Virologický výskum na klinike infekčných chorôb získavajú všetci väčší význam, čo je primárne spôsobené zvýšením podielu vírusových infekcií, ktorých klinika nie je vždy typická. Zároveň neboli vyvinuté rýchle a spoľahlivé metódy virologickej diagnostiky pre všetky infekčné choroby, mnohé z nich sú prácne a vyžadujú si špeciálne podmienky, experimentálne zvieratá, kultivačné médiá a vyškolený personál. Momentálne na diagnostiku vírusové infekcie využiť 3 hlavné typy výskumu.
1. Mikroskopické vyšetrenie infekčného materiálu na detekciu vírusového antigénu alebo patognomonických zmien v tkanivách. Na diagnostické účely priamo mikroskopické vyšetrenie infekčný materiál od pacientov sa používa s obmedzeným počtom vírusových infekcií (besnota, ovčie kiahne, žltá zimnica, opar atď.). Metóda založená na detekcii vírusového antigénu pomocou fluorescenčných protilátok získala širšie uplatnenie. Imunofluorescenčná metóda môže byť spoľahlivá, iba ak sú prísne splnené všetky technické požiadavky.
2. Virologické metódy.
3. Sérologické štúdie na stanovenie zvýšenia titra protilátok v dynamike ochorenia. Sérologické metódy výskumu sú dostupnejšie v laboratóriu.
Pre tieto štúdie je potrebné odobrať krvné sérum počas akútneho obdobia ochorenia a počas obdobia rekonvalescencie (párové séra). Vzorky krvi pre sérologický výskum sa berú sterilne bez antikoagulancií a konzervačných látok.
Hlavnými etapami virologického výskumu sú izolácia vírusov, ich identifikácia, charakterizácia hlavných biologických vlastností. V súčasnosti neexistuje jediná metodika na izolovanie rôznych skupín vírusov. Je to primárne kvôli rozmanitosti ich vlastností a vlastnostiam kultivácie mimo organizmu hostiteľa. Na štúdiu sa používajú biosubstráty (výplachy zo slizníc, krvi a jej zložiek, mozgovomiechového moku, moču a výkalov, biopsie orgánov a tkanív alebo ich častí odobraté pri pitve), ktoré sa podrobia špeciálnemu spracovaniu a potom nasleduje pasážovanie materiálu. Materiál použitý na výskum by sa mal skladovať pri teplotách od -20 ° C do -70 ° C. V závislosti na predbežnej diagnóze má spracovanie materiálu svoje vlastné vlastnosti, ale vo všetkých prípadoch sa predpokladá získanie substrátu, ktorý je maximálne vyčistený od nečistôt hlienu, buniek orgánov a tkanív alebo ich fragmentov, baktérií. To sa dosiahne homogenizáciou študovaného materiálu na špeciálnom prístroji alebo mletím v porcelánovej malte za studena pomocou kremenného skla (kúsky orgánov a tkanív) s prídavkom sterilne ochladeného (+4 C) 0,9 %
roztokom chloridu sodného, \u200b\u200baby sa získala 10 - 30% suspenzia a následná centrifugácia pri 1500 - 3000 ot./min. počas 10 - 15 minút. Takto získaný supernatant sa použije na ďalší výskum.
Predtým intenzívny rozvoj a bolo použité zavedenie metódy tkanivovej a bunkovej kultúry, infekcie pokusných zvierat alebo kuracích embryí do rozšírenej praxe. Tieto metódy sa stále používajú. Detekcia vírusov pomocou zvierat je najvýhodnejšia v tých prípadoch, keď je možné v experimente reprodukovať typický obraz. infekčná choroba alebo niektore z jeho prejavov. Takže pôvodcovia skupiny arbovírusu a Coxsackie môžu byť detekovaní počas infekcie v mozgu kojených myší, chrípky - počas infekcie kuracích embryí alebo intranazálneho podávania testovaného materiálu myšiam. Vo virologických laboratóriách sa v posledných rokoch najviac používa metóda bunkovej a tkanivovej kultúry, ktorá umožňuje izolovať adenovírusy, herpes vírusy, respiračný syncyciálny vírus, myxovírusy a ďalšie a etiologickú diagnostiku ochorenia vykonávať už v prvých fázach výskumu. Dôvodom sú dobre preskúmané cytologické znaky interakcie väčšiny vírusov a buniek. Infekcia buniek HeLa, Hep-2 materiálom obsahujúcim adenovírus typu 2 už 3. deň teda vedie k zmene rastového vzoru bunkovej monovrstvy a k vzhľadu typických buniek vo forme strapcov hrozna atď., Dobre definovaných v obvyklých svetelný mikroskop pri malom zväčšení.
Pre etiologickú diagnostiku infekčného ochorenia má mimoriadny význam štandardizácia izolácie vírusu z testovaného materiálu, ktorá v tejto fáze práce zahŕňa použitie geneticky čistých lineárnych zvierat, berúc do úvahy ich fenotypové (predovšetkým vekové) vlastnosti. Je to primárne kvôli skutočnosti, že experimentálne zvieratá rôznych genetických línií a veku v v rôznej miere náchylné na vírusy. Počas intracerebrálnej infekcie myší neurotropným kmeňom WSN vírusu chrípky u BALB / c, A, CBA a odchovaných zvierat sa teda ukázala najvyššia citlivosť; rovnaký vzor bol stanovený v prípade intranazálneho podania testovaného materiálu. Nevyhnutné pre konečné výsledky práca na izolácii vírusu má predbežné vyšetrenie zvierat, kuracích embryí, bunkových a tkanivových kultúr na prítomnosť latentných vírusových nosičov. Kuracie embryá, ktoré sa často používajú v laboratórnej praxi, môžu byť infikované vírusmi vtáčej leukémie, vtáčej encefalomyelitídy, infekčnej sínusitídy, psitakózy, pseudomoru hydiny, patogénov určitých bakteriálnych infekcií (paratyfidová horúčka atď.), Ako aj mykoplazmy. Viac viac bakteriálne a najmä vírusové látky sú schopné spontánne infikovať kultúru buniek a tkanív a prežívať v nich. Ich prítomnosť významne ovplyvňuje hodnotenie študovaného materiálu. Niektoré typy mykoplaziem v bunkovej kultúre
môže spôsobiť hemaglutináciu a hemadsorpciu a dokonca vytvárať pod agarovým povlakom plaky podobné tým, ktoré vytvárajú vírusy. Kontaminácia bunkových kultúr jedného typu ostatnými má tiež veľký význam, najčastejšie sa spája s bunkami HeLa a pozoruje sa pri práci s rôznymi typmi kultúr v jednej miestnosti, pri zlom spracovaní laboratórneho skla atď. Prítomnosť kontaminácie bunkových kultúr alebo infekcie zvierat bakteriálnymi látkami, ako napr. spravidla sa prejavuje celkom zreteľne (zmena povahy rastu monovrstvy buniek, vlastnosti kultivačného média, smrť kuracích embryí alebo zvierat s určitými príznakmi atď.) a pri hodnotení výsledkov nepredstavuje nijaké zvláštne ťažkosti. Problematika je komplikovanejšia pri latentných formách infekcie, pri ktorých sa vyžaduje použitie sérologických a iných metód. Tieto pokyny by sa mali brať do úvahy pri práci virológa, najmä pri vykonávaní etiologickej diagnostiky nejasných prípadov ochorenia.
Virologické výskumné metódy
metódy štúdia biológie vírusov a ich identifikácie. Vo virológii sú široko používané metódy molekulárnej biológie, pomocou ktorých bolo možné zistiť molekulárnu štruktúru vírusových častíc, spôsoby ich prieniku do bunky a vlastnosti reprodukcie vírusov, primárnu štruktúru vírusových nukleových kyselín a proteínov. Vyvíjajú sa metódy na stanovenie sekvencie základných prvkov vírusových nukleových kyselín a bielkovinových aminokyselín. Je možné spojiť funkcie nukleových kyselín a proteínov nimi kódovaných s nukleotidovou sekvenciou a zistiť príčiny intracelulárnych procesov, ktoré hrajú dôležitú úlohu v patogenéze vírusovej infekcie.
Virologické výskumné metódy sú tiež založené na imunologických procesoch (interakcia antigénu s protilátkami), biologických vlastnostiach vírusu (schopnosť hemaglutinácie, hemolýza, enzymatická aktivita), zvláštnostiach interakcie vírusu s hostiteľskou bunkou (povaha cytopatického účinku, tvorba intracelulárnych inklúzií atď.) ...
Pri diagnostike vírusových infekcií, kultivácii, izolácii a identifikácii vírusov, ako aj pri príprave vakcínových prípravkov sa široko používa metóda tkanivovej a bunkovej kultúry. Používajú sa primárne, sekundárne, stabilné transplantovateľné a diploidné bunkové kultúry. Primárne kultúry sa získavajú dispergovaním tkaniva proteolytickými enzýmami (trypsín, kolagenáza). Zdrojom buniek môžu byť tkanivá a orgány (zvyčajne obličky) ľudských a zvieracích embryí. Suspenzia buniek v živnom médiu sa umiestni do takzvaných matracov, fliaš alebo Petriho misiek, kde sa bunky po pripevnení k povrchu cievy začnú množiť. Na infekciu vírusmi sa zvyčajne používa bunková monovrstva. Živná tekutina sa zlikviduje, pridá sa vírusová suspenzia v určitých zriedeniach a po kontakte s bunkami sa pridá čerstvé živné médium, zvyčajne bez séra.
Bunky väčšiny primárnych kultúr možno subkultivovať, táto kultúra sa nazýva sekundárna. S ďalším prechodom buniek sa vytvára populácia buniek podobných fibroblastom, schopná rýchlej reprodukcie, väčšina z ktorý zachováva pôvodnú sadu chromozómov. Jedná sa o takzvané diploidné bunky. Pri sériovej kultivácii buniek sa získajú stabilné kontinuálne bunkové kultúry. Počas pasáží sa objavujú rýchlo sa deliace homogénne bunky s heteroploidnou sadou chromozómov. Stabilné bunkové línie môžu byť jednovrstvové alebo suspenzné. Jednovrstvové kultúry rastú ako súvislá vrstva na povrchu skla, suspenzné kultúry rastú ako suspenzie v rôznych nádobách pomocou miešacích zariadení. Existuje viac ako 400 bunkových línií odvodených od 40 odlišné typy zvieratá (vrátane primátov, vtákov, plazov, obojživelníkov, rýb, hmyzu) a ľudí.
V umelom živnom médiu môžete kultivovať kúsky jednotlivých orgánov a tkanív (orgánová kultúra). Tieto typy kultúr zachovávajú tkanivovú štruktúru, čo je zvlášť dôležité pre izoláciu a pasážovanie vírusov, ktoré sa nerozmnožujú v nediferencovaných tkanivových kultúrach (napríklad koronavírusy).
V infikovaných bunkových kultúrach môžu byť vírusy detekované zmenou morfológie buniek, cytopatickým účinkom, ktorý môže byť špecifický, výskytom inklúzií, stanovením vírusových antigénov v bunke a v kultivačnej tekutine; stanovenie biologických vlastností vírusového potomstva v kultivačnej tekutine a titrácia vírusov v tkanivovej kultúre, kuracích embryách alebo u citlivých zvierat; detekciou jednotlivých vírusových nukleových kyselín v bunkách molekulárnou hybridizáciou alebo klastrami nukleových kyselín cytochemickou metódou pomocou fluorescenčnej mikroskopie.
Izolácia vírusov je namáhavý a časovo náročný proces. Vykonáva sa za účelom stanovenia typu alebo variantu vírusu cirkulujúceho v populácii (napríklad na identifikáciu sérovariantu chrípkového vírusu, divého alebo vakcinačného kmeňa vírusu poliomyelitídy atď.); v prípadoch, keď je to nevyhnutné pre urgentné epidemiologické opatrenia; keď sa objavia nové typy alebo varianty vírusov; v prípade potreby potvrdenie o predbežnej diagnóze; na indikáciu vírusov v objektoch prostredie... Pri izolácii vírusov berte do úvahy možnosť ich perzistencie v ľudskom tele, ako aj výskyt zmiešanej infekcie spôsobenej dvoma alebo viacerými vírusmi. Geneticky homogénna populácia vírusu získaného z jedného viriónu sa nazýva vírusový klon a proces jeho získavania sa nazýva klonovanie.
Na izoláciu vírusov, infekciu vnímavých laboratórnych zvierat sa používajú kuracie embryá, najčastejšie sa však používa tkanivová kultúra. Prítomnosť vírusu je zvyčajne určená špecifickou degeneráciou buniek (cytopatický účinok), tvorbou symplastov a syncytií, detekciou intracelulárnych inklúzií, ako aj špecifickým antigénom detekovaným pomocou metód imunofluorescencie, hemadsorpcie, hemaglutinácie (u hemaglutinačných vírusov) atď. Tieto príznaky je možné zistiť až po 2 - 3 pasážach vírusu.
Kuracie embryá sa používajú na izoláciu mnohých vírusov, napríklad chrípkových vírusov, na izoláciu niektorých vírusov Coxsackie a mnohých arbovírusov - novorodených myší. Identifikácia izolovaných vírusov sa vykonáva pomocou sérologických reakcií a iných metód.
Pri práci s vírusmi sa určuje ich titer. Titrácia vírusu sa zvyčajne uskutočňuje v tkanivovej kultúre, pri ktorej sa určuje najvyššie zriedenie zaočkovanej tekutiny, pri ktorej dôjde k degenerácii tkaniva, vytvoreniu inklúzií a vírusovo špecifických antigénov. Metódu plakov je možné použiť na titráciu množstva vírusov. Plaky alebo negatívne vírusové kolónie sú ložiskami buniek zničených vírusom v agarom potiahnutej jednovrstvovej tkanivovej kultúre. Počty kolónií umožňujú kvantitatívna analýza infekčná aktivita vírusov na základe toho, že jedna infekčná častica vírusu vytvorí jeden plak. Plaky sa detegujú farbením kultúry vitálnymi farbivami, zvyčajne neutrálnymi červenými; plaky neabsorbujú farbivo a sú preto viditeľné ako svetlé škvrny na pozadí zafarbených živých buniek. Titer vírusu je vyjadrený počtom jednotiek tvoriacich plaky v 1 ml.
Purifikácia a koncentrácia vírusov sa zvyčajne uskutočňuje diferenciálnou ultracentrifugáciou, po ktorej nasleduje centrifugácia s koncentráciou alebo gradientom hustoty. Na čistenie vírusov sa používajú imunologické metódy, iónomeničová chromatografia, imunosorbenty atď.
Laboratórna diagnostika vírusových infekcií zahŕňa detekciu patogénu alebo jeho zložiek v klinickom materiáli; izolácia vírusu z tohto materiálu; sérodiagnostika. Výber laboratórnej diagnostickej metódy v každom jednotlivom prípade závisí od povahy choroby, obdobia choroby a možností laboratória. Moderná diagnostika vírusové infekcie je založený na expresných metódach, ktoré vám umožnia získať odpoveď niekoľko hodín po prijatí klinického materiálu do skoré termíny po chorobe, Patrí sem elektrónová a imunitná elektrónová mikroskopia, ako aj imunofluorescencia, molekulárna hybridizácia, detekcia protilátok IgM atď.
Elektrónová mikroskopia vírusov zafarbených negatívnym kontrastom umožňuje odlíšiť vírusy a určiť ich koncentráciu. Použitie elektrónovej mikroskopie pri diagnostike vírusových infekcií sa obmedzuje na tie prípady, keď je koncentrácia vírusových častíc v klinickom materiáli dostatočne vysoká (105 v 1 mla vyššie). Nevýhodou tejto metódy je nemožnosť rozlíšiť vírusy patriace do rovnakej taxonomickej skupiny. Táto nevýhoda je eliminovaná použitím imunitnej elektrónovej mikroskopie. Metóda je založená na tvorbe imunitných komplexov, keď sa k vírusovým časticiam pridá špecifické sérum, pričom dochádza k súčasnej koncentrácii vírusových častíc, čo umožňuje ich identifikáciu. Metóda sa tiež používa na detekciu protilátok. Na účely expresnej diagnostiky sa vykonáva elektrónové mikroskopické vyšetrenie tkanivových extraktov, výkalov, tekutiny z vezikúl, sekrécie z nosohltanu. Na štúdium morfogenézy vírusu sa široko používa elektrónová mikroskopia; jeho možnosti sa rozširujú použitím značených protilátok.
Metóda molekulárnej hybridizácie založená na detekcii vírusovo špecifických nukleových kyselín umožňuje detekovať jednotlivé kópie génov a nemá rovnakú úroveň citlivosti. Reakcia je založená na hybridizácii komplementárnych reťazcov DNA alebo RNA (sondy) a tvorbe dvojvláknových štruktúr. Najlacnejšou sondou je klonovaná rekombinantná DNA. Sonda je označená rádioaktívnymi prekurzormi (zvyčajne rádioaktívnym fosforom). Použitie kolorimetrických reakcií je sľubné. Existuje niekoľko možností pre molekulárnu hybridizáciu: bodová, blotová hybridizácia, sendvičová hybridizácia, hybridizácia in situ atď.
Protilátky triedy lgM sa objavia skôr ako protilátky triedy G (3. - 5. deň choroby) a zmiznú po niekoľkých týždňoch, takže ich detekcia naznačuje novo prenesenú infekciu. IgM protilátky sa detegujú imunofluorescenciou alebo enzýmovo viazaným imunosorbentným testom pomocou anti-μ-antiséra (séra ťažkého reťazca anti-IgM).
Sérologické metódy vo virológii sú založené na klasických imunologických reakciách (pozri Metódy imunologického výskumu) : reakcie väzby komplementu, inhibícia hemaglutinácie, biologická neutralizácia, imunodifúzia, nepriama hemaglutinácia, radiálna hemolýza, imunofluorescencia, enzýmová imunotest, rádioimunotest. Boli vyvinuté mikrometódy pre mnoho reakcií a ich technika sa neustále zdokonaľuje. Tieto metódy sa používajú na identifikáciu vírusov pomocou sady známych sér a na sérodiagnostiku s cieľom zistiť nárast protilátok v druhom sére v porovnaní s prvým (prvé sérum sa odoberá v prvých dňoch po chorobe, druhé - po 2 - 3 týždňoch). Diagnostická hodnota má najmenej štvornásobné zvýšenie protilátok v druhom sére. Ak detekcia protilátok triedy IgM naznačuje nedávnu infekciu, potom protilátky IgC pretrvávajú niekoľko rokov a niekedy aj celý život.
Na identifikáciu jednotlivých antigénov vírusov a protilátok proti nim v komplexných zmesiach bez predbežnej purifikácie proteínov sa používa imunoblotovanie. Metóda kombinuje frakcionáciu proteínov pomocou polyakrylamidovej gélovej elektroforézy s následnou imunoindikáciou proteínov pomocou enzýmovej imunotesty. Separácia proteínov znižuje požiadavky na chemickú čistotu antigénu a umožňuje detekciu jednotlivých párov antigén-protilátka. Táto úloha je relevantná napríklad pri sérodiagnostike infekcie HIV, kde sú falošné pozitívne reakcie enzýmovej imunotesty spôsobené prítomnosťou protilátok proti bunkovým antigénom, ktoré sú prítomné v dôsledku nedostatočnej purifikácie vírusových proteínov. Identifikácia protilátok v sérach pacientov proti vnútorným a vonkajším vírusovým antigénom umožňuje určiť štádium ochorenia a pri analýze populácií aj variabilitu vírusových proteínov. Imunoblotovanie pri infekcii HIV sa používa ako potvrdzujúci test na detekciu jednotlivých vírusových antigénov a protilátok proti nim. Pri analýze populácií sa metóda používa na stanovenie variability vírusových proteínov. Veľká hodnota metódy spočíva v možnosti analýzy antigénov syntetizovaných pomocou technológie rekombinantnej DNA, stanovenia ich veľkosti a prítomnosti antigénnych determinantov.
Virologický výskum je výskum zameraný na izoláciu vírusov a štúdium ich vlastností, ako aj na stanovenie etiologického vzťahu vírusov s určitými chorobami.
Materiál na výskum sa odoberá v závislosti od miesta prevládajúcich vírusov v tele pacienta a od spôsobov ich uvoľňovania do vonkajšieho prostredia. Materiál sa zhromaždí v sterilnej miske, čo najrýchlejšie sa dopraví do laboratória a až do štúdie sa uchováva zmrazený alebo na ľade. Pred použitím sa vírusový izolačný materiál (a) spracuje na potlačenie cudzej mikroflóry a exponuje sa na odstránenie veľkých častíc.
Izolácia vírusu sa vykonáva infikovaním laboratórnych zvierat, kuracích embryí a tkanivových kultúr vakcinovaným materiálom. Výber metódy izolácie závisí od údajného pôvodcu choroby. Takže tkanivové kultúry (pozri) sa používajú pri práci s vírusmi, ktoré nie sú patogénne pre laboratórne zvieratá, alebo keď sa v tkanivovej kultúre detegujú skôr, ako keď sú zvieratá infikované. Kuracie embryá sú infikované tak, aby izolovali patogény, infekčné príušnice (v plodovej a alantoidnej dutine), (v žĺtkovom vaku), kiahne (na chorionallantoidnej membráne).
Z laboratórnych zvierat na izoláciu vírusov sa najčastejšie používajú biele myši, potom králiky, potkany, morčatá, opice. Pre arbovírusy je najúčinnejšie zavedenie očkovaného materiálu do hlavy alebo pri pneumotropných vírusoch do sliznice. dýchacích ciest, na vírusy kiahní, na skarifikovanú rohovku.
Izolácia vírusov je najúčinnejšia v akútnom období ochorenia. Podstatným bodom pri zisťovaní vírusovej povahy choroby sú výsledky sérologických štúdií séra odobraného opakovane tomu istému pacientovi na začiatku ochorenia a v období rekonvalescencie. Detekcia protilátok proti izolovaným vírusom v druhom sére v titri 4 alebo viackrát vyššom ako v prvom sére naznačuje etiologický vzťah vírusov k tejto chorobe.
Skoré a rýchla metóda detekcia vírusových antigénov je metóda fluorescenčných protilátok založená na špecifickej fixácii fluorochrómom označených protilátok na povrchu antigénu. Antigén je ľahko detekovaný fluorescenčnou mikroskopiou (pozri) vďaka jasnej fluorescencii protilátok adsorbovaných na antigéne. Metóda fluorescenčných protilátok skúma nátery odobraté pacientom, histologické rezy postihnutých tkanív, preparáty tkanivových kultúr. Na detekciu elementárnych telies (viriónov) sa tiež používajú (pozri). Z ďalších morfologických metód sa používajú metódy, ktoré odhaľujú intracelulárne vírusové inklúzie v častiach postihnutých orgánov a tkanív. Detekcia inklúzií naznačuje infekciu a v niektorých prípadoch prispieva k diagnostike vírusového ochorenia. Rôzne sa používajú na detekciu vírusových protilátok v krvi pacientov a na štúdium antigénnej štruktúry vírusov. Neutralizačná reakcia sa používa takmer pri všetkých vírusových infekciách. Je založená na schopnosti imunitných protilátok neutralizovať infekčné vlastnosti vírusov po zavedení zmesi do tela vnímavých zvierat alebo do tkanivovej kultúry. Na stanovenie neutralizačného indexu sa konštantná dávka séra zmieša s rôznymi riedeniami vírusov a na stanovenie titra protilátok sa použijú rôzne riedenia séra s konštantnou dávkou vírusov. Kontrolou je infekcia zvierat (alebo tkanivovej kultúry) zmesou vírusov s normálnym sérom alebo s soľný roztok... Neutralizačná reakcia sa vykonáva nielen na detekciu protilátok, ale aj na určenie typu a typu vírusov.
Test väzby komplementu [napríklad Bordet-Zhanguova reakcia (pozri)] sa používa na detekciu vírusových antigénov aj protilátok. V prvom prípade známe imunitné sérum a materiál, v ktorom sa predpokladá prítomnosť interakcie antigénov s reakciou: krvné sérum, výplachy nosohltanu, tkanivové extrakty infikovaného organizmu. V druhom prípade známy antigén (diagnostické) a sérum pacienta alebo rekonvalescenta.
RSC sa používa na diagnostiku chorôb spôsobených chrípkovými vírusmi, kiahňami, adenovírusmi a arbovírusmi.
IN laboratórna diagnostika vírusové infekcie existujú tri hlavné prístupy
1) priame vyšetrenie materiálu na prítomnosť vírusového antigénu alebo nukleových kyselín;
2) izolácia a identifikácia vírusu z klinického materiálu;
Priame metódy diagnostiky klinického materiálu
Priame metódy sú metódy, ktoré umožňujú detekciu vírusu, vírusového antigénu alebo vírusovej nukleovej kyseliny (NK) priamo v klinickom materiáli, to znamená, že sú najrýchlejšie (2 - 24 hodín).
Elektrónová mikroskopia (EM). Pomocou tejto metódy môžete zistiť skutočný vírus.
imunitná elektrónová mikroskopia (IEM), ktorá využíva špecifické protilátky proti vírusom. Výsledkom interakcie protilátok s vírusmi sú komplexy, ktoré sa po negatívnom kontraste ľahšie detegujú.
Imunofluorescenčná reakcia (RIF). Metóda je založená na použití protilátok viazaných na farbivo
Metóda RIF sa široko používa na rýchle dešifrovanie etiológie akútnych respiračných vírusových infekcií pri analýze odtlačkov zo sliznice horných dýchacích ciest.
Enzýmovo viazaný imunosorbentný test (ELISA). Imunologické metódy na stanovenie vírusových antigénov sú v zásade podobné ako RIF, ale sú založené skôr na značení protilátok enzýmami ako farbivami.
Rádioimunotest (RIA). Metóda je založená na značení protilátok rádioizotopmi, ktoré zabezpečili vysokú citlivosť pri stanovení vírusového antigénu.
Molekulárne metódy. Spočiatku sa klasická metóda detekcie vírusového genómu považovala za vysoko špecifickú metódu hybridizácie NK, v dnešnej dobe sa však izolácia vírusových genómov pomocou polymerázy reťazová reakcia (PCR).
Molekulárna hybridizácia nukleových kyselín. Metóda je založená na hybridizácii komplementárnych reťazcov DNA alebo RNA s tvorbou dvojvláknových štruktúr a na ich identifikácii.
PCR je založená na princípe prirodzenej replikácie DNA. Podstata metódy spočíva v opakovanom opakovaní cyklov syntézy (amplifikácie) sekvencie DNA špecifickej pre vírus pomocou termostabilnej Taq DNA polymerázy a dvoch špecifických primérov - takzvaných primérov.
Cytologické metódy majú v súčasnosti obmedzenú diagnostickú hodnotu, mali by sa však stále používať pri mnohých infekciách. Skúmajú sa materiály z pitvy, biopsie, sterov, ktoré sa po vhodnom spracovaní zafarbia a analyzujú pod mikroskopom.
Pre úspešnú izoláciu vírusu klinický materiál by sa mali brať v súlade s patogenézou údajnej choroby a v najskoršom možnom termíne.
Spravidla sa berie:
- na infekcie dýchacích ciest - výplach nosohltanu;
- na enterovírusové infekcie - vymývanie a výkaly (reo-, enterovírusy);
- s léziami kože a slizníc - škrabaním, obsahom vezikúl (herpes, ovčie kiahne);
- s exantemickými infekciami - výplachy (osýpky, rubeola);
- na arbovírusové infekcie - krv, mozgovomiechový mok.
Na izoláciu vírusov sa používajú bunkové kultúry, laboratórne zvieratá, kuracie embryá. Proces je zdĺhavý a niekedy vyžaduje niekoľko pasáží, kým sa vírus zistí a identifikuje pomocou jednej alebo niekoľkých metód - pri neutralizačnej reakcii (RN), RIF, ELISA alebo PCR.
Sérodiagnostika
Sérologická diagnostika založená na reakcii antigén-protilátka sa môže použiť na stanovenie týchto aj iných faktorov a zohráva úlohu pri určovaní etiológie vírusovej infekcie aj pri negatívne výsledky izolácia vírusu.
CSC je jedným z tradičných sérologických testov a používa sa na diagnostiku mnohých vírusových infekcií. Na reakcii sa podieľajú dva systémy: protilátky séra pacienta + štandardný vírus a baranové erytrocyty + protilátky proti nim, ako aj titrovaný doplnok. Ak sa protilátky a vírus zhodujú, tento komplex viaže komplement a nedochádza k lýze ovčích erytrocytov (pozitívna reakcia). Pri negatívnom CSC komplement podporuje lýzu erytrocytov. Nevýhodou metódy je jej nedostatočne vysoká citlivosť a náročnosť štandardizácie reagencií. Na stanovenie protilátok v sére sa používa metóda IF, podobne ako ELISA.
Výskum diagnostiky chorôb vírusovej povahy. Je to nevyhnutné na identifikáciu vírusu, štúdium jeho biológie a schopnosť ovplyvňovať bunky zvierat a ľudí. Je teda možné pochopiť patogenézu vírusové ochorenia a podľa toho zvoliť správnu metódu liečby.
Aká je diagnóza?
V živých bunkách. Na jeho preskúmanie je potrebné kultivovať na úrovni experimentálneho organizmu alebo Na tento účel sa v lekárskej praxi a mikrobiológii všeobecne uskutočňujú virologické výskumné metódy, ktoré majú tieto hlavné prístupy:
- rovný;
- nepriamy;
- sérologický.
Materiál je možné priamo vyšetriť na prítomnosť nukleových kyselín, vírusového antigénu alebo napríklad možno vírus izolovať a identifikovať z klinického materiálu.
Okrem schopnosti zistiť etiológiu ochorenia a monitorovania terapeutického účinku majú v protiepidemických opatreniach dôležitú úlohu virologické výskumné metódy. Na izoláciu a použitie sa používajú kuracie embryá, laboratórne zvieratá alebo bunkové kultúry.
Ako sa to vyšetruje?
Najrýchlejšia je priama metóda. Umožňuje detekciu vírusu, antigénu alebo NK (nukleovej kyseliny) v samotnom klinickom materiáli. Trvá to čas od dvoch hodín do dňa.
- EM - elektrónová mikroskopia. Deteguje vírus priamo.
- IEM - imunitná elektrónová mikroskopia. Používa špecifické protilátky proti vírusom.
- RIF - reakcia imunofluorescencie. Používa protilátky viazané na farbivo. Takéto virologické výskumné metódy sa široko používajú ako rýchle dekódovanie etiológie ARVI (akútne respiračné vírusové infekcie), keď sa odoberajú nátery zo sliznice horných dýchacích ciest.
- ELISA - enzýmovo viazaný imunosorbent - stanovenie vírusových antigénov, podobné RIF, ale na základe značenia protilátok enzýmami.
- RIA - rádioimunotest. Používa rádioizotopové značenie protilátok na zabezpečenie vysokej citlivosti pri detekcii vírusového antigénu.
- Molekulárna - hybridizácia NK alebo izolácia vírusových genómov pomocou PCR (polymerázová reťazová reakcia).
- Cytológia sa používa zriedka, ale pri určitých infekciách sú tieto virologické výskumné metódy veľmi účinné. Biopsie, pitvy a škvrny sa vyšetrujú na farbenie a mikroskopickú analýzu.
Aký zmysel má výskum?
Pre úspešnú izoláciu vírusu sa klinický materiál odoberá v súlade s patogenézou a čo najskôr. Pred použitím určitých virologických výskumných metód tento proces často vyžaduje niekoľko krokov.
Mikrobiológia študuje mikroskopické tvory. A jej odborom nie je iba medicína. Je to základná veda pre poľnohospodárstvo, veterinárne lekárstvo, vesmírny a technický priemysel, geológia.
Ale samozrejme, všetko je stvorené pre človeka a jeho vývoj na tejto krásnej planéte. Preto je veľmi dôležité včas odhaliť nebezpečenstvo a neutralizovať ho. Vírusy sa líšia od baktérií. Jedná sa o štruktúry, ktoré vstupujú do tela a spôsobujú formovanie novej generácie. Vyzerajú ako kryštály a sú zamerané na riadenie procesu ich reprodukcie, hoci samy sa nekŕmia, nerastú a nevylučujú metabolické produkty.
Vírus je schopný spôsobiť vážne ochorenie v každom živom organizme, do ktorého spadol. Navyše sa môže vyvíjať. Preto sa musia vyvinúť a zdokonaliť virologické výskumné metódy v mikrobiológii, pretože môže byť ohrozená ľudská civilizácia ako celok.
Materiály
Na zisťovanie a identifikáciu vírusov v medicíne sa spravidla postupuje takto:
- výplach nosohltanu (infekcie dýchacích ciest);
- nával a výkaly ( enterovírusové infekcie);
- škrabanie, obsah vezikúl (lézie kože, slizníc, ako je herpes, ovčie kiahne);
- návaly (exantemické infekcie ako osýpky, rubeola);
- krv, mozgovomiechový mok (arbovírusové infekcie).
Fázy
Všetky stupne virologickej výskumnej metódy zahŕňajú:
- príjem materiálu;
- výber, prijatie testovacieho systému, stanovenie jeho životaschopnosti;
- infekcia testovacieho systému;
- indikácia vírusu;
- určenie typu vírusu.
Patogénne vírusy sa v zásade vyznačujú prítomnosťou tkanivovej a typovej špecificity. Vezmime si napríklad poliovírus, ktorý sa množí iba u primátov (v ich bunkách). V súlade s tým sa na izoláciu konkrétneho vírusu používa špecifická tkanivová kultúra. Pokiaľ hovoríme o neznámom patogéne, bolo by vhodné súčasne infikovať tri alebo lepšie štyri bunkové kultúry.
Možno teda bude jeden z nich citlivý. Na stanovenie prítomnosti vírusu v infikovaných kultúrach sa sleduje vývoj špecifickej degenerácie buniek, intracelulárnych inklúzií, detekcia špecifického antigénu, pozitívna hemaglutinácia a hemadsorpčné reakcie.
Ako najvhodnejšie pre konkrétny prípad údajnej infekcie by sa mali zvoliť všetky virologické výskumné metódy (priame a nepriame, sérologické).
Nepriame metódy sú založené na izolácii a identifikácii vírusu. Sú časovo náročné, časovo náročné, ale presné.
Sérodiagnostika
Takáto diagnóza znamená spôsob založený na reakcii antigén-protilátka. Najčastejšie sa používajú párové krvné séra odoberané v intervaloch niekoľkých týždňov. Ak je zvýšenie titra protilátok 4 alebo viackrát, reakcia sa považuje za pozitívnu. Na stanovenie typovej špecifickosti vírusu sa používa vírusová neutralizačná reakcia. Aby ste určili skupinovú špecifickosť, musíte získať väzbovú reakciu na komplement.
Široko používaný rôzne možnosti enzýmová imunotest, hemaglutinačná inhibičná reakcia, pasívna hemaglutinácia, reverzná pasívna hemaglutinácia, RIF. Dokonca aj v genetickom inžinierstve bola vyvinutá metóda výroby monoklonálnych protilátok. Úzku špecificitu monoklónov je možné prekonať použitím viacerých monoklonálnych protilátok proti rôznym vírusovým determinantom. Takto sa zvýšila špecificita a citlivosť štúdie s určením antigénov.
Niektoré funkcie
V súčasnosti bolo vyvinutých veľa rôznych testovacích systémov pre imunologickú diagnostiku infekcií spôsobených vstupom vírusu do živého organizmu.
Takže virologické výskumné metódy sú spôsoby izolácie vírusov, štúdia ich vlastností a stanovenia ich etiologického vzťahu s určitými chorobami.
