El mercado de la terapia génica tiene potencial para convertirse en el mercado de más rápido crecimiento en el mundo en los próximos 10 años. Las perspectivas que abre la manipulación genética motivan a los representantes de las grandes farmacéuticas no sólo a realizar sus propias investigaciones, sino también a comprar activamente las empresas más prometedoras.
El gigante farmacéutico Novartis, aparentemente, puede marcar el comienzo de la introducción generalizada de la terapia génica en la práctica clínica mundial: FDA productos alimenticios y Medicamentos (Food and Drug Administration, FDA) ha aprobado el uso de terapia génica para pacientes de 3 a 25 años que padecen leucemia linfoblástica aguda.
El tratamiento ayuda a lograr la remisión y, en algunos casos, incluso a vencer la enfermedad. Los medios de comunicación llamaron con razón a este evento la "nueva era de la medicina": la humanidad, con la ayuda de la manipulación genética, está haciendo frente gradualmente a enfermedades que antes eran incurables.
Echemos un vistazo a lo que condujo al inicio de la "nueva era" y veamos hacia dónde se dirige uno de los mercados más prometedores.
Cómo todo empezó
Hace unos 15 años, los científicos lograron "leer" el genoma y finalmente acceder al "código fuente" del cuerpo humano, que almacena todos los datos necesarios sobre él y, lo más importante, controla su vida y su muerte. Fueron necesarios algunos años más para comprender el conocimiento adquirido y comenzar gradualmente a traducirlo en el campo. aplicación práctica: primero en el diagnóstico y luego en la práctica clínica.
Durante los últimos 100 años, la gestión de patógenos varias enfermedades Al igual que los virus y las bacterias, la ciencia ha aprendido bastante bien, gracias a las vacunas y los antibióticos, pero las enfermedades causadas por mutaciones en los genes se consideran desde hace mucho tiempo incurables. Por lo tanto, descifrar más de 3 mil millones de pares de nucleótidos ha abierto perspectivas verdaderamente ilimitadas para el desarrollo de la "medicina del futuro", principalmente la terapia genética preventiva e, idealmente, una medicina completamente personalizada.
Los expertos del mercado predicen un rápido crecimiento en estas áreas: se prevé que el mercado de la terapia génica contra el cáncer alcance los 4.000 millones de dólares en 2024, se prevé que el mercado de la terapia génica en su conjunto alcance los 11.000 millones de dólares en 2025, y las previsiones para toda la medicina personalizada son aún más optimistas: de 149 mil millones de dólares en 2020 a 2,5 billones de dólares en 2022.
Los primeros frutos del desciframiento del genoma humano fueron la mejora en el diagnóstico de enfermedades congénitas o la predisposición a ellas (muchos recordarán el caso del gen BRCA1 de Angelina Jolie). En este contexto, comenzó a desarrollarse rápidamente el mercado de la llamada “genética de consumo”, que en 2020 alcanzará los 12 mil millones de dólares.
Las pruebas genéticas brindan al paciente la oportunidad de realizar un análisis y encontrar "genes malos" en su cuerpo o, por el contrario, alegrarse de su ausencia. Inicialmente bastante placer caro($999–2500) se volvieron cada vez más asequibles a medida que disminuyeron los costos de secuenciación. Por ejemplo, el precio de un estudio completo que ofrece hoy uno de los líderes del mercado mundial, 23andMe, es de 199 dólares. En Rusia, los precios son ligeramente superiores: de 20.000 a 30.000 rublos.
Además, la terapia dirigida se está convirtiendo en una realidad, lo que es especialmente importante no sólo para las enfermedades hereditarias, sino también para las enfermedades cardiovasculares e infecciosas, así como para la oncología, que son las principales causas de muerte en todo el mundo. La manipulación genética permite introducir genes "buenos" en un paciente para compensar los problemas causados por el mal funcionamiento de genes "malos" - por ejemplo, como en el caso de la hemofilia, y en el futuro también podrán "reparar" o eliminar por completo genes dañinos, por ejemplo, los que causan la enfermedad neurodegenerativa de Huntington. Si bien la terapia génica ocupa un lugar muy modesto en el mercado farmacéutico, su participación seguramente crecerá de manera constante.
Por supuesto, todavía quedan muchos problemas por resolver: el alto riesgo de reacciones inmunes, el alto costo de la terapia y, tal vez, incluso las cuestiones éticas asociadas con la realización de cambios en el cuerpo humano a nivel genético. Sin embargo, tales manipulaciones son una oportunidad para los pacientes cuyas enfermedades se consideran incurables o no pueden tratarse eficazmente con los medicamentos existentes, así como una nueva arma en la lucha contra el envejecimiento, que da a la humanidad la esperanza de una longevidad saludable a un nivel completamente diferente, y la mercado - otros nuevos donde hay caminos más prometedores para el desarrollo.
Primeras victorias
Este programa comienza a actuar desde el momento de la pubertad y conduce lenta pero inexorablemente a la muerte. Además, este es un proceso bastante regulado. Cada especie tiene un límite de vida claro que se le asigna. En un ratón, por ejemplo, la media es de 2,5 años, en una persona es de aproximadamente 80 años. Al mismo tiempo, hay otros roedores que viven varias veces o incluso un orden de magnitud más que los ratones, por ejemplo, las ardillas o la famosa rata topo desnuda.
La pregunta principal es si se puede detener el envejecimiento o al menos frenarlo. Quizás una tecnología revolucionaria que invierte el desarrollo celular, descubierta por Shinya Yamanaka, profesor del Instituto de Ciencias Médicas Avanzadas de la Universidad de Kyoto, ayude a responder esta pregunta: descubrió que inducir la coexpresión de cuatro factores de transcripción (Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc, y todos juntos (OSKM, o factores de Yamanaka), que están estrechamente relacionados con las principales etapas del ciclo de vida celular, convierten las células somáticas en pluripotentes. Por este descubrimiento verdaderamente revolucionario, Yamanaka recibió el Premio Nobel en 2012.
Utilizando el avance de Yamanaka, un equipo de científicos del Instituto Salk dirigido por Juan Carlos Izpisua Belmonte intentó aprovechar este mecanismo de reinicio natural. Reloj biológico para prolongar la vida de los animales adultos. Y no me equivoqué. Utilizando factores de Yamanaka, pudieron confirmar la hipótesis sobre la posibilidad de hacer retroceder el "reloj epigenético", es decir, el rejuvenecimiento celular, y aumentar la esperanza de vida promedio de los ratones que envejecen rápidamente entre un 33% y un 50% en comparación con varios grupos de control. .
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Establecer la ubicación y secuencia de un gen cuyas mutaciones causan enfermedades específicas, así como la mutación en sí y métodos modernos sus pruebas permiten diagnosticar la enfermedad en el período neo e incluso prenatal del desarrollo del cuerpo. Esto permite mitigar la manifestación de un defecto genético con la ayuda de tratamiento de drogas, dietas, transfusiones de sangre, etc.
Sin embargo, este enfoque no conduce a la corrección del defecto en sí y, por regla general, las enfermedades hereditarias no se curan. La situación se complica aún más por el hecho de que una mutación en un gen puede tener efectos muy diferentes en el organismo. Si una mutación genética provoca cambios en la actividad de la enzima que codifica, esto puede provocar la acumulación de un sustrato tóxico o, por el contrario, una deficiencia de un compuesto necesario para el funcionamiento normal de las células.
Un ejemplo bien conocido de tal enfermedad es la fenilcetonuria. Es causada por una mutación en el gen de la enzima hepática fenilalanina deshidroxilasa, que cataliza la conversión de fenilalanina en tirosina. Como resultado, aumenta el nivel de fenilalanina endógena en la sangre, lo que provoca una formación inadecuada de la vaina de mielina alrededor de los axones. células nerviosas sistema nervioso central y, como consecuencia, retraso mental severo.
Si una mutación afecta a un gen de una proteína estructural, puede provocar graves trastornos a nivel de células, tejidos u órganos. Un ejemplo de tal enfermedad es la fibrosis quística.
Una deleción en el gen que codifica una proteína llamada transportador de fibrosis quística produce una síntesis defectuosa de proteínas (carece de fenilalanina 508) y un transporte deficiente de iones cloruro a través de las membranas celulares. Uno de los efectos más dañinos de esto es que la mucosidad que recubre y protege los pulmones se vuelve anormalmente espesa. Esto dificulta el acceso a las células pulmonares y promueve la acumulación de microorganismos dañinos. Las células que recubren las vías respiratorias de los pulmones mueren y son reemplazadas por tejido cicatricial fibroso (de ahí el nombre de la enfermedad). Como resultado, el paciente muere por insuficiencia respiratoria.
Las enfermedades hereditarias son complejas. manifestaciones clínicas, y su tratamiento tradicional es principalmente sintomático: para el tratamiento de la fenilcetonuria, se prescribe una dieta sin alanina, las proteínas defectuosas se reemplazan por otras funcionales. administracion intravenosa Para compensar las funciones perdidas, se realiza un trasplante de médula ósea u otro órgano. Todas estas medidas suelen ser ineficaces, costosas, requieren mucho tiempo y sólo unos pocos pacientes llegan a la vejez. Por tanto, el desarrollo de tipos de terapia fundamentalmente nuevos es muy importante.
Terapia de genes
La terapia génica es la ingeniería genética de células somáticas humanas destinada a corregir un defecto genético, causando enfermedad. La corrección de una enfermedad específica se lleva a cabo mediante la introducción de genes expresados normalmente en células somáticas defectuosas. En la década de 1980, cuando se desarrollaron métodos para obtener genes individuales y se crearon vectores de expresión eucariotas, los experimentos de transferencia de genes en ratones se volvieron rutinarios y las perspectivas de corrección genética se hicieron reales.En 1990, en Estados Unidos, el Dr. W. French Andrson hizo el primer intento de terapia génica para tratar la inmunodeficiencia combinada grave (IDCG) en una niña de tres años, Ashanti da Silva. Esta enfermedad es causada por una mutación en el gen que codifica la adenosanadenilasa (ADA). La deficiencia de esta enzima contribuye a la acumulación de adenosina y desoxiadenosina en la sangre. efecto tóxico lo que conduce a la muerte de los linfocitos B y T de la sangre periférica y, como consecuencia, a la inmunodeficiencia.
Los niños con esta enfermedad deben estar protegidos de cualquier infección (mantenerse en cámaras especiales estériles), ya que cualquier enfermedad puede ser fatal. Cuatro años después del inicio del tratamiento, la niña mostró expresión de un funcionamiento normal de ADA y alivio de los síntomas de SCID, lo que le permitió salir de la cámara estéril y vivir una vida normal.
De esta manera se demostró la posibilidad fundamental de una terapia genética exitosa de células somáticas. Desde los años 90. Se están probando varias terapias genéticas Enfermedades genéticas, incluidas enfermedades tan graves como la hemofilia, el SIDA, diferentes tipos neoplasmas malignos, fibrosis quística, etc. En este momento Mediante la transgénesis ya se pueden curar unas diez enfermedades humanas.
La diversidad de enfermedades genéticas ha llevado al desarrollo de muchos enfoques de terapia génica. En este caso, se resuelven 2 problemas principales: un medio para administrar el gen terapéutico; un método para garantizar la entrega dirigida a las células destinadas a la corrección. Hasta la fecha, todos los enfoques de la terapia génica de células somáticas se pueden dividir en dos categorías: terapia ex vivo e in vivo (fig. 3.15).
Arroz. 3.15. Esquema de terapia génica ex vivo (a) e in vivo (a)
La terapia génica ex vivo implica corregir genéticamente las células defectuosas fuera del cuerpo y luego devolver al cuerpo las células que funcionan normalmente.
La terapia génica in vivo implica la administración de un gen terapéutico directamente en las células de un tejido específico del paciente. Veamos estos enfoques con más detalle.
La terapia génica ex vivo incluye los siguientes pasos:
1) obtener células defectuosas del paciente y cultivarlas;
2) transferencia del gen deseado a células aisladas mediante transfección de una construcción genética terapéutica;
3) selección y expansión de células genéticamente corregidas;
4) trasplante o transfusión de estas células al paciente.
El uso de las propias células del paciente garantiza que no desarrollarán una respuesta inmune cuando regresen. El procedimiento para transferir la construcción genética debe ser eficaz y el gen normal debe mantenerse de forma estable y expresarse de forma continua.
Los medios de transferencia de genes creados por la propia naturaleza son los virus. Para obtener vectores eficaces para la administración de genes, se utilizan principalmente dos grupos de virus: adenovirus y retrovirus (fig. 3.16). En la terapia génica se utilizan variantes de virus genéticamente neutralizados.
Arroz. 3.16. Virus utilizados para crear vectores terapéuticos.
Consideremos el diseño y uso de diseños basados en retrovirus. Recordemos que el genoma de un retrovirus está representado por dos moléculas idénticas de ARN monocatenario, cada una de las cuales consta de seis secciones: dos repeticiones terminales largas (LTR) en los extremos 5" y 3", la secuencia no codificante * P+, necesaria para empaquetar el ARN en la partícula viral, y tres regiones que codifican la proteína estructural de la cápside interna (gag), la transcriptasa inversa (pol) y la proteína de la envoltura (env) (fig. 3.17a).
Arroz. 3.17. Mapa genético de un retrovirus típico (a) y mapa de un vector retroviral (a)
Recordemos que el ciclo de vida de un retrovirus incluye las siguientes etapas:
1. Infección de células diana.
2. Síntesis de una copia de ADN del genoma mediante su propia transcriptasa inversa.
3. Transporte de ADN viral al núcleo.
4. Incorporación del ADN viral al cromosoma de la célula huésped.
5. Transcripción de ARNm a partir de ADN viral bajo el control de un fuerte promotor localizado en la región 5"-LTR.
6. Traducción de proteínas Gag, Pol y Env.
7. Formación de la cápside viral y empaquetamiento de dos cadenas de ARN y moléculas de transcriptasa inversa.
8. Liberación de viriones de la célula.
Al obtener un vector retroviral, el ADN de longitud completa del retrovirus se inserta en un plásmido, se eliminan la mayor parte del gen gag y todos los genes pol y env y, en lugar de ellos, un gen T "terapéutico" y, si es necesario. , se inserta un gen marcador selectivo Rg con su propio promotor (Fig. 3.17, b ). La transcripción del gen T será controlada por el mismo promotor fuerte localizado en la región 5"-LTR. Basado en este esquema, se han creado varios vectores retrovirales y un tamaño máximo de inserción de ADN de aproximadamente 8 mil pb.
El constructo así obtenido puede utilizarse por sí mismo para la transformación, pero su eficacia y su posterior integración en el genoma de la célula huésped son extremadamente bajos. Por lo tanto, se desarrolló una técnica para empaquetar el ARN de longitud completa de un vector retroviral en partículas virales intactas, que penetran en la célula con alta frecuencia y se garantiza su integración en el genoma del huésped. Para ello se creó una línea celular llamada "envasadora". En dos secciones diferentes de los cromosomas de estas células, los genes retrovirales gag y pol-env están incrustados, privados de su capacidad de empaquetarse debido a la falta de la secuencia + (84*+) (Fig. 3.18).
Arroz. 3.18. Esquema para la obtención de un vector viral empaquetado.
Es decir, ambos fragmentos se transcriben, pero se forman cápsides vacías sin ARN. Cuando el ARN del vector viral se transfecta en tales células, se integra en el ADN cromosómico y se transcribe para formar ARN retroviral de longitud completa y, en tales condiciones, solo el ARN del vector se empaqueta en cápsides (solo contiene la secuencia +). Las partículas virales intactas resultantes se utilizan para la administración eficaz del vector retroviral a las células diana.
Los retrovirus infectan activamente sólo las células que se dividen rápidamente. Para transferir genes, se tratan con partículas purificadas del vector retroviral empaquetado o se cultivan conjuntamente con la línea celular que los produce y luego se seleccionan para separar las células diana de las células empaquetadoras.
Las células transducidas se controlan cuidadosamente para determinar el nivel de síntesis del producto genético terapéutico, la ausencia de retrovirus competentes para la replicación y la ausencia de cambios en la capacidad de las células para crecer o funcionar.
Las células de la médula ósea son las más adecuadas para la terapia génica. Esto se debe a la presencia de células madre embrionarias totipotentes, que pueden proliferar y diferenciarse en varios tipos de células: linfocitos B y T, macrófagos, eritrocitos, plaquetas y osteoclastos. Son estas células las que se utilizan para tratar una serie de enfermedades hereditarias, incluida la ya mencionada inmunodeficiencia combinada grave, la enfermedad de Gaucher, la anemia falciforme, la talasemia, la osteoporosis, etc.
Además de las células madre totipotentes de la médula ósea, que son difíciles de aislar y cultivar, para tratar la hipercolesterolemia se utilizan células madre de la sangre del cordón umbilical (el uso preferido para la terapia génica en recién nacidos), así como células del hígado (hepatocitos).
En la terapia génica in vivo, es especialmente importante asegurar la entrega del gen terapéutico a las células defectuosas. Esta administración dirigida puede realizarse mediante vectores modificados creados a partir de virus capaces de infectar tipos específicos células. Considere el enfoque desarrollado para el tratamiento de la fibrosis quística ya mencionado anteriormente. Debido a que los pulmones son una cavidad abierta, es relativamente fácil administrarles genes terapéuticos. La versión clonada del gen sano se introdujo en un adenovirus inactivado (fig. 3.19). La especificidad de este tipo de virus es que infecta el revestimiento de los pulmones provocando un resfriado.
Arroz. 3.19. Esquema de obtención de un vector basado en adenovirus.
El virus así construido se probó rociándolo en la nariz y los pulmones de animales de experimentación y luego en pacientes humanos. En algunos casos, se observó la introducción y expresión de un gen sano y la restauración del transporte normal de iones cloruro. Es posible que este enfoque (introducir un gen normal mediante aerosoles nasales) se utilice ampliamente en un futuro próximo para tratar los síntomas de la fibrosis quística en los pulmones.
Además de los retrovirus y los adenovirus, en experimentos de terapia génica también se utilizan otros tipos de virus, como por ejemplo el virus del herpes simple. Una característica especial de este virus de ADN de doble cadena (152 kb) es su capacidad para infectar específicamente neuronas. Hay muchas enfermedades genéticas conocidas que afectan el sistema central y periférico. sistema nervioso- tumores, trastornos metabólicos, enfermedades neurodegenerativas (enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson).
El virus del herpes simple tipo I (VHS) es un vector muy adecuado para el tratamiento de dichas enfermedades. La cápside de este virus se fusiona con la membrana de la neurona y su ADN es transportado al núcleo. Se han propuesto varios métodos para transferir un gen terapéutico utilizando vectores HSV y se han llevado a cabo pruebas exitosas en animales de experimentación.
Los vectores virales tienen varias desventajas: alto costo, capacidad de clonación limitada y posible respuesta inflamatoria. Así, en 1999, como resultado del desarrollo de una respuesta inmune inusualmente fuerte a la introducción de un vector adenoviral, murió un voluntario de 18 años que participaba en ensayos farmacológicos. En 2002, dos niños en Francia desarrollaron una enfermedad similar a la leucemia mientras recibían tratamiento por inmunodeficiencia (mediante la introducción de genes terapéuticos en células madre mediante retrovirus).
Por lo tanto, se están desarrollando sistemas de administración de genes no virales. El más simple y más método efectivo- Esta es la inyección de ADN plásmido en los tejidos. El segundo enfoque consiste en bombardear tejidos con micropartículas de oro (de 1 a 3 micrones) conjugadas con ADN. En este caso, los genes terapéuticos se expresan en los tejidos diana y sus productos (proteínas terapéuticas) ingresan a la sangre. La principal desventaja de este enfoque es la inactivación o destrucción prematura de estas proteínas por los componentes sanguíneos.
El ADN se puede entregar empaquetándolo en una capa de lípidos artificial. Las partículas liposómicas esféricas así obtenidas penetran fácilmente en la membrana celular. Se han creado liposomas con una variedad de propiedades, pero hasta ahora la eficiencia de dicha administración es baja, ya que La mayoría de El ADN sufre destrucción lisosomal. Además, para entregar una construcción genética, se sintetizan conjugados de ADN con varias moléculas que pueden garantizar su seguridad, entrega dirigida y penetración en la célula.
En los últimos años se han llevado a cabo intensos experimentos para crear un cromosoma 47 artificial, que permitiría incluir una gran cantidad de material genético con un conjunto completo de elementos reguladores de uno o más genes terapéuticos. Esto permitiría utilizar una variante genómica de un gen terapéutico y garantizar así su estabilidad y expresión eficaz a largo plazo. Los experimentos han demostrado que la creación de un cromosoma humano artificial que contenga genes terapéuticos es bastante posible, pero aún no está claro cómo introducir una molécula tan grande en el núcleo de una célula diana.
Los principales desafíos a los que se enfrenta la terapia génica, además del riesgo de una reacción inmune grave, son las dificultades almacenamiento a largo plazo y el funcionamiento del ADN terapéutico en el cuerpo del paciente, la naturaleza multigénica de muchas enfermedades, que las convierte en objetivos difíciles para la terapia génica, así como el riesgo de utilizar virus como vectores.
SOBRE EL. Voinov, T.G. Vólova
A lo largo de su relativamente corta historia, la terapia génica ha experimentado altibajos: a veces los científicos y profesionales la vieron casi como una panacea, y luego sobrevino un período de decepción y escepticismo...
Las ideas sobre la posibilidad de introducir genes en el cuerpo con fines terapéuticos se expresaron a principios de los años 60 del siglo pasado, pero los pasos reales no se dieron hasta finales de los 80 y estaban estrechamente relacionados con el proyecto internacional para descifrar el genoma humano.
En 1990, se intentó realizar una terapia génica para la inmunodeficiencia hereditaria grave, a menudo incompatible con la vida, causada por un defecto en el gen que codifica la síntesis de la enzima adenosina desaminasa. Los autores del estudio informaron un claro efecto terapéutico. Y aunque con el tiempo surgieron una serie de dudas sobre la durabilidad del efecto obtenido y sus mecanismos específicos, fue este trabajo el que sirvió como un poderoso impulso para el desarrollo de la terapia génica y atrajo inversiones multimillonarias.
La terapia génica es un enfoque médico basado en la introducción de construcciones genéticas en las células para tratar diversas enfermedades. El efecto deseado se logra como resultado de la expresión del gen introducido o suprimiendo la función del gen defectuoso. Cabe destacar que el objetivo de la terapia génica no es "tratar" los genes como tales, sino tratar diversas enfermedades con su ayuda.
Como regla general, como “fármaco” se utiliza un fragmento de ADN que contiene el gen necesario. Puede ser simplemente "ADN desnudo", generalmente en combinación con lípidos, proteínas, etc. Pero mucho más a menudo, el ADN se introduce como parte de construcciones genéticas especiales (vectores) creadas a partir de una variedad de virus humanos y animales utilizando un número de manipulaciones de ingeniería genética. Por ejemplo, se eliminan del virus los genes necesarios para su reproducción. Esto, por un lado, hace que las partículas virales sean prácticamente seguras y, por otro, “libera espacio” para los genes destinados a introducirse en el cuerpo.
El punto fundamental de la terapia génica es la penetración del constructo genético en la célula (transfección), en la gran mayoría de los casos, en su núcleo. Es importante que la construcción genética llegue exactamente a aquellas células que necesitan ser "tratadas". Por lo tanto, el éxito de la terapia genética depende en gran medida de la elección del método óptimo o al menos satisfactorio para introducir construcciones genéticas en el cuerpo.
Con los vectores virales, la situación es más o menos predecible: se propagan por todo el cuerpo y penetran en las células como sus antepasados, los virus, proporcionando suficiente nivel alto especificidad de órganos y tejidos. Tales construcciones normalmente se administran por vía intravenosa, intraperitoneal, subcutánea o intramuscular.
Se han desarrollado varios vectores no virales para una "entrega dirigida" métodos especiales. El método más simple entrega del gen deseado a las células in vivo: inyección directa de material genético en el tejido. El uso de este método es limitado: las inyecciones sólo se pueden realizar en la piel, el timo, los músculos estriados y algunos tumores sólidos.
Otro método de administración de transgenes es la transfección balística. Se basa en “descascarar” órganos y tejidos con micropartículas de metales pesados (oro, tungsteno) recubiertas con fragmentos de ADN. Para el "bombardeo" utilizan una "pistola genética" especial.
En el tratamiento de enfermedades pulmonares, es posible introducir material genético en Vías aéreas en forma de aerosol.
La transfección celular también se puede realizar ex vivo: las células se aíslan del cuerpo, se manipulan genéticamente y luego se reintroducen en el cuerpo del paciente.
Tratamos: hereditario...
En la etapa inicial de desarrollo de la terapia génica, se consideraba que sus principales objetos eran las enfermedades hereditarias causadas por la ausencia o función insuficiente de un gen, es decir, los monogénicos. Se suponía que la introducción de un gen que funcionaba normalmente en un paciente conduciría a la cura de la enfermedad. Se han hecho repetidos intentos de tratar la "enfermedad real": hemofilia, distrofia muscular de Duchenne y fibrosis quística.
Hoy en día, se están desarrollando y probando métodos de terapia génica para casi 30 enfermedades humanas monogénicas. Mientras tanto, quedan más preguntas que respuestas y en la mayoría de los casos no se ha logrado un efecto terapéutico real. Las razones de esto, en primer lugar, son la reacción inmune del cuerpo, la "atenuación" gradual de las funciones del gen introducido, así como la incapacidad de lograr la integración "dirigida" del gen transferido en el ADN cromosómico.
Menos del 10% de los estudios sobre terapia génica se dedican a enfermedades monogénicas, mientras que el resto se refiere a patologías no hereditarias.
...y adquirido
Las enfermedades adquiridas no están asociadas con un defecto congénito en la estructura y función de los genes. Su terapia genética se basa en el principio de que un "gen terapéutico" introducido en el cuerpo debe conducir a la síntesis de una proteína que tendrá un efecto terapéutico o ayudará a aumentar la sensibilidad individual a los efectos de las drogas.
La terapia génica se puede utilizar para prevenir coágulos sanguíneos, restaurar el sistema vascular del músculo cardíaco después de un infarto de miocardio, prevenir y tratar la aterosclerosis, así como en la lucha contra la infección por VIH y el cáncer. Por ejemplo, se está desarrollando intensamente un método de terapia génica para tumores, como el aumento de la sensibilidad de las células tumorales a los fármacos quimioterapéuticos, y se están realizando ensayos clínicos con la participación de pacientes con mesotelioma pleural, cáncer de ovario y glioblastoma. En 1999, se aprobó un protocolo para el tratamiento del cáncer de próstata, se seleccionaron dosis seguras de quimioterapia y se demostró un efecto terapéutico positivo.
Seguridad y Ética
La realización de manipulaciones genéticas en el cuerpo humano impone requisitos de seguridad especiales: después de todo, cualquier introducción de material genético extraño en las células puede tener consecuencias negativas. La integración incontrolada de genes "nuevos" en determinadas partes del genoma del paciente puede provocar una alteración de la función de los genes "propios", lo que, a su vez, puede provocar cambios indeseables en el organismo, en particular la formación de tumores cancerosos.
Además, pueden producirse cambios genéticos negativos en las células somáticas y germinales. En el primer caso, estamos hablando del destino de una persona, donde el riesgo asociado con la corrección genética es incomparablemente menor que el riesgo de muerte por una enfermedad existente. Cuando se introducen construcciones genéticas en las células germinales, se pueden transmitir cambios indeseables en el genoma a las generaciones futuras. Por lo tanto, parece completamente natural querer prohibir los experimentos sobre modificación genética de células germinales no sólo por razones médicas sino también por razones éticas.
Una serie de problemas morales y éticos están asociados con el desarrollo de enfoques para la intervención genética en las células de un embrión humano en desarrollo, es decir, la terapia génica intrauterina (terapia in utero). En los Estados Unidos, la posibilidad de utilizar la terapia génica en el útero se considera sólo para dos enfermedades genéticas graves: la inmunodeficiencia combinada grave causada por un defecto en el gen de la enzima adenosina desaminasa y la beta talasemia homocigótica (grave). enfermedad hereditaria, asociado con la ausencia de los cuatro genes de globina o mutaciones en ellos. Ya se han desarrollado y se están preparando para pruebas preliminares una serie de construcciones genéticas, cuya introducción en el cuerpo se espera que conduzca a la compensación de defectos genéticos y a la eliminación de los síntomas de estas enfermedades. Sin embargo, el riesgo de consecuencias genéticas negativas de tales manipulaciones es bastante alto. Por tanto, la ética de la terapia génica intrauterina también sigue siendo controvertida.
En enero de este año, los experimentos con terapia génica fueron nuevamente prohibidos temporalmente en Estados Unidos. La razón fue complicaciones peligrosas que surgió en dos niños después de la terapia génica para la inmunodeficiencia hereditaria. Hace unos meses, en Francia, a uno de los niños que se creía curado mediante terapia génica se le diagnosticó un síndrome similar a la leucemia. Los expertos no descartan que el uso de vectores basados en retrovirus durante la terapia pueda ser la causa del desarrollo de complicaciones en los niños. Ahora representantes de la Agencia de Control de Alimentos y medicamentos(FDA) considerará continuar con los experimentos de terapia génica en individualmente, y solo si no existen otros métodos para tratar la enfermedad.
No es una panacea, sino una perspectiva.
No se puede negar que el éxito real de la terapia génica en el tratamiento de pacientes específicos es bastante modesto, y el enfoque en sí aún se encuentra en la etapa de acumulación de datos y desarrollo tecnológico. La terapia génica no se ha convertido ni, obviamente, nunca se convertirá en una panacea. Los sistemas reguladores del cuerpo son tan complejos y tan poco estudiados que la simple introducción de un gen en la mayoría de los casos no produce el efecto terapéutico necesario.
Sin embargo, a pesar de todo esto, difícilmente se puede sobreestimar la promesa de la terapia génica. Hay muchas razones para esperar que los avances en el campo de la genética molecular y las tecnologías de ingeniería genética conduzcan a un éxito indudable en el tratamiento de enfermedades humanas utilizando genes. Y, al final, la terapia génica ocupará con razón su lugar en la medicina práctica.
Parece que la terapia génica puede tener algunas aplicaciones inesperadas. Según los científicos, en 2012 se celebrarán los Juegos Olímpicos, donde actuarán súper atletas transgénicos. El “dopaje de ADN” aportará indudables ventajas
en el desarrollo de fuerza, resistencia y velocidad. No hay duda de que en condiciones de feroz competencia en el deporte habrá atletas que estén listos para la modificación genética, incluso teniendo en cuenta los posibles riesgos asociados con el uso de nuevas tecnologías.
La terapia genética humana, en un sentido amplio, implica la introducción de uno o varios genes funcionalmente activos en las células para corregir un defecto genético. Hay dos formas posibles de tratar las enfermedades hereditarias. En el primer caso, las células somáticas (células distintas de las germinales) se someten a una transformación genética. En este caso, la corrección de un defecto genético se limita a un órgano o tejido específico. En el segundo caso, se cambia el genotipo de las células de la línea germinal (espermatozoides u óvulos) o de los óvulos fecundados (cigotos) para que todas las células del individuo que se desarrolle a partir de ellas tengan los genes “corregidos”. Mediante la terapia génica que utiliza células de la línea germinal, los cambios genéticos se transmiten de generación en generación.
Política de terapia génica con células somáticas.
En 1980, representantes de las comunidades católica, protestante y judía de Estados Unidos escribieron una carta abierta al presidente exponiendo sus puntos de vista sobre el uso de la ingeniería genética en relación con los humanos. Se crearon una Comisión Presidencial y una Comisión del Congreso para evaluar los aspectos éticos y sociales de este problema. Se trataba de iniciativas muy importantes, ya que en los Estados Unidos la promulgación de programas que afectan al interés público se lleva a cabo a menudo sobre la base de las recomendaciones de dichas comisiones. Las conclusiones finales de ambas comisiones establecieron una clara distinción entre la terapia génica de células somáticas y la terapia génica de células germinales. La terapia génica de células somáticas se ha clasificado como un método estándar de intervención médica en el cuerpo, similar al trasplante de órganos. Por el contrario, la terapia génica con células de la línea germinal se ha considerado tecnológicamente demasiado difícil y éticamente demasiado desafiante para implementarla de inmediato. Se concluyó que es necesario desarrollar reglas claras que regulen la investigación en el campo de la terapia génica de células somáticas; el desarrollo de documentos similares en relación con la terapia génica de células germinales se consideró prematuro. Para detener todas las actividades ilegales, se decidió detener todos los experimentos en el campo de la terapia génica de células germinales.
En 1985, habían elaborado un documento titulado "Reglamento para la preparación y presentación de solicitudes para experimentos en el campo de la terapia génica de células somáticas". Contenía toda la información sobre qué datos deben presentarse en una solicitud de permiso para probar la terapia genética con células somáticas en humanos. La base se tomó de las normas que rigen investigación de laboratorio con ADN recombinante; sólo han sido adaptados con fines biomédicos.
La legislación biomédica fue revisada y ampliada en los años 1970. en respuesta a la publicación en 1972 de los resultados de un experimento de 40 años realizado por el Servicio Nacional de Salud de Alabama en un grupo de 400 afroamericanos analfabetos con sífilis. El experimento se realizó con el fin de estudiar el desarrollo natural de esta enfermedad de transmisión sexual, no se realizó ningún tratamiento. La noticia de una experiencia tan horrenda con personas desinformadas conmocionó a muchos en Estados Unidos. El Congreso detuvo inmediatamente el experimento y aprobó una ley que prohibía que se volviera a realizar dicha investigación.
Entre las preguntas dirigidas a las personas que solicitaron permiso para experimentar en el campo de la terapia génica de células somáticas se encontraban las siguientes:
- 1. ¿Cuál es la enfermedad que se supone que debe tratarse?
- 2. ¿Qué tan grave es?
- 3. ¿Existen tratamientos alternativos?
- 4. ¿Qué tan peligroso es el tratamiento propuesto para los pacientes?
- 5. ¿Cuál es la probabilidad de éxito del tratamiento?
- 6. ¿Cómo se seleccionarán los pacientes para los ensayos clínicos?
- 7. ¿Esta selección será imparcial y representativa?
- 8. ¿Cómo se informará a los pacientes sobre las pruebas?
- 9. ¿Qué tipo de información se les debe dar?
- 10. ¿Cómo se obtendrá su consentimiento?
- 11. ¿Cómo se garantizará la confidencialidad de la información sobre los pacientes y la investigación?
Cuando comenzaron los experimentos de terapia génica, la mayoría de las solicitudes de ensayos clínicos fueron revisadas primero por el Comité de Ética de la institución donde se iba a realizar la investigación antes de enviarlas al Subcomité de Terapia Génica Humana. Estos últimos evaluaron las solicitudes desde el punto de vista de su importancia científica y médica, el cumplimiento de las normas vigentes y la persuasión de los argumentos. Si la solicitud era rechazada, se devolvía con los comentarios necesarios. Los autores de la propuesta podrían revisarla y reelaborarla. Si se aprobaba una solicitud, el Subcomité de Terapia Génica la discutía en debates públicos utilizando los mismos criterios. Luego de aprobada la solicitud en este nivel, el director del Subcomité la aprobó y firmó la autorización para los ensayos clínicos, sin los cuales no podrían comenzar. En este último caso, se prestó especial atención al método de obtención del producto, a los métodos de control cualitativo de su pureza y a las pruebas preclínicas que se realizaron para garantizar la seguridad del producto.
Pero a medida que el número de solicitudes aumentó con el tiempo y la terapia génica se convirtió, en palabras de un comentarista, en “el boleto ganador en medicina”, el proceso de aprobación de la solicitud original se consideró innecesariamente lento y redundante. En consecuencia, después de 1997, el Subcomité de Terapia Génica ya no era una de las agencias que supervisaban la investigación en terapia génica humana. Si el Subcomité existe, lo más probable es que proporcione foros para discutir cuestiones éticas relacionadas con la terapia genética humana. Mientras tanto, se ha eliminado el requisito de que todas las solicitudes de terapia génica se discutan públicamente. La agencia responsable de monitorear la producción y el uso de productos biológicos realiza todas las evaluaciones necesarias de manera confidencial para garantizar que se respeten los derechos de propiedad de los desarrolladores. La terapia genética humana actualmente se considera segura procedimiento médico, aunque no particularmente eficaz. Las preocupaciones expresadas anteriormente se han disipado y se ha convertido en uno de los principales nuevos enfoques para el tratamiento de enfermedades humanas.
La mayoría de los expertos consideran que el proceso de aprobación de ensayos de terapia génica con células somáticas humanas en Estados Unidos es bastante adecuado; garantiza la selección imparcial de los pacientes y su conocimiento, así como la realización adecuada de todas las manipulaciones, sin causar daño ni a pacientes específicos ni a la población humana en su conjunto. Otros países también están desarrollando actualmente regulaciones para ensayos de terapia génica. En Estados Unidos esto se hizo sopesando cuidadosamente cada propuesta. Como dijo el Dr. Walters, uno de los participantes en las audiencias del Subcomité de Terapia Génica en enero de 1989: "No conozco ninguna otra ciencia o tecnología biomédica que haya sido sometida a un escrutinio tan extenso como la terapia génica".
Acumulación de genes defectuosos en generaciones futuras.
Existe la opinión de que el tratamiento de enfermedades genéticas mediante terapia génica de células somáticas conducirá inevitablemente a un deterioro del acervo genético de la población humana. Se basa en la idea de que la frecuencia de un gen defectuoso en una población aumentará de generación en generación, ya que la terapia génica promoverá la transmisión de genes mutantes a la siguiente generación de aquellas personas que antes no podían tener descendencia o no podían. sobrevivir hasta la edad adulta. Sin embargo, esta hipótesis resultó ser incorrecta. Según la genética de poblaciones, por un aumento significativo en la frecuencia de un gen dañino o letal como resultado tratamiento efectivo se necesitan miles de años. Por lo tanto, si una enfermedad genética rara ocurre en 1 de cada 100.000 nacidos vivos, pasarán aproximadamente 2.000 años después de la introducción de una terapia génica eficaz antes de que la incidencia de la enfermedad se duplique a 1 de cada 50.000.
Además del hecho de que la frecuencia del gen letal casi no aumenta de generación en generación, como resultado tratamiento a largo plazo todos los que lo necesitan, el genotipo de los individuos individuales tampoco cambia. Este punto puede ilustrarse con un ejemplo de la historia de la evolución. Los primates, incluidos los humanos, no pueden sintetizar sustancias vitales. vitamina importante C, deben obtenerlo de fuentes externas. Por tanto, podemos decir que todos tenemos un defecto genético en el gen de esta sustancia vital. Por el contrario, los anfibios, reptiles, aves y mamíferos no primates sintetizan vitamina C. Sin embargo, el defecto genético que causa la incapacidad de biosintetizar la vitamina C no “impidió” la evolución exitosa de los primates durante más de millones de años. Asimismo, corregir otros defectos genéticos no conducirá a una acumulación significativa de genes “no saludables” en las generaciones futuras.
Terapia génica de células de la línea germinal.
Los experimentos en el campo de la terapia génica de células germinales humanas están ahora estrictamente prohibidos, pero hay que reconocer que algunas enfermedades genéticas sólo pueden curarse de esta manera. La metodología para la terapia génica de células germinales humanas aún no está suficientemente desarrollada. Sin embargo, no hay duda de que con el desarrollo de métodos de manipulación genética en animales y pruebas de diagnóstico Los embriones preimplantados llenarán este vacío. Además, a medida que la terapia génica con células somáticas se vuelva más rutinaria, esto afectará las actitudes de las personas hacia la terapia génica de la línea germinal humana y, con el tiempo, será necesario probarla. Sólo cabe esperar que para entonces se hayan resuelto todos los problemas asociados con las consecuencias del uso práctico de la terapia genética para las células germinales humanas, incluidos los sociales y biológicos.
Se cree que la terapia genética humana ayuda a tratar enfermedades graves. De hecho, puede proporcionar corrección para una serie de trastornos físicos y mentales, aunque aún no está claro si la sociedad encontrará aceptable ese uso de la terapia genética. Como cualquier otra novedad. direccion medica, la terapia génica de células germinales humanas plantea numerosas preguntas, a saber:
- 1. ¿Cuál es el costo de desarrollar e implementar métodos de terapia génica para células germinales humanas?
- 2. ¿Debería el gobierno establecer prioridades en materia de investigación médica?
- 3. ¿El desarrollo prioritario de la terapia génica para las células germinales conducirá a una reducción de los trabajos para encontrar otros métodos de tratamiento?
- 4. ¿Será posible llegar a todos los pacientes que lo necesiten?
- 5. ¿Podrá un particular o una empresa obtener derechos exclusivos para tratar enfermedades específicas mediante terapia génica?
Clonación humana.
El interés público por la posibilidad de la clonación humana surgió en los años 60, después de que se llevaran a cabo los correspondientes experimentos con ranas y sapos. Estos estudios demostraron que el núcleo de un óvulo fertilizado puede reemplazarse con el núcleo de una célula indiferenciada y el embrión se desarrollará normalmente. Así, en principio, es posible aislar núcleos de células indiferenciadas de un organismo, introducirlos en óvulos fertilizados del mismo organismo y producir descendencia con el mismo genotipo que el padre. En otras palabras, cada uno de los organismos descendientes puede considerarse un clon genético del organismo donante original. En los años 1960 Parecía que, a pesar de la falta de capacidades técnicas, no era difícil extrapolar los resultados de la clonación de ranas a los humanos. En la prensa aparecieron muchos artículos sobre este tema e incluso se escribieron obras de ciencia ficción. Una de las historias trataba sobre la clonación del presidente estadounidense John F. Kennedy, asesinado a traición, pero un tema más popular era la clonación de villanos. Los trabajos sobre la clonación humana no sólo eran inverosímiles, sino que también promovían la idea errónea y muy peligrosa de que los rasgos de personalidad, el carácter y otras cualidades de una persona están determinados únicamente por su genotipo. De hecho, una persona como personalidad se forma bajo la influencia tanto de sus genes como de las condiciones ambientales, en particular de las tradiciones culturales. Por ejemplo, el racismo malicioso que predicó Hitler es una cualidad conductual adquirida que no está determinada por ningún gen en particular o su combinación. En otro entorno con características culturales diferentes, el “Hitler clonado” no necesariamente se habría convertido en una persona similar al Hitler real. Del mismo modo, un “clon de la Madre Teresa” no necesariamente “haría” a una mujer que dedicó su vida a ayudar a los pobres y enfermos en Calcuta.
A medida que se desarrollaron los métodos de biología reproductiva de los mamíferos y la creación de diversos animales transgénicos, quedó cada vez más claro que la clonación humana era una cuestión de un futuro no muy lejano. La especulación se hizo realidad en 1997, cuando se clonó una oveja llamada Dolly. Para ello se utilizó el núcleo de una célula diferenciada de una oveja donante. El enfoque metodológico que se utilizó para “crear” Dolly es, en principio, adecuado para obtener clones de cualquier mamífero, incluido el humano. E incluso si no funciona bien en otras especies de mamíferos, probablemente no hará falta demasiada experimentación para desarrollar un método adecuado. Como resultado, la clonación humana se convertirá inmediatamente en tema de cualquier discusión que involucre problemas éticos de genética y medicina biológica.
Sin duda, la clonación humana es un tema complejo y controvertido. Para algunos, la idea misma de crear una copia de un individuo ya existente mediante manipulación experimental parece inaceptable. Otros creen que un individuo clonado es igual a un gemelo idéntico, a pesar de la diferencia de edad, y por lo tanto la clonación no es intrínsecamente maliciosa, aunque quizás no sea del todo necesaria. La clonación puede tener efectos médicos y sociales positivos que justifican su implementación en casos excepcionales. Por ejemplo, puede ser vital para los padres de un niño enfermo. La responsabilidad por los experimentos de clonación humana está regulada por ley en muchos países y toda investigación relacionada con la clonación humana está prohibida. Estas restricciones son suficientes para excluir la posibilidad de la clonación humana. Sin embargo, seguramente surgirá la cuestión de la inevitabilidad de la clonación humana.
La distrofia muscular de Duchenne es una de las enfermedades genéticas raras, pero aún relativamente comunes. La enfermedad se diagnostica entre los tres y los cinco años, generalmente en niños, y al principio se manifiesta solo con movimientos difíciles; a los diez años, una persona que sufre de distrofia muscular ya no puede caminar, y a los 20 años, 22 su vida termina. Es causada por una mutación en el gen de la distrofina, que se encuentra en el cromosoma X. Codifica una proteína que atraviesa la membrana. celula muscular con fibras contráctiles. Funcionalmente, es una especie de resorte que asegura una contracción suave y la integridad de la membrana celular. Las mutaciones en el gen provocan distrofia del tejido del músculo esquelético, el diafragma y el corazón. El tratamiento de la enfermedad es paliativo y sólo puede aliviar ligeramente el sufrimiento. Sin embargo, con el desarrollo de la ingeniería genética, hay luz al final del túnel.
Sobre la guerra y la paz
La terapia génica es la administración de construcciones basadas en ácidos nucleicos en las células para tratar enfermedades genéticas. Con la ayuda de dicha terapia, es posible corregir un problema genético a nivel de ADN y ARN, cambiando el proceso de expresión de la proteína deseada. Por ejemplo, se puede introducir ADN con una secuencia corregida en una célula, con la que se sintetiza una proteína funcional. O, por el contrario, es posible eliminar determinadas secuencias genéticas, lo que también ayudará a reducir los efectos nocivos de la mutación. En teoría, esto es sencillo, pero en la práctica la terapia génica se basa en las tecnologías más complejas para trabajar con objetos microscópicos y representa un conjunto de conocimientos avanzados en el campo de la biología molecular.
La inyección de ADN en el pronúcleo del cigoto es una de las primeras y más tradicionales tecnologías para crear transgenes. La inyección se realiza manualmente utilizando agujas ultrafinas bajo un microscopio con un aumento de 400x.
"El gen de la distrofina, cuyas mutaciones dan lugar a la distrofia muscular de Duchenne, es enorme", afirma Vadim Zhernovkov, director de desarrollo de la empresa de biotecnología Marlin Biotech, candidato a ciencias biológicas. “Incluye 2,5 millones de pares de nucleótidos, que podrían compararse con el número de letras de la novela Guerra y paz”. E imaginemos que hemos arrancado varias páginas importantes de la epopeya. Si estas páginas describen acontecimientos importantes, entonces entender el libro ya sería difícil. Pero con el gen todo es más complicado. No sería difícil encontrar otro ejemplar de Guerra y Paz, y entonces se podrían leer las páginas que faltan. Pero el gen de la distrofina se encuentra en el cromosoma X y en los hombres solo hay uno. Por tanto, sólo una copia del gen se almacena en los cromosomas sexuales de los niños al nacer. No hay dónde conseguir otro.
Finalmente, al sintetizar proteínas a partir de ARN, es importante mantener el marco de lectura. El marco de lectura determina qué grupo de tres nucleótidos se lee como un codón, correspondiente a un aminoácido en una proteína. Si un fragmento de ADN que no es múltiplo de tres nucleótidos se elimina en un gen, el marco de lectura cambia: la codificación cambia. Esto podría compararse con la situación en la que, después de arrancar páginas del resto del libro, todas las letras son reemplazadas por las siguientes en el alfabeto. El resultado será abracadabra. Lo mismo sucede con las proteínas mal sintetizadas”.
Parche biomolecular
Uno de métodos efectivos Terapia génica para restaurar la síntesis normal de proteínas: omisión de exones utilizando secuencias cortas de nucleótidos. Marlin Biotech ya ha desarrollado la tecnología para trabajar con el gen de la distrofina mediante este método. Como es sabido, en el proceso de transcripción (síntesis de ARN) se forma primero el llamado ARN premolde, que contiene tanto regiones codificantes de proteínas (exones) como regiones no codificantes (intrones). A continuación, comienza el proceso de empalme, durante el cual se separan intrones y exones y se forma un ARN "maduro", que consta únicamente de exones. En este momento, algunos exones pueden bloquearse, “sellarse” con la ayuda de moléculas especiales. Como resultado, el ARN maduro no contendrá aquellas regiones codificantes de las que preferiríamos deshacernos y, por tanto, se restablecerá el marco de lectura y se sintetizará la proteína.
"Hemos depurado esta tecnología in vitro", afirma Vadim Zhernovkov, es decir, en cultivos celulares cultivados a partir de células de pacientes con distrofia muscular de Duchenne. Pero las células individuales no son un organismo. Al invadir los procesos celulares, debemos observar las consecuencias en vivo, pero no es posible involucrar a las personas en las pruebas debido a varias razones- de lo ético a lo organizacional. Por lo tanto, era necesario obtener un modelo animal de laboratorio de distrofia muscular de Duchenne con determinadas mutaciones”.
Cómo inyectar un microcosmos
Los animales transgénicos son animales obtenidos en el laboratorio en los que se han realizado cambios deliberada y deliberadamente en su genoma. En los años 70 del siglo pasado, quedó claro que la creación de transgenes es el método más importante Estudios de funciones de genes y proteínas. Uno de los primeros métodos para obtener un organismo completamente modificado genéticamente fue la inyección de ADN en el pronúcleo ("precursor del núcleo") de los cigotos de óvulos fertilizados. Esto es lógico, ya que es más fácil modificar el genoma de un animal al principio de su desarrollo.
El diagrama muestra el proceso CRISPR/Cas9, que involucra un ARN subgenómico (sgRNA), una región del mismo que actúa como ARN guía, y una proteína nucleasa Cas9 que corta ambas hebras de ADN genómico en la ubicación especificada por el ARN guía.
La inyección en el núcleo de un cigoto no es un procedimiento trivial, porque estamos hablando de una microescala. El huevo de ratón tiene un diámetro de 100 micras y el pronúcleo es de 20 micras. La operación se realiza bajo un microscopio con un aumento de 400x, pero la inyección es la más hecho a mano. Por supuesto, para la “inyección” no se utiliza una jeringa tradicional, sino una aguja de vidrio especial con un canal hueco en el interior, en la que se recoge el material genético. Un extremo se puede sostener en la mano y el otro, ultrafino y afilado, es prácticamente invisible a simple vista. Por supuesto, una estructura tan frágil hecha de vidrio de borosilicato no se puede almacenar durante mucho tiempo, por lo que el laboratorio tiene a su disposición un conjunto de piezas en bruto que se extraen en una máquina especial inmediatamente antes del trabajo. Se utiliza un sistema especial de visualización de contraste de la célula sin tinción: la intervención en el pronúcleo es en sí misma traumática y es un factor de riesgo para la supervivencia de la célula. La pintura sería otro de esos factores. Afortunadamente, los óvulos son bastante tenaces, pero el número de cigotos que dan lugar a animales transgénicos es sólo un pequeño porcentaje del total. numero totalóvulos en los que se ha inyectado ADN.
La siguiente etapa es quirúrgica. Se está realizando una operación para trasplantar cigotos microinyectados en el oviducto del ratón receptor, que se convertirá en madre sustituta de futuros transgenes. A continuación, el animal de laboratorio pasa naturalmente por un ciclo de preñez y nace la descendencia. Normalmente, una camada contiene alrededor del 20% de ratones transgénicos, lo que también indica la imperfección del método, ya que contiene un gran elemento de aleatoriedad. Cuando se inyectan, el investigador no puede controlar exactamente cómo se integrarán los fragmentos de ADN introducidos en el genoma del futuro organismo. Existe una alta probabilidad de que se produzcan combinaciones que conduzcan a la muerte del animal en la etapa embrionaria. Sin embargo, el método funciona y es bastante adecuado para numerosos fines científicos.
El desarrollo de tecnologías transgénicas permite producir proteínas animales demandadas por la industria farmacéutica. Estas proteínas se extraen de la leche de cabras y vacas transgénicas. También existen tecnologías para la obtención de proteínas específicas a partir de huevos de gallina.
tijeras de ADN
Pero existe una forma más eficaz basada en la edición específica del genoma utilizando la tecnología CRISPR/Cas9. “Hoy en día, la biología molecular se parece un poco a la época de las expediciones marítimas de larga distancia a vela”, afirma Vadim Zhernovkov. — Casi todos los años se producen descubrimientos importantes en esta ciencia que pueden cambiar nuestras vidas. Por ejemplo, hace varios años los microbiólogos descubrieron que una especie de bacteria que había sido estudiada durante mucho tiempo era inmune a infecciones virales. Como resultado más investigación Resultó que el ADN bacteriano contiene loci especiales (CRISPR), a partir de los cuales se sintetizan fragmentos de ARN que pueden unirse de forma complementaria a los ácidos nucleicos de elementos extraños, por ejemplo, virus de ADN o ARN. La proteína Cas9, que es una enzima nucleasa, se une a dicho ARN. El ARN sirve como guía para Cas9, marcando una sección específica de ADN donde la nucleasa hace un corte. Hace entre tres y cinco años aparecieron los primeros artículos científicos en los que se desarrollaba la tecnología CRISPR/Cas9 para la edición del genoma”.
Los ratones transgénicos permiten la creación de modelos vivos de enfermedades genéticas humanas graves. La gente debería estar agradecida con estas pequeñas criaturas.
En comparación con el método de introducción de una construcción para inserción aleatoria, el nuevo método permite seleccionar elementos del sistema CRISPR/Cas9 de tal manera que dirija con precisión las guías de ARN a las regiones deseadas del genoma y logre la eliminación o inserción dirigida de la secuencia de ADN deseada. Este método también está sujeto a errores (el ARN guía a veces se une al sitio equivocado al que se dirige), pero cuando se utiliza CRISPR/Cas9, la eficiencia de la creación de transgenes ya es de alrededor del 80%. "Este método tiene amplias perspectivas no sólo en la creación de transgenes, sino también en otros ámbitos, en particular en la terapia génica", afirma Vadim Zhernovkov. “Sin embargo, la tecnología está sólo en el comienzo de su viaje, y es bastante difícil imaginar que en un futuro próximo el código genético de las personas se corrija utilizando CRISPR/Cas9. Si bien existe la posibilidad de error, también existe el peligro de que una persona pierda alguna parte codificante importante del genoma”.
Medicina de leche
La empresa rusa Marlin Biotech ha logrado crear un ratón transgénico en el que se reproduce completamente la mutación que provoca la distrofia muscular de Duchenne, y la siguiente etapa será probar tecnologías de terapia génica. Sin embargo, la creación de modelos de enfermedades genéticas humanas basados en animales de laboratorio no es el único uso posible de los transgenes. Así, en Rusia y en los laboratorios occidentales se está trabajando en el campo de la biotecnología, lo que permitirá obtener proteínas medicinales de origen animal importantes para la industria farmacéutica. Las vacas o las cabras pueden actuar como productoras, en las que se puede modificar el aparato celular para producir proteínas contenidas en la leche. Es posible extraer proteínas medicinales de la leche, que no se obtienen. químicamente, pero con la ayuda de un mecanismo natural que aumentará la eficacia del medicamento. Actualmente se han desarrollado tecnologías para la producción de proteínas medicinales como la lactoferrina humana, prouroquinasa, lisozima, atrina, antitrombina y otras.
