Imunoblotiranje (otkrivanje antitijela u serumu bolesnika na određene antigene patogena). Kako se AIDS dijagnosticira imunoblotingom na HIV III. Imunokemijsko bojenje proteina imobiliziranih na nitroceluloznoj membrani

Što je imunoblot? Ovo je uobičajena metoda laboratorijska dijagnostika virusne infekcije osoba. Smatra se jednim od najpreciznijih i najpouzdanijih načina otkrivanja prisutnosti HIV-a. Po svojoj pouzdanosti nadilazi čak i rezultate imunoblota koji se smatraju nepobitnim i konačnim.

opće informacije

Imunoblot - što je to? Da bi se prepoznala infekcija HIV-om kod osobe, potrebno je podvrgnuti laboratorijskom ispitivanju krvnog seruma na prisutnost protutijela. Tehnika imunoblotiranja također se naziva Western blot. Koristi se za otkrivanje virusnih infekcija ljudi kao dodatna ekspertna metoda. Potrebno je potvrditi ELISA - laboratorijski test koji vam omogućuje određivanje prisutnosti antitijela na HIV u krvi. Ponovno provjerite imunoblotingom pozitivan test ELISA. Smatra se najosjetljivijim, složenim i skupim.

Svrha

Što je imunoblot? Ovo je laboratorijska metoda za ispitivanje krvnog seruma na prisutnost antitijela na virus. Tijekom studije stručnjak najprije odvaja virusne proteine u gel i prenosi ih na nitroceluloznu membranu. Postupak imunoblotinga namijenjen je otkrivanju HIV-a na različite faze. U prvoj fazi, pročišćeni virus iz njegovih sastavnih dijelova podvrgava se elektroforezi, a antigeni uključeni u njegov sastav odvajaju se prema molekularnoj težini.

Razmnožava se u živoj stanici, ugrađujući u nju svoje genetske informacije. U ovoj fazi osoba postaje nositelj HIV virusa ako je bila zaražena. Specifičnost bolesti je u tome što se dugo vremena možda se uopće neće pokazati. Virus uništava limfocite, pa čovjekov imunitet opada i tijelo se više ne može oduprijeti infekcijama. Ako se HIV liječi ispravno i na vrijeme, pacijent će doživjeti duboku starost. Nedostatak terapije neizbježno dovodi do smrtni ishod. Od trenutka infekcije, ali bez liječenja, maksimalni životni vijek nije dulji od deset godina.

Osobitosti

Imunoblot analiza je pouzdana metoda koja vam omogućuje određivanje prisutnosti antitijela na HIV antigene prvog i drugog tipa. Ako je osoba zaražena, antitijela se pojavljuju unutar dva tjedna, koja se mogu otkriti mnogo kasnije. Posebnost HIV-a je da se količina antitijela brzo povećava i ostaje u krvi pacijenta. Čak i ako su prisutni, bolest se ne mora manifestirati dvije ili više godina. ELISA metoda ne utvrđuje uvijek točno prisutnost bolesti, pa je potrebna potvrda rezultata pomoću imunoblotinga i PCR-a ako enzimski imunološki test pokaže pozitivan rezultat.

Indikacije za upotrebu

Što je "imunoblot" već je otkriveno, ali za koga je ova studija propisana? Razlog za testiranje imunoblotingom je pozitivan rezultat ELISA testa. Za pacijente koji će biti podvrgnuti operaciji potrebno je podvrgnuti enzimskom imunološkom testu. Osim toga, trebale bi se testirati žene koje planiraju trudnoću, kao i sve neuredne osobe. spolni život. Imunoblotting se propisuje pacijentima s HIV-om ako su rezultati ELISA upitni. Sljedeći mogu biti razlozi za savjetovanje s liječnikom: alarmantne simptome:

nagli gubitak težine;
slabost, gubitak performansi;
crijevni poremećaj (proljev) koji traje tri tjedna;
dehidracija tijela;
vrućica;
povećati limfni čvorovi na tijelu;
razvoj kandidijaze, tuberkuloze, upale pluća, toksoplazmoze, pogoršanja herpesa.

Pacijent se ne treba pripremati prije testa venske krvi. Ne smijete jesti hranu 8-10 sati prije testa. Dan prije davanja krvi nije preporučljivo piti alkoholna pića i kavu, baviti se intenzivnim fizičkim vježbama ili osjećati tjeskobu.

Gdje napraviti analizu?

Gdje se mogu testirati na HIV? ELISA i imunoblot studije provode se u gradskim privatnim klinikama, rezultati se izdaju u roku od 24 sata. Moguća je i hitna dijagnoza. U javnim medicinskim ustanovama ELISA testovi i imunobloting provode se besplatno, u skladu sa zakonodavstvom Ruske Federacije. Obavezno je provjeriti zarazne bolesti trudnice, kao i pacijenti koji su podvrgnuti hospitalizaciji ili operaciji.

Kako se provodi istraživanje?

Kako se provodi ELISA analiza? Pozitivan/negativan imunoblot potvrđuje ili opovrgava rezultate enzimskog imunološkog testa. Procedura istraživanja je vrlo jednostavna. Specijalist uzima vensku krv, što traje ne više od pet minuta. Nakon uzimanja uzoraka mjesto uboda treba dezinficirati i zalijepiti flasterom. Uzorkovanje se provodi na prazan želudac, tako da nakon postupka neće škoditi pojesti pločicu tamne čokolade ili popiti slatko toplo piće.

Da biste dobili uputnicu za besplatnu pretragu u javnoj zdravstvenoj ustanovi, morate posjetiti liječnika opće prakse. Općenito, imunobloting se ne razlikuje od drugih krvnih testova u smislu metode uzorkovanja. Metodologija istraživanja je jednostavna. Ako postoji virus u krvi osobe, tijelo počinje proizvoditi antitijela da ga uništi. Svaki virus ima svoj skup antigenskih proteina. Detekcija ovih antitijela osnova je tehnike imunoblotinga.

Cijena

Koliko košta analiza? Imunoblot na HIV nije jeftin test. U prosjeku, probirni pregled pomoću metoda enzimske imunološke analize košta od 500 do 900 rubalja. Imunoblotting je studija provjere, čija je cijena od tri do pet tisuća rubalja. Više složene metode su puno skuplji. Na primjer, morat ćete platiti oko 12.000 rubalja.

Tumačenje rezultata

Najčešće metode za dijagnosticiranje HIV infekcije su enzimski imunotestovi i imunoblotovi. Koriste se za određivanje protutijela na virus imunodeficijencije u krvnom serumu. Prisutnost infekcije obično se potvrđuje dvama testovima: probirnim i potvrdnim. Tumačenje rezultata studije treba provesti liječnik, koji također postavlja dijagnozu i propisuje liječenje. Ako je imunoblot pozitivan, to znači da je virus prisutan u ljudskom tijelu.

Pozitivan rezultat ne bi trebao biti razlog za samoliječenje, budući da svaki pacijent može imati drugačiju sliku bolesti. Kvalitativna analiza uključuje pregled i provjeru. Ako pacijent nema virus, rezultat je označen kao "negativan". Ako se otkrije probirom, provodi se dodatna verifikacijska studija. Imunoblot je analiza koja potvrđuje ili opovrgava probir. Ako se na test traci pojavi zatamnjenje na određenim područjima (mjesta proteina), postavlja se dijagnoza HIV-a. Ako su rezultati dvojbeni, ispitivanja se provode u roku od tri mjeseca.

Ako se pridržavate, možete spriječiti infekciju virusom imunodeficijencije određena pravila: izbjegavajte povremeni seks, koristite kondom tijekom kontakta, ne uzimajte droge. Ako se bolest otkrije kod trudnice, važno je strogo slijediti preporuke liječnika i ne zaboraviti proći preglede za prisutnost virusa.

Krv se vadi iz vene. Zatim se studija nastavlja prema uputama:

uzorak se stavlja u gel za elektroforetsko odvajanje, što rezultira specifičnim proteinima koji su osjetljivi na virus;
na tretirani gel nanosi se nitrocelulozni papir;
pripremljeni uzorak stavlja se u aparat za upijanje.

Za identifikaciju određenih enzima potrebno je pravilno pripremiti papir za laboratorijsko ispitivanje. Da bi se to postiglo, na njega se primjenjuju protutijela i obilježeni radioaktivni konjugat. Rezultat studije procjenjuje se vizualno, ispituju se izgrađeni lanci enzima.

Dekodiranje rezultata

Nakon manipulacije na papiru ostaju pruge. Nalaze se na mjestu gdje je došlo do konjugacije, odnosno gdje je primijenjeni lijek reagirao s proteinom virusa. Na ovaj način možete otkriti dijelove proteina:

iz jezgre HIV-1 – p17, p24, p55;
patogen HIV-2 – p16, p26, p56.

Rezultati imunoblotinga smatraju se pozitivnima ako su otkrivena 2 od 3 HIV-1 ili HIV-2 proteina. Budući da se Western blot (drugi naziv studije) često koristi za potvrdu pozitivan ELISA, zatim se reakcija provjerava za specifične proteine: gp120/160, gp41 ili p24. Oni su dio tri glavna gena za AIDS - gag, pol i env. Prilikom inicijalne dijagnoze test se radi samo na proteine p25, gp110/120 i gp160, a ako daje pozitivan rezultat, radi se test na p24. Ovaj dio proteina omogućuje otkrivanje virusa u ranoj fazi.

Pozitivan nalaz je razlog za traženje složenije dijagnostike. Lažna je samo u 3 slučaja:

kod pacijenata sa visoka razina bilirubin;
nakon kontakta s virusnim antigenima;
za patologije vezivnog tkiva.

Ako pacijent nema linije koje odgovaraju proteinima AIDS-a, tada se rezultat ocjenjuje kao negativan. To znači da osoba nije zaražena HIV-om ili je u razdoblju prozora. Potonje znači da je virus mogao ući u tijelo, ali se u njemu još nije razvio. Da bi se povećala točnost dijagnoze, koriste se testni sustavi:

rekombinantni-HIV;
Antigen;
Peptoscreen.

Nakon njihove provjere, rezultat se smatra negativnim ako se proteini gp120, gp160, Sp4 ne nalaze u uzorku.

Postoji još jedna mogućnost tumačenja - neutralan ili sumnjiv rezultat. Javlja se kod onih koji imaju seksualni kontakt s partnerom zaraženim HIV-om. U krvi im se nalaze antitijela na proteine gp120 i gp160. Također, dvojbeni odgovor tijekom blotanja daje se kada je infekcija asimptomatska, odnosno u stanju mirovanja.

Važno je temeljito provjeriti upitni rezultat. U tu svrhu koristi se dinamička studija krvnog seruma, odnosno redovite kontrole imunoblotingom i ELISA metodama tijekom šest mjeseci. Također imenovan dodatne preglede budući da prisutnost autoantitijela i imunoloških kompleksa u krvi može biti posljedica:

zarazne bolesti;
prisutnost tumora raka;
alergije.

Imunoblot (imunoblot, Western blot, western blot)- kombinira enzimski imunološki test (ELISA) s preliminarnim elektroforetskim prijenosom antigena virusa na nitroceluloznu traku (traku).

U ovom lijepom znanstvenom nazivu "blot" je najvjerojatnije preveden kao "mrlja", a "western" kao "zapadni" odražava smjer širenja ove "mrlje" po papiru s lijeva na desno, tj. geografska karta ovo odgovara smjeru od zapada prema istoku.” Bit metode "imune mrlje" je da se imunoenzimska reakcija ne provodi s mješavinom antigena, već s HIV antigenima, prethodno raspodijeljenim imunoforezom u frakcije smještene prema molekularnoj težini na površini nitrocelulzne membrane. Kao rezultat toga, glavni proteini HIV-a, nositelji antigenskih determinanti, raspoređeni su po površini u obliku zasebnih pruga, koje se pojavljuju tijekom enzimski povezane imunosorbentne reakcije.

Imunoblot uključuje nekoliko faza:

Priprema trake. Virus imunodeficijencije (HIV), prethodno pročišćen i razbijen na sastavne komponente, podvrgava se elektroforezi, a antigeni koji čine HIV odvajaju se prema molekularnoj težini. Zatim se pomoću metode upijanja (analogno istiskivanju viška tinte na upijač) antigeni prenose na traku nitroceluloze koja sada sadrži spektar antigenskih traka karakterističnih za HIV, koji je još uvijek nevidljiv oku.

Ispitivanje uzorka. Testni materijal (serum, krvna plazma bolesnika i dr.) nanosi se na nitroceluloznu traku, a ako u uzorku ima specifičnih protutijela, ona se vežu na strogo odgovarajuće (komplementarne) antigenske trake. Kao rezultat naknadnih manipulacija, rezultat ove interakcije se vizualizira - postaje vidljiv.

Tumačenje rezultata. Prisutnost traka u određenim područjima nitroceluloznih ploča potvrđuje prisutnost antitijela na strogo definirane HIV antigene u testiranom serumu.

Traka A - pozitivna kontrola

Traka B - Slaba pozitivna kontrola

Traka C - negativna kontrola

Traka D - Pozitivan uzorak (otkrivena antitijela na HIV-1)

Trenutno je imunoblot (imunoblot) glavna metoda za potvrđivanje prisutnosti antitijela specifičnih za virus u testnom serumu. U nekim slučajevima infekcije HIV-om, prije nego što dođe do serokonverzije, specifična antitijela se učinkovitije otkrivaju imunobloting nego ELISA. Proučavajući metodom imunoblotinga, utvrđeno je da se antitijela na gp 41 najčešće detektiraju u serumima pacijenata s AIDS-om, a otkrivanje p24 kod osoba pregledanih u preventivne svrhe zahtijeva dodatna istraživanja kako bi se utvrdilo imaju li HIV infekciju. Testni sustavi imunoblotinga temeljeni na genetski modificiranim rekombinantnim proteinima pokazali su se specifičnijima od konvencionalnih sustava temeljenih na pročišćenom virusnom lizatu. Pri korištenju rekombinantnog antigena ne nastaje difuzna, već jasno definirana uska antigenska traka, koja je lako dostupna za snimanje i procjenu.

Serumi osoba zaraženih HIV-1 otkrivaju protutijela na sljedeće glavne proteine i glikoproteine - proteine strukturne ovojnice (env) - gp160, gp120, gp41; jezgra (gag) - p17, p24, p55, kao i virusni enzimi (pol) - p31, p51, p66. Antitijela na env tipična su za HIV-2 - gp140, gp105, gp36; gag - p16, p25, p56; pol - str.68.

Od laboratorijskih metoda potrebnih za utvrđivanje specifičnosti reakcije najpriznatija je detekcija protutijela na proteine ovojnice HIV-1 - gp41, gp120, gp160 i HIV-2 - gp36, gp105, gp140.

WHO smatra pozitivnim serume u kojima su antitijela na bilo koja dva HIV glikoproteina otkrivena imunoblotingom. Prema ovim preporukama, ako postoji reakcija samo s jednim od proteina ovojnice (gp 160, gp 120, gp 41) u kombinaciji ili bez reakcije s drugim proteinima, rezultat se smatra sumnjivim i preporučuje se ponovno testiranje pomoću komplet iz druge serije ili druge tvrtke. Ako i nakon toga rezultat ostane dvojben, preporučuje se promatranje tijekom 6 mjeseci (istraživanje nakon 3 mjeseca).

Dostupnost pozitivna reakcija s p24 antigenom može ukazivati na razdoblje serokonverzije, budući da se antitijela na ovaj protein katkad pojavljuju prva. U tom slučaju preporuča se, ovisno o kliničkim i epidemiološkim podacima, ponoviti studiju s uzorkom seruma uzetim najmanje 2 tjedna kasnije, a upravo je to slučaj kada je testiranje uparenih seruma potrebno kod HIV infekcije.

Pozitivne reakcije s gag i pol proteinima bez reakcije s env proteinima mogu odražavati ranu serokonverziju i također mogu ukazivati na HIV-2 infekciju ili nespecifičnu reakciju. Osobe s ovim rezultatima nakon testiranja na HIV-2 ponovno se testiraju nakon 3 mjeseca (unutar 6 mjeseci).

Imunoblot (imunoblot, Western blot, western blot)- kombinira enzimski imunološki test (ELISA) s preliminarnim elektroforetskim prijenosom antigena virusa na nitroceluloznu traku (traku).

U ovom lijepom znanstvenom nazivu, "blot" je najvjerojatnije preveden kao "mrlja", a "western" - kao "western" odražava smjer distribucije ove "mrlje" na papiru s lijeva na desno, odnosno na geografskoj karti ovo odgovara smjeru od zapada prema istoku." Bit metode "imune mrlje" je da se imunoenzimska reakcija ne provodi s mješavinom antigena, već s HIV antigenima, prethodno raspodijeljenim imunoforezom u frakcije smještene prema molekularnoj težini na površini nitrocelulzne membrane. Kao rezultat toga, glavni proteini HIV-a, nositelji antigenskih determinanti, raspoređeni su po površini u obliku zasebnih pruga, koje se pojavljuju tijekom enzimski povezane imunosorbentne reakcije.

Imunoblot uključuje nekoliko faza:

Tumačenje rezultata. Prisutnost traka u određenim područjima nitroceluloznih ploča potvrđuje prisutnost antitijela na strogo definirane HIV antigene u testiranom serumu.

Traka A - pozitivna kontrola

Traka B - Slaba pozitivna kontrola

Traka C - negativna kontrola

Traka D - Pozitivan uzorak (otkrivena antitijela na HIV-1)

Trenutno je imunoblot (imunoblot) glavna metoda za potvrđivanje prisutnosti antitijela specifičnih za virus u testnom serumu. U nekim slučajevima infekcije HIV-om, prije nego što dođe do serokonverzije, specifična antitijela se učinkovitije otkrivaju imunoblotingom nego ELISA testom. Proučavajući metodom imunoblotinga, utvrđeno je da se antitijela na gp 41 najčešće detektiraju u serumima pacijenata s AIDS-om, a otkrivanje p24 kod osoba pregledanih u preventivne svrhe zahtijeva dodatna istraživanja kako bi se utvrdilo imaju li HIV infekciju. Testni sustavi imunoblotinga temeljeni na genetski modificiranim rekombinantnim proteinima pokazali su se specifičnijima od konvencionalnih sustava temeljenih na pročišćenom virusnom lizatu. Pri korištenju rekombinantnog antigena ne nastaje difuzna, već jasno definirana uska antigenska traka, koja je lako dostupna za snimanje i procjenu.

Od laboratorijskih metoda potrebnih za utvrđivanje specifičnosti reakcije najpriznatija je detekcija protutijela na proteine ovojnice HIV-1 - gp41, gp120, gp160 i HIV-2 - gp36, gp105, gp140.

Prisutnost pozitivne reakcije s antigenom p24 može ukazivati na razdoblje serokonverzije, budući da se antitijela na ovaj protein ponekad pojavljuju prva. U tom slučaju preporuča se, ovisno o kliničkim i epidemiološkim podacima, ponoviti studiju s uzorkom seruma uzetim najmanje 2 tjedna kasnije, a upravo je to slučaj kada je testiranje uparenih seruma potrebno kod HIV infekcije.

Imunobloting –(od engleskog "blot" - mrlja) - metoda za identifikaciju antigena (ili antitijela) pomoću poznatih seruma (ili antigena). Kombinacija je gel elektroforeze i ELISA testa. U početku se ultrazvukom uništavaju bakterijske stanice ili virioni, a zatim se elektroforezom odvajaju svi antigeni virusa ili bakterijskih stanica te se na posebnoj nitroceluloznoj foliji dobije komercijalni reagens. Prilikom izvođenja imunoblotinga, serum pacijenta koji se proučava nanosi se na film s poznatim antigenima. Nakon inkubacije i ispiranja nevezanih protutijela prijeći na ELISA - na film se nanosi antiserum na humane imunoglobuline obilježene enzimom i kromogeni supstrat koji mijenja boju u interakciji s enzimom. U prisutnosti antigen-antitijela-antiseruma na komplekse imunoglobulin-enzim, na nosaču se pojavljuju obojene mrlje. Metoda imunoblotinga omogućuje vam odvojeno otkrivanje antitijela na raznih antigena patogena (na primjer, kod infekcije HIV-om, imunobloting otkriva antitijela na gp120, gp24 i druge virusne antigene).

Radioimunotest (RIA)

Metoda se temelji na reakciji antigen-antitijelo pomoću radionuklida označenog antigena ili antitijela. Kao oznake koriste se 125I, 14C, 3H, 51Cr i drugi radionuklidi. Nastali imunološki kompleksi se izoliraju iz sustava i njihova se radioaktivnost određuje na brojačima (β-zračenje). Intenzitet zračenja izravno je proporcionalan broju vezanih molekula antigena i antitijela.

Verzija RIA-e u čvrstoj fazi koja koristi obilježena antitijela ili antigene apsorbirane u jažicama polistirenskih ploča široko je rasprostranjena.

RIA se koristi za otkrivanje antigena mikroba, virusa, raznih hormona, enzimi, ljekovite tvari, imunoglobulini, kao i druge tvari sadržane u ispitivanom materijalu u manjim koncentracijama od 10-12-10-15 g/l.

Kontrolna pitanja

Imunološka reakcija bakteriolize: kakva je to reakcija; što je antigen, što je antitijelo, mehanizam reakcije, metode proizvodnje, praktičnu upotrebu. Imunološka reakcija hemolize: potrebni sastojci, postupak; kontrole, praktična primjena. Reakcija lokalne hemolize u gelu (Jerneova reakcija): princip reakcije, način formulacije, praktična primjena. Reakcija vezanja komplementa: princip reakcije; što nastaje kada imunološki serum stupi u interakciju sa specifičnim antigenom; što se događa s komplementom ako je prisutan tijekom ove interakcije? Kakva je sudbina komplementa ako ne postoji specifičan afinitet između antigena i protutijela? Kojom se reakcijom može odrediti što se dogodilo s komplementom; zašto se koristi ova posebna reakcija; Koji je vidljivi pozitivan rezultat RSC-a? Zašto? Koje se svojstvo komplementa koristi u prvoj fazi RSC? U drugoj fazi? Ako krajnji rezultat RSC je hemoliza, što znači - pozitivna odn negativan rezultat? Objasniti rezultate: RSK+ + + +, RSK+ + +, RSK+ +, RSK+. Imenuj sastojke prvog RSK sustava i sastojke drugog RSK sustava. Zašto se testni serum mora inaktivirati? Kako se titrira komplement? Hemolitički serum: što sadrži, kako se dobiva, koji je titar i kako se određuje? Koje se životinje koriste za dobivanje komponenti RSC? Metodologija postavljanja RSC-a na hladnoći. Kod stadija koja od sljedećih reakcija zahtijeva sudjelovanje komplementa: precipitacija, flokulacija, aglutinacija, detekcija nepotpunih protutijela, imunološka bakterioliza, imunološka hemoliza, Jerne, RSC? Reakcija imunofluorescencije (RIF) - označava slijed događaja u izravnoj Koonsovoj reakciji; potrebne sastojke. Što je antigen, što je antitijelo, čime se obilježavaju antitijela, kako se uzima u obzir rezultat reakcije, kako izgleda pozitivan rezultat? Praktična primjena - što se može odrediti ovom reakcijom? Reakcija neizravne imunofluorescencije - navesti redoslijed događaja tijekom ove reakcije, potrebne sastojke, koji je antigen, koji se imunološki serumi koriste; praktična upotreba; prednost neizravnog RIF-a u usporedbi s izravnom reakcijom. Vezani imunosorbentni test(ELISA) – princip reakcije; potrebni sastojci; navesti redoslijed događaja prilikom izvođenja reakcije za otkrivanje antigena u materijalu koji se testira; potrebni sastojci; Što kada je nalaz pozitivan, kako to izgleda? Navedite redoslijed radnji pri izvođenju ELISA testa za otkrivanje protutijela u ispitivanom serumu; potrebni sastojci; što se događa ako je rezultat pozitivan? Imunobloting – princip reakcije; glavne faze; potrebni sastojci; kako se rezultat uzima u obzir; prednosti reakcije. Radioimunotest (RIA) - koji su glavni stadiji reakcije; Čime su obilježena antitijela ili antigeni, kako se rezultat uzima u obzir? Imunoelektronska mikroskopija - princip metode; glavne faze; potrebni sastojci; čime su označena antitijela? kako se uzima u obzir rezultat reakcije. Reakcije imobilizacije – princip metode, tehnika postavljanja, komponente, bilježenje rezultata.

Zadaci koje treba izvršiti tijekom procesa samostalnog učenja.

Ispunite tablicu “Imunološke reakcije” u odnosu na reakcije o kojima se govori u okviru ove teme.

Imunološke reakcije

Rad studenata tijekom praktične nastave

Započnite odmah s radom s postavljanjem faze 1 RSK, ali to kasnije zapišite u svoju bilježnicu (vidi dolje).

1. Imunološka reakcija hemolize. Pogledajte pokaznu reakciju imunološke hemolize, skicirajte je u obliku dijagrama, obrazložite rezultat u pokusnoj i kontrolnoj epruveti.

2. Reakcija fiksacije komplementa

a) analizirati RSK prema tablici;

b) nacrtati u bilježnicu shemu postava RSC u obliku tablice;

c) stavite drugu fazu RSK (prva faza se stavlja na početak lekcije);

d) analizirati dijagnostičke preparate potrebne za RSC;

d) uzeti u obzir rezultat. Formulirajte zaključak o prisutnosti specifičnih protutijela u ispitivanom serumu.

3. Reakcija imunofluorescencije. Proučite tablicu, napravite dijagram reakcije u svoju bilježnicu; pogledati dijagnostičke serume; odrediti što serum sadrži, kako se priprema, za koju reakciju (izravnu ili neizravnu RIF) koristi. Pogledajte rezultat demonstracije RIF-a u fluorescentnom mikroskopu.

4. Imunoenzimski test (ELISA). U svojoj bilježnici nacrtajte shemu za postavljanje reakcije u dvije verzije: za otkrivanje antigena u ispitivanom materijalu i za otkrivanje antitijela u serumu. Pregledajte komplet sa sastojcima za HIV i hepatitis B. Odredite što svaki sastojak sadrži i za što se koristi.

5. Imunobloting. Napravite dijagram reakcije u svoju bilježnicu; gledati demonstraciju - rezultat reakcije.

6. Radioimunotest (RIA). Napravite dijagram reakcije u svoju bilježnicu.

7. Imunološka elektronska mikroskopija (IEM). Pogledajte demonstraciju - rezultat reakcije, nacrtajte shemu reakcije u svoju bilježnicu, označite strelicama antigen (virus) i označena antitijela.

Imunobloting je vrlo osjetljiva metoda za detekciju proteina, koja se temelji na kombinaciji elektroforeze i ELISA ili RIA. Imunobloting se koristi kao dijagnostička metoda za HIV infekciju itd.

U općem smislu, imunoblotiranje se odnosi na analizu mješavine proteina prenesenih na čvrstu membransku potporu, za koju su vezani kovalentnim vezama, nakon čega slijedi imunodetekcija.

Možete analizirati mješavinu proteina izravno nanesenu na supstrat - dot blot analiza - ili nakon njenog preliminarnog frakcioniranja elektrofokusiranjem, disk elektroforezom ili dvodimenzionalnom elektroforezom - Western blot analiza.

Antigeni patogena se odvajaju pomoću elektroforeze u poliakrilamidnom gelu, zatim prenose iz gela na aktivirani papir ili nitroceluloznu membranu i razvijaju pomoću ELISA.

Tvrtke proizvode takve trake s "mrljama" antigena. Na ove trakice nanosi se serum pacijenta. . Zatim se nakon inkubacije pacijent ispere od nevezanih protutijela i aplicira serum protiv humanih imunoglobulina obilježenih enzimom . Kompleks nastao na traci (antigen + antitijelo pacijenta + antitijelo protiv humanog Ig) detektira se dodavanjem kromogenog supstrata koji pod djelovanjem enzima mijenja boju.

Ova se metodologija također koristi za odabir klonova bakterija, faga ili virusa koji izražavaju ciljane klonirane genske proizvode.

Prijenos proteina na membranu provodi se ili pasivno ili pomoću opreme za elektrotransfer. Na učinkovitost prijenosa proteina na membranu utječu mnogi čimbenici, kao što su molekularna težina proteina, poroznost gela, vrijeme prijenosa i sastav otopine pufera (trans-pufer) koji se koristi.

Ovisno o ciljevima i uvjetima eksperimenta odabiru se uvjeti prijenosa koji osiguravaju najbolje rezultate. Nitroceluloza, poliviniliden difluorid (PVDF) ili pozitivno nabijene najlonske membrane obično se koriste kao supstrati. Nitroceluloza može vezati do 80 - 100 μg proteina na 1 cm2.

Proteini niske molekularne težine (s molekularnom težinom manjom od 20 kDa) mogu se izgubiti kao rezultat ispiranja.To omogućuje preliminarno proučavanje polimorfizma određenih genetskih lokusa na temelju duljina odgovarajućih restrikcijskih fragmenata DNA.

Osim toga, koristeći Southern hibridizaciju, možete lako saznati ima li ciljni gen mjesto hidrolize određenim restrikcijskim enzimom u svom unutarnjem dijelu, što vam omogućuje odabir optimalne strategije za kloniranje proučavane regije genoma.

Koristeći sličnu shemu, molekule RNA mogu se prenijeti iz agaroznog gela u nitrocelulozni filtar. Ova metoda je nazvana Northern blotting, za razliku od Southern blottinga, budući da je prezime Southern u Engleski jezik znači "južni".

Prijenos proteina na filtere iz gela je prema tome nazvan Western blotting. Veliki proteini (>100 kDa) denaturirani u otopini natrijeva dodecil sulfata (SDS) mogu se slabo prenijeti na membranu ako je etanol prisutan u trans puferu. Alkohol značajno poboljšava prijenos proteina iz SDS-poliakrilamidnog gela, ali sužava pore u gelu, što dovodi do zadržavanja velikih proteina.

PVDF membrana optimizirana je za imunodetekciju i sposobna je zadržati do 160 μg/cm2 specifično vezanih proteina s vrlo niskim razinama nespecifičnog vezanja.

Imunobloting

Važno svojstvo ove membrane je mogućnost njezine višekratne uporabe. Zeta-Probe najlonske membrane učinkovito vežu SDS proteine u odsutnosti alkohola, a to vezanje je otporno na naknadne tretmane. Proteini niske molekularne težine također se učinkovito zadržavaju. S visokim kapacitetom vezanja od približno 480 μg proteina po cm2, Zeta-Probe membrane omogućuju detekciju tragova proteina u testnim smjesama.

Nakon što je antigen imobiliziran na membrani, preostala vezna mjesta blokiraju se otopinama želatine, goveđeg serumskog albumina ili obranog mlijeka.

Zatim se membrana inkubira u otopini poliklonskih ili monoklonskih antitijela na antigen koji se proučava. Nakon ispiranja nevezanih protutijela, membrana se inkubira u otopini sekundarnih protutijela, koja su konjugat enzima alkalne fosfataze (AP) ili peroksidaze hrena (HRP) s anti-specis protutijelima (kozja protutijela na zečje, mišje ili ljudske imunoglobuline). ) ili proteini A (protein Staphylococcus aureus) ili G (protein Streptococcus sp.), koji imaju visok afinitet za Fc regiju imunoglobulina.

Detekcija formiranih imunoloških kompleksa provodi se kemijski ili kemiluminescentno. Podloge za kemijska reakcija Kada koristite konjugate alkalne fosfataze, koristite 5-brom-4-klor-3-indolil fosfat (BCIP) ili plavi tetrazolij (NBT), a kada koristite konjugate peroksidaze hrena koristite 4-klor-1-naftol i vodikov peroksid.

Kao rezultat enzimskih reakcija nastaje obojena traka ili mrlja na membrani na mjestu lokalizacije kompleksa antigen-antitijelo.

Osjetljivost ove metode je 100 pg proteina kada se koriste AP konjugati i 100-500 pg kada se koriste HRP konjugati. Kemiluminiscentna detekcija imunoloških kompleksa omogućuje detekciju manje od 5 pg antigena. Princip ove metode je da kada HRP reagira s vodikovim peroksidom i cikličkim diacilhidrazin luminolom, emitira se svjetlost na valnoj duljini od 428 nm, što se može zabilježiti na fotoosjetljivom filmu.

Reakcija imunoblotinga (IB) razvijena je na temelju ELISA. To je najspecifičnija i najosjetljivija metoda imunokemijske analize. Imunobloting (od engleskog blot - mrlja, mrlja) kombinira ELISA s elektroforezom. Koristi se za otkrivanje ne složenih protutijela na HIV, već protutijela na njegove pojedinačne strukturne proteine (proteini p24, glikoproteini gp120, gp 41 itd.). Odnosi se na stručne (potvrđujuće) reakcije za dijagnosticiranje HIV infekcije.

Reakcija se odvija u nekoliko faza:

Virus se razgrađuje na komponente - antigene (p24, gp120, gp 41 itd.) koji se podvrgavaju elektroforezi u poliakrilamidnom gelu, odnosno razdvajanju antigena na frakcije po molekularnoj masi.

2. Gel je prekriven nitroceluloznom membranom i elektroforezom se u njega prenose frakcije antigena. Nitroceluloza se ponaša kao upijajući papir. Membrana se reže na trake. Tvrtke proizvode takve trake s "mrljama" antigena.

Imunobloting - dodatna neizravna metoda

Trake obložene HIV antigenima uranjaju se u serum subjekta i potom isperu kako bi se uklonio nevezani materijal.

4. Trake se inkubiraju s antiglobulinskim serumom obilježenim peroksidazom i isperu.

Doda se supstrat i bilježi se broj obojenih frakcija (mrlja) koje odgovaraju zoni lokalizacije kompleksa AG-AT.

Prisutnost traka u određenim područjima trake potvrđuje prisutnost antitijela na strogo definirane HIV antigene u testiranom serumu. Rezultat imunoblotinga smatra se pozitivnim ako su na membrani vidljive trake koje odgovaraju bilo koja dva od tri HIV antigena - p24, gp41 i gp 120 (slika 37).

CRTEŽI

POPIS KORIŠTENE LITERATURE

Glavna literatura

Medicinska mikrobiologija, virologija i imunologija: udžbenik za studente medicine. sveučilišta 2. izd., rev. i dodatni — 702 str. ur. A.A. Vorobjova. M.: MIA, 2012.

2. Mikrobiologija, virologija i imunologija: priručnik za laboratorijsku nastavu: udžbenik/(V.B. Sboychakov i dr.); uredio V. B. Sboychakova, M. M. Karapats. – M.: GEOTAR-Media, 2014.- 320 str.: ilustr.

3. Medicinska mikrobiologija, imunologija i virologija [Elektronička građa]: udžbenik za med.

sveučilišta - 760 str. — Način pristupa: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN9785299004250.html Korotyaev A.I., Babichev S.A. Sankt Peterburg: Spetslit, 2010.

4. Medicinska mikrobiologija, virologija i imunologija [Elektronička građa]: udžbenik: u 2 sveska / Svezak 1. - 448 str. — Način pristupa: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142241.html Zverev V.V., Boychenko M.N.

M.: Geotar Media, 2010. .

5. Medicinska mikrobiologija, virologija i imunologija [Elektronička građa]: udžbenik: u 2 sveska T. 2. - 480 str. Način pristupa: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142242.html Zverev V.V., Boychenko M.N. M.: Geotar Media, 2010.

dodatna literatura

1. Imunodijagnostičke reakcije: tutorial/ sastavili: G.K.Davletshina, Z.G.Gabidullin, A.A.Akhtarieva, M.M.Tuigunov, A.K.Bulgakov, T.A.Savchenko, R.F.

Khusnarizanova, Yu.Z. Gabidullin, M.M. Alsynbaev - Ufa: Izdavačka kuća Državne proračunske obrazovne ustanove visokog stručnog obrazovanja BSMU Ministarstva zdravstva Rusije, 2016. - 86 str.

2. Značajke nekih svojstava koja određuju patogeni potencijal kokultiviranih varijacija bakterija Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E.coli, Proteus: znanstvena publikacija / Yu. Z. Gabidullin, R. S. Sufiyarov, I. I. Dolgushin - Ufa, 2015. - 250 s.

Početna » Immunoblot – što je to? Imunoblot u dijagnostici zaraznih bolesti

Imunoblot - što je to? Imunoblot u dijagnostici zaraznih bolesti

Što je imunoblot? Ovo je uobičajena metoda za laboratorijsku dijagnostiku ljudskih virusnih infekcija. To je jedan od najpreciznijih i najpouzdanijih načina otkrivanja prisutnosti HIV-a.

Što se tiče pouzdanosti, čak je veći od enzimskog imunoanalize (elisa). Rezultati imunoblota smatraju se konačnima i konačnima Opće informacije

Imunoblot - što je to? Da biste prepoznali da osoba ima HIV, morate proći laboratorijska metoda testovi krvnog seruma na prisutnost antitijela.

Western blot sekcije također se nazivaju Western blot. Koristi se za otkrivanje virusnih infekcija ljudi kao dodatna ekspertna metoda. Ovo je neophodno za potvrdu ELISA - laboratorijskog testa koji vam omogućuje određivanje prisutnosti antitijela na HIV u krvi. Imunoblot ponovno provjeriti pozitivan ELISA.

Smatra se najosjetljivijim, složenim i skupim.

Cilj

Što je imunoblot? Ova tehnika laboratorijska istraživanja krvni serum za prisutnost antitijela na virus.

Tijekom posebna istraživanja ukupnih virusnih proteina u gelu i na nitroceluloznoj membrani.

Imunobloting (otkrivanje antitijela u serumima pacijenata na određene antigene patogena)

Western blot postupak namijenjen je određivanju HIV infekcije u različitim fazama. U prvoj fazi, pročišćeni virus iz njegovih sastavnih dijelova podvrgava se elektroforezi, a antigeni koji su u njemu uključeni podijeljeni su prema molekularnoj težini.

Virus ljudske imunodeficijencije razmnožava se u živim stanicama ugrađenim u njegovu genetsku informaciju. U ovoj fazi osoba postaje nositelj virusa HIV-a ako ste bili zaraženi.

Specifičnost ove bolesti je da se dugo ne manifestira. Virus uništava limfocite, pa čovjekov imunitet opada i tijelo postaje nesposobno boriti se protiv infekcija.

Ako se HIV liječi ispravno i pravodobno, pacijent će doživjeti duboku starost. Nedostatak liječenja neizbježno dovodi do smrti. Od trenutka infekcije, ali bez liječenja, maksimalno razdoblje nije dulje od deset godina.

Osobitosti

Imunoblot analiza je pouzdana metoda koja vam omogućuje određivanje prisutnosti antitijela na HIV antigene prvog i drugog tipa.

Ako je osoba zaražena, nakon dva tjedna antitijela se mogu otkriti mnogo kasnije. Posebnost HIV-a je da se količina antitijela brzo povećava i ostaje u krvi bolesnika. Čak i ako su prisutni, bolest se ne mora manifestirati dvije ili više godina. ELISA metoda ne pokazuje uvijek točno prisutnost bolesti, zahtijeva potvrdu rezultata PCR i Western blot sekcija ako je enzimski imunološki test pokazao pozitivan rezultat.

Indikacije za

Kakav je “imunoblot” već otkriven, ali koji se uvodi u studiju?

Razlog za testiranje na virus humane imunodeficijencije (HIV) je imunoblot. pozitivan rezultat ELISA. Potrebno je proći imunoenzimski test kod pacijenata koji se podvrgavaju operaciji. Osim toga, treba napraviti analizu žena koje planiraju trudnoću, kao i onih koje su promiskuitetne. Western blot rezovi propisuju se pacijentima s HIV infekcijom ako su rezultati Elise dvosmisleni.

Sljedeći alarmantni simptomi mogu biti razlog za kontaktiranje liječnika: nagli gubitak tjelesne težine; slabost, gubitak funkcije; crijevni poremećaji (proljev), koji traje tri tjedna; dehidracija; groznica; povećani limfni čvorovi u tijelu; razvoj kandidijaze, tuberkuloze , upala pluća, toksoplazmoza, pogoršanje herpesa.

Pacijent se ne treba pripremati prije davanja venske krvi.

Nemojte jesti 8-10 sati prije testa. Ne preporuča se piti alkohol ili teške napitke od kave dan prije darivanja krvi. psihička vježba, osjećati se uzbuđeno.

Gdje napraviti analizu?

Gdje se mogu testirati na HIV?

ELISA, imunoblot analiza, koja se provodi u gradskim privatnim klinikama, daje rezultate za jedan dan. Moguća je i hitna dijagnoza. U javnim ustanovama medicinski testovi Elisa i Western blot sekcije su besplatni, u skladu sa zakonodavstvom Ruske Federacije.

Obavezan probir na zarazne bolesti kod trudnica i bolesnika koji trebaju hospitalizaciju ili operaciju Kako se provodi ovaj test?

Kako napraviti ELISA? Imunoblot pozitivan/negativan potvrđuje ili opovrgava rezultate elise. Postupak je prilično jednostavan. Specijalist prikuplja vensku krv, što traje manje od pet minuta.

Nakon uzimanja uzorka mjesto uboda treba dezinficirati i prekriti zavojem. Uzorkovanje se provodi na prazan želudac, tako da nakon postupka neće škoditi pojesti pločicu tamne čokolade ili slatko toplo piće.

Da biste dobili uputnicu za besplatno testiranje u javnoj zdravstvenoj ustanovi, morate posjetiti terapeuta.

Općenito, imunoblot se prikupljanjem krvi ne razlikuje od drugih krvnih pretraga. Metodologija istraživanja je jednostavna. Ako je virus prisutan u krvi osobe, tijelo počinje proizvoditi antitijela da ga uništi. Za svaki virus postoji mnogo proteinskih antigena. Detekcija ovih protutijela temelj je metode Western blot sekcije. Cijena

Koliko traje analiza? HIV imunoblot jedan je od najjeftinijih testova.

U prosjeku, imunološke metode skrininga kreću se od 500 do 900 rubalja. Western blot odjeljci su studija testova, čija se cijena kreće od tri do pet tisuća rubalja. Složenije metode su puno skuplje. Na primjer, za analizu polimeraze lančana reakcija(PCR) morat ćete platiti oko 12.000 rubalja.

Interpretacija rezultata

Najčešće metode za dijagnosticiranje HIV infekcije su enzimski imunoanaliza i imunoblot.

Koriste se za određivanje antitijela na virus humane imunodeficijencije u serumu. Infekcija se obično potvrđuje dvama testovima: probirnim i potvrdnim. Rezultate mora tumačiti liječnik, koji postavlja dijagnozu i propisuje liječenje. Ako je imunoblot pozitivan, to znači da postoji virus u ljudskom tijelu.

Pozitivan rezultat ne bi trebao biti razlog za samostalno liječenje, jer svaki pacijent može imati vlastitu sliku bolesti.

Kvalitativna analiza uključuje probir i certifikaciju. Ako se virus ne otkrije kod pacijenta, rezultat je "negativan". Kada se otkrije ova potvrda, provode se dodatne studije probira. Imunoblot analiza, koja potvrđuje ili opovrgava probir. Ako se test trake pojavljuju u određenim tamnim područjima (lokalizacija proteina), postavlja se dijagnoza HIV-a.

Ako su rezultati sumnjivi, tada se ispitivanja provode u roku od tri mjeseca.

Da biste spriječili infekciju virusom ljudske imunodeficijencije, moguće je ako slijedite određena pravila: izbjegavajte povremeni seksualni kontakt, koristite kondome tijekom kontakta, nemojte koristiti droge.

Ako se bolest otkrije kod trudnice, važno je slijediti preporuke liječnika i ne zaboraviti testirati na prisutnost virusa.

Što je Western blotting?

Identifikacija proteina u složenim smjesama ili ekstraktima različitih tkiva jedan je od čestih problema. Koristeći alat kao što su specifična antitijela, moguće je odrediti protein koji se proučava uz minimalne vremenske i financijske troškove.

U Western blotting metodi, u prvoj fazi, smjesa proteina se odvaja elektroforezom u prisutnosti natrijevog dodecil sulfata (SDS), zatim se elektroblotom prenosi na nitroceluloznu membranu.

Bit ove metode je da se nakon elektroforeze gel stavlja na nitroceluloznu membranu između slojeva filter papira. Ovako sastavljen “sendvič” stavlja se u električno polje tako da se kompleksi protein-SDS kreću po ploči gela i imobiliziraju (kao rezultat nespecifične sorpcije) na površini nitrocelulozne membrane.

Vezne sile kompleksa protein-SDS za nitroceluloznu membranu su uglavnom električne prirode, a ta je interakcija višetočkasta i dovodi do “širenja” proteina po površini membrane. Tako nakon elektrotransfera dobivamo repliku gela na nitrocelulozi s proteinima smještenim na isti način kao u poliakrilamidnom gelu.

Nakon SDS elektroforeze, elektrotransfera i sorpcije proteina iz gela na nitroceluloznu membranu, tercijarna konformacija proteina je jako promijenjena, ako je općenito ispravno govoriti o postojanju tercijarne strukture proteina nakon ovako oštrog tretmana. Stoga se za imunokemijsku detekciju proteina koji se proučava obično koriste samo mono- ili poliklonska protutijela specifična za linearna područja proteinske molekule.

51. Enzimski imunološki test, imunobloting. Mehanizam, komponente, primjena.

Protutijela specifična za konformacijske epitope (ili regije koje uključuju kontakte među podjedinicama) općenito nisu prikladna za upotrebu u Western blottingu.

Nakon prijenosa proteina, membrana se inkubira sekvencijalno s antitijelima specifičnim za protein koji se proučava, a zatim sa sekundarnim antitijelima specifičnim za Fc fragmente primarnih antitijela, konjugiranih s enzimskom (ili nekom drugom) oznakom (Sl.

1 A). U slučaju kada su primarna antitijela specifična za antigen koji se proučava direktno konjugirana na oznaku, sekundarna antitijela nisu potrebna (slika 1 B). Imunološki kompleksi formirani na mjestu lokalizacije proteina koji se proučava "manifestiraju" se pomoću kromogenog supstrata (ovisno o vrsti oznake).

Osjetljivost i specifičnost metode uvelike ovisi o tome koja se antitijela koriste u istraživanju.

Antitijela koja se koriste moraju biti specifična za jedinstvenu sekvencu aminokiselina karakterističnu samo za protein koji se proučava. U suprotnom, moguća je interakcija (osobito u slučaju sirovih proteinskih ekstrakata) protutijela s nekoliko proteinskih molekula, što će zauzvrat dovesti do pojave nekoliko obojenih traka na membrani.

Identifikacija proteina koji se proučava u ovom je slučaju često teška ili čak nemoguća.

Drugi važan faktor koji treba imati na umu pri odabiru antitijela je afinitet. Što je veći afinitet korištenih protutijela, što su svjetlije i jasnije obojene trake proteina, to je veća osjetljivost metode. Kada se koriste antitijela visokog afiniteta, može se postići osjetljivost od 1 ng ili čak i više.

Za vizualizaciju rezultata interakcije između membranski vezanog antigena i protutijela koriste se sekundarna protutijela, konjugirana s agensima sposobnim proizvesti određeni signal pod određenim uvjetima.

Obično se kao takvo sredstvo koristi enzim (peroksidaza ili fosfataza), čiji je produkt reakcije obojen i taloži se na membrani u obliku netopljivog taloga.

također u ovu metodu moguće je koristiti fluorescentne naljepnice.

Riža. 1. Shema imunokemijskog bojenja proteina koji se proučava: A - pomoću sekundarnih protutijela konjugiranih na enzimsku oznaku; B - primarno antitijelo izravno je konjugirano na enzimsku oznaku.

Protokol:

I. Priprema gela i membrane i elektrotransfer proteina

Nakon elektroforeze, poliakrilamidni gel se stavi u kupku s puferom za upijanje (25 mM Tris, pH 8,3, 192 mM glicin, 10% etanol).

Dva lista filter papira, izrezana u obliku kasete za upijanje i navlažena puferom za upijanje, stavljaju se na dio kazete koji će biti okrenut prema anodi. Zatim se na filter papir stavi nitrocelulozna membrana prethodno navlažena istim puferom, pazeći da između membrane i papira nema mjehurića zraka.

Nakon toga, gel treba pažljivo staviti na membranu, ponovno okrećući Posebna pažnja zbog nepostojanja mjehurića zraka između gela i membrane. Formiranje sendviča završavaju dva sloja navlaženog filter papira koji se postavljaju na površinu gela (slika 2). Dobiveni sendvič steže se u kasetu i postavlja između elektroda tako da je membrana okrenuta prema anodi.

Riža. 2. Shema elektroprijenosa proteina na membranu.

II. Električni prijenos

Elektrotransfer proteina na nitroceluloznu membranu provodi se u puferu koji sadrži 25 mM Tris, pH 8,3, 192 mM glicin, 10% etanol tijekom 30-50 min pri konstantnom naponu od 100 V.

Vrijeme elektrotransfera ovisi o veličini proteina koji se prenose; što je protein veći, to duže traje elektrotransfer. Kvaliteta elektrotransfera i položaj proteinskih vrpci procjenjuju se bojenjem nitroceluloznih membrana s 0,3% otopinom Ponceau S u 1% octena kiselina. Prije imunokemijskog bojenja membranu je potrebno nekoliko puta isprati slabo lužnatom otopinom Vodena otopina Tris za uklanjanje boje vezane za proteine.

III. Imunokemijsko bojenje proteina imobiliziranih na nitroceluloznoj membrani

Kako bi se blokirala mjesta vezanja nespecifičnih antitijela, membrana se inkubira uz stalno miješanje na sobnoj temperaturi 30 minuta u PBST (za bolje blokiranje Može se koristiti PBST otopina koja sadrži 10% obranog mlijeka u prahu).

Nakon blokiranja, membrana se inkubira sat vremena na sobnoj temperaturi uz stalno miješanje u PBST-u koji sadrži 1-10 μg/ml specifičnih protutijela.

Optimalna koncentracija protutijela odabire se empirijski i ovisi o afinitetu interakcije protutijela s antigenom.

Na kraju inkubacije isperite membranu 5 puta s PBST i prenesite je u otopinu sekundarnih protutijela konjugiranih na peroksidazu hrena. Razrjeđenje konjugata obično označava proizvođač na pakiranju ili ga empirijski odabire istraživač. Inkubirajte membranu u otopini sekundarnog antitijela 1 sat uz stalno miješanje.

Nakon temeljitog ispiranja (promjena pufera najmanje 5-6 puta), PBST membrana se prenosi u otopinu kromogenog supstrata koja sadrži 3 mg diaminobenzidina (DAB) i 10 μl 30% vodikovog peroksida u 10 ml 0,1 M Tris-HCl , pH 7,6.

Inkubacija se provodi uz miješanje 5 - 10 minuta. Nakon završetka inkubacije sa supstratom, membranu treba isprati PBST-om, osušiti upijanjem filter papirom i odmah elektronička kopija, skeniranje u boji. Ako se membrana potpuno osuši, obojene pruge proteina izblijede i slika postaje manje svijetla i kontrastna.

Napomena: DAB je toksičan i potencijalno kancerogen. Radite samo s gumenim rukavicama!