeren fitillerin kullanılması, interferon tedavisinin yan etkilerini en aza indirmeyi veya onlarsız yapmayı mümkün kılmıştır. Bilimsel araştırmalara göre ARVI hastalığının ilk günlerinde rekombinant insan interferonunun rektal yoldan verilmesi ateşin süresini azaltır, soğuk algınlığı ile savaşır ve hastalığı hızla yenmenizi sağlar. İnterferon alfa-2b içeren ilaçların (ilaç burun mukozasına uygulandığında) intranazal olarak verilmesi tedaviyi tamamlar ve tedavinin optimal etkisini sağlar. Hastalığın herhangi bir aşamasında grip ve diğer akut solunum yolu viral enfeksiyonları ile mücadeleye uygun ilaçlardan biri VIFERON'dur. Fitiller (fitiller), jel ve merhem şeklinde gelir.

İnterferon alfa-2b içeren ilaçların kullanımı ve toleransı için kısa talimatlar

VIFERON ilaçlarını kimler alabilir:

yetişkinler;
yaşamın ilk günlerinden itibaren çocuklar;
gebeliğin 4. haftasından itibaren hamile kadınlar.

Bilimsel topluluk tarafından tanınma

İnterferon alfa-2b (VIFERON), influenza ve ARVI tedavisi için önerilen bir ilaç olarak üç federal tıbbi bakım standardına ve ayrıca bu hastalıkların tedavisine yönelik üç Federal Protokole dahil edilmiştir. 1 Sadece grip ve akut solunum yolu viral enfeksiyonlarını değil, diğer hastalıkları da hesaba katarsak, bu ilaca ilişkin standartların ve önerilerin sayısı daha da fazladır - interferon (VIFERON), tıbbi bakımın sağlanması için 30 federal standarda dahil edilmiştir. Rusya Federasyonu Sağlık Bakanlığı tarafından onaylanan yetişkinler ve çocuklar için ve ayrıca hamile kadınlar ve çocuklar da dahil olmak üzere yetişkinlere tıbbi bakım sağlanmasına ilişkin 21 Protokolünde (Klinik Kılavuzlar) onaylanmıştır.

İlacın prensibi

VIFERON preparasyonunun bir parçası olan insan rekombinant interferon alfa-2b, antiviral, immünomodülatör özelliklere sahiptir ve RNA ve DNA içeren virüslerin replikasyonunu inhibe eder. Grip için antiviral tedavi, hastalığın herhangi bir aşamasında başlatılabilir. Bu, durumu iyileştirmeye ve komplikasyonların gelişmesini önlemeye yardımcı olacaktır. VIFERON preparasyonu, genel olarak tanınan oldukça aktif antioksidanlar içerir: mumlarda E ve C vitaminleri, merhemde - E vitamini, jelde - E vitamini, sitrik ve benzoik asitlerdir. Bu tür antioksidan desteğin arka planına karşı, interferonların antiviral aktivitesinde bir artış kaydedilmiştir.

Uyuşturucu testi sonuçları

VIFERON, Rusya'nın önde gelen kliniklerinde çok çeşitli hastalıklar için tam bir klinik deney döngüsünden geçmiştir. Araştırmanın sonucu, VIFERON'un yeni doğanlar ve hamile kadınlar da dahil olmak üzere yetişkinlerde ve çocuklarda çeşitli bulaşıcı ve enflamatuar hastalıklarda terapötik ve profilaktik etkinliğinin kanıtıydı. Karmaşık bileşim ve salıverme biçiminin, VIFERON'a, rekombinant interferonların 3 parenteral preparatlarında bulunan yan etkilerin yokluğunda uzun süreli interferon etkisi ile benzersiz farmakokinetik özellikler sağladığı bilimsel olarak kanıtlanmıştır.

İnterferon bazlı ilaçlar hangi hastalıklar için kullanılır?alfa-2 B

Fitiller, jel ve merhem şeklinde VIFERON ilacı, aşağıdaki hastalıkları tedavi etmek için kullanılır:

grip dahil SARS;
uçuk;
papilloma virüsü enfeksiyonu;
enterovirüs enfeksiyonu;
laringotrakeobronşit;
karaciğer sirozu ile komplike olanlar dahil kronik hepatit B, C, D;
bakteriyel vajinoz;
kandidiyaz;
mikoplazmoz;
üreaplazmoz;
gardnerelloz.

VIFERON ilacının karmaşık bir antiviral tedavinin parçası olarak kullanılması, antibakteriyel ve hormonal ilaçların terapötik dozlarını azaltabilir ve ayrıca bu tedavinin toksik etkilerini azaltabilir.

Genel Doktor

http://www.rosminzdrav.ru, Rusya Federasyonu Sağlık Bakanlığı'nın Emri, http://www.raspm.ru; http://www.niidi.ru; http://www.pediatr-russia.ru; http://www.nnoi.ru
I. V. Nesterova "Klinik uygulamada interferon preparatları: ne zaman ve nasıl", "Katılan hekim", Eylül 2017.
"VIFERON, perinatolojide enfeksiyöz ve inflamatuar hastalıkların tedavisi için karmaşık bir antiviral ve immünomodülatör ilaçtır." (Doktorlar için bir rehber), Moskova, 2014.

Kullanılan kaynaklar: http://www.lsgeotar.ru