rusko ime
Tripsin + kimotripsinLatinsko ime snovi Trypsin + Chymotrypsin
Tripsin + himotripsin ( rod. tripsin + kimotripsin)Farmakološka skupina snovi Tripsin + Kimotripsin
Tipični klinični in farmakološki članek 1
Farmacevtsko delovanje. Proteolitično kombinirano sredstvo beljakovinske narave. Pridobljeno iz trebušne slinavke velikega govedo. Pri lokalni in zunanji uporabi razgrajuje nekrotično tkivo in fibrinozne tvorbe; redči viskozne izločke, eksudat, krvne strdke. Hidrolizira beljakovine in peptone s tvorbo peptidov z nizko molekulsko maso, razgrajuje vezi, ki jih tvorijo ostanki aromatskih aminokislin (tirozin, troptofan, fenilalanin, metionin).
Indikacije. Gnojne bronhopulmonalne bolezni (bronhiektazije, pljučni absces, atelektaza, eksudativni plevritis). Bolezni ENT organov: gnojni sinusitis, gnojni otitis (akutni, subakutni, kronični), evstaheitis z viskoznim eksudatom, po traheostomiji za lažje odstranjevanje gostega viskoznega eksudata, kronični rinitis. Opekline, preležanine, trofični ulkusi, gnojne rane. V oftalmologiji: bolezni roženice (ulkus, herpetični keratitis); opekline očesne sluznice, obstrukcija solznih kanalov, počasno celjenje ran na koži vek.
Kontraindikacije. preobčutljivost, maligne neoplazme, destruktivne oblike pljučna tuberkuloza, stopnja II-III CHF, pljučni emfizem s odpoved dihanja. Ne injicirajte v krvaveče votline in ne nanašajte na razjedene površine malignih tumorjev.
Previdno. Plevralni empiem tuberkulozne etiologije (resorpcija eksudata lahko prispeva k razvoju bronhoplevralne fistule).
Odmerjanje. Lokalno, navzven.
Za zdravljenje gnojne rane in preležanine, sterilne prtičke, navlažene z raztopino: 25-50 mg zdravila v 10-50 ml 0,25% raztopine prokaina, ki se uporablja za obdobje od 2 do 24 ur (odvisno od debeline gnojno-nekrotičnih mas) na površino rane. Obloge se menjajo vsakih 3-5 dni.
pri termične opekline III čl. tanek sloj zdravila se nanese na krasto s hitrostjo 1 g na 100 kvadratnih cm površine rane, pokrito s povojem, navlaženim z 0,9% raztopino NaCl ali 0,25% raztopino prokaina; nanesite vodoodporen povoj. Oblogo menjamo vsak drugi dan. Pri vsaki menjavi obloge odstranimo zlahka odstranljiva področja nekrotičnega tkiva. Pri ranah, pokritih z debelo krasto, jo pred povojem odrežemo.
Za gnojno bronhopulmonalne bolezni uporabite inhalacijo 25-30 mg zdravila, razredčenega v 5 ml destilirane vode, 1-3 krat na dan. Raztopino lahko dajemo tudi skozi bronhoskop, endotrahealni tubus ali traheostomo. Raztopini lahko dodamo antibiotike, bronhodilatatorje.
Za zdravljenje razjed, opeklin roženice in keratitisa ga uporabljamo v obliki očesnih kopeli v raztopini 1:500 dnevno, 2-3 dni, ali pa vkapamo 2 kapljici 0,25% raztopine, 4-krat na dan. , za 1-2 dni. Obstrukcija solznih kanalov in rane kože vek: izperite solzne kanale ali izperite rane z 1% raztopino. Rešitve so pripravljene ex tempore.
pri kronični rinitis vkapavanje ali izpiranje nosne votline z raztopino (5 mg v 5 ml 0,9% raztopine NaCl) 2-3 krat na dan.
Za kronično gnojni otitis zapleten s holesteatomom, po izpiranju votline z 0,9% raztopino NaCl vkapajte 0,5% raztopino zdravila (razredčeno z 0,9%) raztopina NaCl), 2-3 krat na dan po 20-30 minut.
Stranski učinek. Alergijske reakcije, povišana telesna temperatura do subfebrile, tahikardija.
Po vdihavanju: draženje sluznice zgornjega dela dihalni trakt, hripavost glasu.
V oftalmologiji: draženje in otekanje veznice (v tem primeru je priporočljivo zmanjšati koncentracijo uporabljene raztopine).
Posebna navodila. V naslednjih nekaj urah po inhalaciji mora bolnik previdno izkašljati izpljunek ali ga odstraniti s sesanjem.
om sodeluje pri proteolizi prehranskih beljakovin v Tanko črevo Kimotripsin prednostno cepi vezi, ki jih tvorijo COOH skupine aminokislin s hidrofobnimi stranskimi verigami, in je zanj značilna širša specifičnost delovanja kot. Za razliko od tripsina X. sesiri mleko.
Kimotripsin proizvajajo eksokrine celice trebušne slinavke (Pancreas) v obliki neaktivnega proencima - kimotripsinogena, ki se izloča v dvanajstniku, kjer pod vplivom tripsina preide v kimotripsin. Pri ljudeh in večini sesalcev najdemo dve vrsti kimotripsinogena - A in B, ki se razlikujeta po fizikalne in kemijske lastnosti. Pri aktivaciji kimotripsinogena A nastane več aktivnih oblik kimotripsina, ki se razlikujejo po topnosti, kristalni obliki in velikosti encimske aktivnosti. Glavna oblika kimotripsina je kimotripsin A – protein z molekulsko maso okoli 25 000. Najbolj stabilen je v rahlo kislem okolju; v nevtralnem in rahlo alkalnem okolju je podvržen avtolizi. Optimalno delovanje kroma je pri pH 7,5-8,2.
Za določitev aktivnosti kemikalij so bile predlagane številne metode, ki temeljijo na razgradnji beljakovin in sintetičnih substratov. Spektrofotometrično nadzorovani estri M-substituiranega tirozina se pogosto uporabljajo.
Dejavnost X. zavirajo številni sintetični in naravni inhibitorji. Proteinski inhibitorji kroma so prisotni v krvni plazmi in tkivih ter ščitijo pred uničenjem s tem encimom. Mnogi od njih so polivalentni in zavirajo tudi druge proteaze (na primer α 2 -makroglobulin, nekateri inhibitorji tripsina); α 1-antihimotripsin je specifičen zaviralec Ch v krvni plazmi.
Kimotripsin se uporablja kot zdravilo, sposoben selektivno razgraditi beljakovine nekrotičnih tkiv, fibroznih tvorb, utekočiniti viskozne eksudate, gnojne mase. Ima protivnetni, anti-edematozni učinek in pospešuje celjenje ran. Zdravila Kemotripsinogen A pridobivamo iz kimotripsinogena A, ki ga izoliramo iz trebušne slinavke goveda in ga po rekristalizaciji aktiviramo s tripsinom. IN zdravniška praksa uporabite kimotripsin A, proizveden pod imenom "kristalni kimotripsin". to bela, zelo topen v vodi in izotonični raztopini natrijevega klorida.
Indikacije za uporabo, načini uporabe, odmerki in možnih zapletov enako kot za kristalni tripsin. Poleg tega se X. uporablja za intrakapsularno ekstrakcijo katarakte. Skupaj s tripsinom je X. del kimopsina, pankreatina in nekaterih drugih zdravil, ki se uporabljajo za insuficienco trebušne slinavke.
Oblika sproščanja: hermetično zaprte steklenice ali ampule, ki vsebujejo 0,005 G (5 mg) in 0,01 G (10 mg) kristalni kimotripsin. Shranjujte na mestu, zaščitenem pred svetlobo, pri temperaturi, ki ne presega +10 °.
II kimotripsinencim trebušne slinavke, ki spada v razred hidrolaz (EC 3.4.21.1), katalizira hidrolitično razgradnjo beljakovin, peptidov, amidov in estrov aminokislin med prebavo hrane v črevesju.
1. Mala medicinska enciklopedija. - M.: Medicinska enciklopedija. 1991-96 2. Prvič skrb za zdravje. - M.: Velika ruska enciklopedija. 1994 3. enciklopedični slovar medicinski izrazi. - M.: Sovjetska enciklopedija. - 1982-1984.
Sopomenke:Oglejte si, kaj je "kimotripsin" v drugih slovarjih:
kimotripsin... Pravopisni slovar-priročnik
KIMOTRIPSIN, snov, ki nastaja v telesu in pomaga pri prebavi hrane. Kimotripsin je encim, ki razgrajuje beljakovine. Proizvaja se v tankem črevesu prek kompleksa kemične reakcije iz kimotripsinogena... Znanstveni in tehnični enciklopedični slovar
Prebavni encim pankreasnega soka; sodeluje pri razgradnji beljakovin v črevesju. Proizvaja se kot neaktiven kimotripsinogen... Veliki enciklopedični slovar
Proteolitični encim večine vretenčarjev, ki skupaj s tripsinom in drugimi peptidazami sodeluje pri razgradnji beljakovin v Tanko črevo; sintetizirajo celice trebušne slinavke v obliki neaktivnega prekurzorja kimotripsinogena in... ... Biološki enciklopedični slovar
Samostalnik, število sinonimov: 1 encim (253) Slovar sinonimov ASIS. V.N. Trishin. 2013… Slovar sinonimov
kimotripsin- Proteolitični encim vretenčarjev, sintetiziran v trebušni slinavki v obliki prekurzorja kimotripsinogena. [Arefjev V.A., Lisovenko L.A. angleščina ruščina Slovar genetski izrazi 1995 407 str.] Teme genetika EN kimotripsin ... Priročnik za tehnične prevajalce
Prebavni encim pankreasnega soka; sodeluje pri razgradnji beljakovin v črevesju. Proizvaja se kot neaktiven kimotripsinogen. * * * KIMOTRIPSIN KIMOTRIPSIN, prebavni encim trebušnega soka; sodeluje pri…… enciklopedični slovar
- (gr.chymoscok + tripsin) encim, ki razgrajuje beljakovine hrane; ki ga proizvajajo celice trebušne slinavke. Nov slovar tuje besede. avtor EdwART, 2009. chymotrypsin a, pl. Ne m. (… Slovar tujih besed ruskega jezika
Kimotripsin kimotripsin [EC 3.4.21.1 2]. Proteolitični encim vretenčarjev, sintetiziran v trebušni slinavki v obliki prekurzorja kimotripsinogena. (
kimotripsin- proteolitični encim; katalizira razgradnjo beljakovin in peptidov. Nanaša se na peptidne hidrolaze. Skupaj z tripsin sodeluje pri proteolizi prehranskih beljakovin v tankem črevesu. Kimotripsin prednostno cepi vezi, ki jih tvorijo COOH skupine aminokislin s hidrofobnimi stranskimi verigami, in je značilna širša specifičnost delovanja kot tripsin. Za razliko od tripsina X. sesiri mleko.
Kimotripsin proizvajajo eksokrine celice trebušna slinavka v obliki neaktivnega proencima - kimotripsinogena, ki se izloča v dvanajstnik, kjer se pod vplivom tripsina pretvori v kimotripsin. Pri ljudeh in večini sesalcev najdemo dve vrsti kimotripsinogena - A in B, ki se razlikujeta po fizikalno-kemijskih lastnostih. Pri aktivaciji kimotripsinogena A nastane več aktivnih oblik kimotripsina, ki se razlikujejo po topnosti, kristalni obliki in velikosti encimske aktivnosti. Glavna oblika kimotripsina je kimotripsin A – protein z molekulsko maso okoli 25 000. Encim je najbolj stabilen v rahlo kislem okolju; v nevtralnem in rahlo alkalnem okolju je podvržen avtolizi. Optimalno delovanje kroma je pri pH 7,5-8,2.
Za določitev aktivnosti kroma so bile predlagane številne metode,
temelji na razgradnji beljakovin in sintetičnih substratov. Spektrofotometrično nadzorovana hidroliza M-substituiranih tirozinskih estrov se pogosto uporablja.Dejavnost X. zavirajo številni sintetični in naravni inhibitorji. Proteinski inhibitorji kroma so prisotni v krvni plazmi in tkivih ter ščitijo beljakovine pred uničenjem s tem encimom. Mnogi od njih so polivalentni in zavirajo tudi aktivnost drugih proteaz (na primer 2-makroglobulin, nekateri inhibitorji tripsina); specifičen zaviralec Ch v krvni plazmi je 1-antihimotripsin.
Kimotripsin se uporablja kot zdravilo, ki lahko selektivno razgradi beljakovine nekrotičnih tkiv in formacij ter razredči viskozne eksudate in gnojne mase. Ima protivnetni, anti-edematozni učinek in pospešuje celjenje ran. Kromove zdravilne pripravke pridobivamo iz kimotripsinogena A, ki ga izoliramo iz trebušne slinavke goveda in ga po rekristalizaciji aktiviramo s tripsinom. V medicinski praksi se uporablja kimotripsin A, proizveden pod imenom "kristalni kimotripsin". Je bel prah, dobro topen v vodi in izotonični raztopini natrijevega klorida.
Indikacije za uporabo,
Načini uporabe, odmerki, kontraindikacije in možni zapleti so enaki kot pri kristalnem tripsinu. Poleg tega se X. uporablja za intrakapsularno ekstrakcijo katarakte. Skupaj s tripsinom je X. del kimopsina, pankreatina in nekaterih drugih zdravil, ki se uporabljajo za insuficienco trebušne slinavke.Oblika sproščanja: hermetično zaprte steklenice ali ampule, ki vsebujejo 0,005 G (5 mg) in 0,01 G (10 mg) kristalni kimotripsin. Shranjujte na mestu, zaščitenem pred svetlobo, pri temperaturi, ki ne presega +10 °.
Encim kimotripsin
kimotripsin
Farmakološki učinek:
Pri lokalni uporabi razgrajuje nekrotično (odmrlo) tkivo in fibrinozne tvorbe (krvne strdke); redči viskozne izločke (izločanje posebnih žlez, na primer sputum), eksudate (z beljakovinami bogato tekočino, izločeno iz majhnih žil tkiva), krvne strdke. spojina:
kimotripsin je proteolitični encim, ki nastaja v trebušni slinavki sesalcev. Za medicinsko uporabo pridobivajo ga iz trebušne slinavke goveda. Pankreatični sok vsebuje neaktivno stanje v obliki kimotripsinogena (kimotripsinogena A in B), ki se pod vplivom tripsina aktivira, iz kimotripsinogena A pa nastanejo številne oblike: a, b, g, s in p - kimotripsini, in iz kimotripsinogena B - kimotripsin B. Vse oblike kimotripsina so si podobne po encimskih lastnostih, razlikujejo pa se po aktivnosti. A-kimotripsin, ki se trži pod imenom "kristalni kimotripsin", je trenutno praktičnega pomena kot zdravilo.a- kimotripsin je protein z relativno molekulsko maso 21600 - 27000. Spada v skupino proteolitičnih encimov. Tako kot tripsin hidrolizira beljakovine in peptone, da tvori peptide z relativno nizko molekulsko maso. Od tripsina se razlikuje po tem, da primarno cepi vezi, ki jih tvorijo ostanki aromatskih aminokislin (tirozin, triptofan, fenilalanin, metionin). V nekaterih primerih kimotripsin povzroči globljo hidrolizo beljakovin kot tripsin. Od tripsina se razlikuje tudi po tem, da povzroča strjevanje mleka. Bolj stabilen kot tripsin in se počasneje inaktivira.
kimotripsin kristalni so sijoči kosmiči ali bel prah. Topen v vodi in izotonični raztopini natrijevega klorida; pH 0,2% vodne raztopine 4,5 - 6,5. V suhi obliki stojala; vodne raztopine se hitro inaktivirajo, zlasti pri visokih temperaturah.
Indikacije za uporabo:
Tromboflebitis (vnetje venske stene z blokado), vnetno-distrofične oblike parodontalne bolezni (zobne bolezni), osteomielitis (vnetje kostnega mozga in sosednjih kostno tkivo), sinusitis (vnetje maksilarnega sinusa), otitis (vnetje ušesne votline), iritis (vnetje šarenice), iridociklitis (očesna bolezen); traheitis (vnetje sapnika), bronhitis (vnetje bronhijev), ekstrakcija sive mrene (odstranitev zamegljene očesne leče).Način uporabe:
Intramuskularno za odrasle, 0,0025 g 1-krat na dan. Za injiciranje tik pred uporabo raztopite 0,005 g kristalnega kimotripsina v 1-2 ml izotonična raztopina natrijev klorid ali 0,5-2% raztopina novokaina. Raztopino injiciramo globoko v zgornji zunanji kvadrant glutealne mišice. Tečaj - 6-15 injekcij.Stranski učinki:
Alergijske reakcije, pekoč občutek na mestu uporabe. Krvavitev iz območij granuliranja (celjenja). Pri vnosu v votline se lahko sprostijo snovi s histaminom podobnim učinkom.Kontraindikacije:
Krvaveče rane in propadanje maligni tumorji. Individualna nestrpnost. Zdravilo ni primerno za intravensko dajanje.Oblika izdaje:
Prašek v hermetično zaprtih steklenicah po 0,005 g in 0,01 g.Pozor!
Pred uporabo zdravila Chymotrypsin se morate posvetovati z zdravnikom. Ta navodila za uporabo so na voljo v brezplačnem prevodu in so zgolj informativne narave. Za popolnejše informacije si oglejte navodila proizvajalca.
Serinske proteinaze.
Mehanizem delovanja kimotripsina in karboksipeptidaze.
Prej smo omenili, da je trebušna slinavka odgovorna za proizvodnjo celotne skupine proteolitičnih encimov, ki hidrolizirajo peptidne vezi, ki jih tvorijo različne aminokisline. Encimi, ki sodelujejo pri prebavi beljakovin, in njihova specifičnost za peptidne vezi, ki jih tvorijo različne aminokisline, so podani v tabeli. 3.1. Najpomembnejši in v celoti raziskan predstavnik črevesnih proteinaz, ki pripada družini serinske proteinaze, je kimotripsin. Kimotripsin je prebavni encim, ki ga kot zimogen sintetizirajo acinarne celice trebušne slinavke.
Tabela 3.1
Substratna specifičnost gastrointestinalnih proteinaz
Aktivni encim |
Zimogen |
Aktivator |
cepljiv |
|
peptidna vez |
||||
karboksiproteinaze |
Samodejna aktivacija, |
|||
Pepsin A |
Pepsinogen A |
aktivni pepsin |
||
Serin |
||||
proteinaze |
||||
tripsin |
Tripsinogen |
enterokinaza, |
||
tripsin |
||||
kimotripsin |
kimotripsinogen |
tripsin |
Tyr, Phe, Trp, Met |
|
Elastaza |
Proelastaza |
tripsin |
||
peptidaze |
||||
Karboksipeptidaza A |
prokarboksipeptid- |
Val, Leu, Ile, Ala z |
||
karboksipeptidaza B |
prokarboksipeptid- |
|||
aminopeptidaza |
proaminopepti- |
Odprava N- |
||
konec |
||||
stanja (za |
||||
razen Pro) |
||||
Znotraj acinarnih celic se na novo sintetizirane proteinske molekule transportirajo iz endoplazemskega retikuluma v Golgijev aparat, kjer so obdane s proteinsko-lipidno membrano – tako nastanejo zimogena zrnca, ki so v elektronskem mikroskopu videti kot zelo gosta telesa (slika 3.3).
riž. 3.3 Elektronski mikrograf zrnc zimogena v acinarnih celicah trebušne slinavke (po risbi G. Palade iz Strayer L., Biochemistry
"Mir", M., letnik 2, 1985).
Granule zimogena, ki vsebujejo kimotripsinogen, se kopičijo na konici acinarnih celic in se nato pod vplivom hormonskega ali nevronskega signala sprostijo v kanal, ki vodi do dvanajstnika.
Kimotripsinogen je predstavljen z eno polipeptidno verigo 245 aminokislin. Veriga je stabilizirana s petimi disulfidnimi mostovi. Aktivacija kimotripsinogena poteka pod delovanjem tripsina, ki cepi peptidno vez med argininom-15 in izolevcinom-16.
Pri tem nastali aktivni π-kimotripsin deluje na druge molekule kimotripsinogena (slika 3.4).
riž. 3.4 Shema, ki prikazuje zaporedje stopenj aktivacije kimotripsina
Nato je π-kimotripsin podvržen dodatnemu proteolitičnemu delovanju kimotripsina s cepitvijo dveh dipeptidov Ser14-Arg15 in Thr147-Asn148 ter tvorbo stabilne oblike encima - α-kimotripsina.
Ker je kimotripsin eden najbolj raziskanih encimov, je priporočljivo podrobneje razmisliti o njegovi strukturi in mehanizmu delovanja. Molekula α-kimotripsina je sestavljena iz treh polipeptidnih verig, povezanih z dvema medverižnima disulfidnima vezema (slika 3.5).
riž. 3.5 Molekula α-kimotripsina ima dva medverižna disulfidna mostova in tri znotrajverižne disulfidne vezi.
Molekulska masa α-kimotripsina je približno 25.000 Da. Molekula ima kompaktno elipsoidno obliko, ki meri 51 × 40 × 40 Å. Vse nabite skupine, razen treh, potrebnih za katalizo, so na površini molekule.
Ravnotežje reakcije hidrolize se skoraj popolnoma premakne v smeri cepitve peptidnih vezi. Vendar pa kimotripsin ne more hidrolizirati vsake peptidne vezi z visoko hitrostjo. Na nastale povezave deluje selektivno karboksilne skupine aromatskih kislin in aminokislin s hidrofobnimi radikali velika številka, na primer metionin.
Značilna lastnost kimotripsina je njegova sposobnost hidrolizacije estrske vezi. V bistvu je bilo veliko informacij o mehanizmu delovanja kimotripsina pridobljenih s proučevanjem hidrolize
estri.
Dokazano je, da kimotripsin katalizira hidrolizo peptidnih in estrskih vezi v dveh različnih korakih. To je bilo prvič odkrito pri proučevanju kinetike hidrolize estrske vezi n-nitrofenilacetata.
Analiza reakcije je pokazala, da sproščanje enega od produktov, n-nitrofenola, med hidrolizo poteka v dveh stopnjah: najprej se eksplozivno sprosti n-nitrofenol, nato pa nastane z
manjša stacionarna hitrost.
IN splošni oris proces hidrolize n-nitrofenilacetata se reducira na nastanek encimsko-substratnega kompleksa, nato se estrska vez v substratu razcepi in sprosti n-nitrofenol, acetilna skupina substrata pa ostane kovalentno vezana v aktivnem centru encima. Nato voda napade acetil-encimski kompleks, da tvori acetatni ion in regeneriran encim (slika 3.6).
riž. 3.6 Acilacija: tvorba acetil-encimskega kompleksa kot intermediata. Deacilacija: hidroliza intermediata acetil-encimskega kompleksa.
Hitra začetna faza sproščanja n-nitrofenola je povezana s tvorbo acil-encimskega kompleksa, prikazanega na sl. 3.6 ikona
(*). Ta korak se imenuje acilacija. Druga stopnja, imenovana deacilacija, ustreza stacionarni stopnji reakcije, ki je tudi omejujoča. Izkazalo se je, da je acil-encimski kompleks tako stabilen, da ga je pod določenimi pogoji mogoče izolirati. Po izolaciji pri pH 3 čista oblika tega vmesnega acil-encimskega kompleksa je bilo mogoče karakterizirati mesto, na katerem je acilna skupina dodana encimu. Izkazalo se je, da je acilna skupina povezana z atomom kisika določenega serinskega ostanka
– serin-195 (Ser-195). Zaradi tega razloga je kimotripsin razvrščen kot serinske proteinaze. Ta serinski ostanek kaže nenavadno visoko reaktivnost. Lahko se posebej označi
organski fluorofosfat – diizopropil fluorofosfat (slika 3.7).
riž. 3.7 Diizopropilfosfat (DPPP) inaktivira kimotripsin s tvorbo diizopropilfosforilnega derivata serina-195.
Povečano reaktivnost serina-195 dokazuje dejstvo, da preostalih 27 serinskih ostankov v kimotripsinu sploh ne reagira z diizopropil fluorofosfatom (DPFP). Mimogrede, kimotripsin ni edini encim, ki ga zavira DPPP. Mnogi drugi proteolitični encimi, kot npr tripsin, elastaza,
trombin, bakterijski subtilizin prav tako specifično reagirajo z DPPP in popolnoma izgubijo aktivnost. Tako kot v primeru kimotripsina te proteinaze medsebojno delujejo z DPPP prek enega serinskega ostanka. Tako je primerno govoriti o obstoju cele družine serinske proteinaze.
Vendar pa pri katalitskih dejanjih kimotripsina ne sodeluje le stranski radikal Ser-195. Pokazalo se je, da ima tudi histidinski ostanek His-57 pomembno vlogo v aktivnem mestu encima. Njegovo sodelovanje pri katalizi je bilo mogoče dokazati s tako imenovano afinitetno oznako, ki se na eni strani kot substrat veže na kimotripsin, na drugi strani pa tvori kovalentno vez z določeno skupino v aktivnem centru.
Takšna oznaka za kimotripsin je spojina tosil-L- fenilalanin klorometil keton, katere struktura je prikazana na sl. 3.8.
riž. 3.8 Struktura tozil-L-fenilalanin klorometil ketona, ki se uporablja kot afinitetna oznaka za kimotripsin (R – tozilna skupina).
Prisotnost oznake stranske verige, ki jo predstavlja fenilalanin v molekuli, zagotavlja njegovo specifično interakcijo z encimom. Reaktivna skupina oznake, klorometil keton, sodeluje samo z ostankom His-57 in alkilira enega od dušikovih atomov histidinskega obroča. Interakcija takšne afinitetne oznake s kimotripsinom popolnoma odvzame encimsko aktivnost. Obstaja več dokazov za visoko specifičnost interakcije oznake s kimotripsinom:
− prvič, afinitetna oznaka je zelo stereospecifična. D-izomer oznake ne deluje s kimotripsinom;
− drugič, konkurenčni inhibitor kemtripsina, β-fenilpropionat, zavira proces interakcije oznake z beljakovino;
- tretjič, hitrost inaktivacije kimotripsina po dodatku oznake je v enaki odvisnosti od pH kot hitrost katalize.
Shema interakcije tosil-L-fenilalanin klorometil ketona z His-57 je prikazana na sl. 3.9.
riž. 3.9 Alkilacija histidina-57 v kimotripsinu pri interakciji s tozil-L-fenilalanin klorometil ketonom.
Tako je za manifestacijo katalitične aktivnosti kimotripsina bistvena prisotnost ostankov Ser-195 in His-57 v aktivnem središču encima. Kot je bilo kasneje prikazano, poleg teh ostankov v molekuli kimotripsina obstaja tudi ostanek asparaginske kisline - Asp-102. Rentgenska difrakcijska analiza je pokazala, da se vsi trije ostanki nahajajo drug poleg drugega in ustvarjajo t.i. sistem prenosa obremenitev zaradi dejstva, da Asp-102 tvori vodikovo vez s His-57, ta pa je vodikova vez s Ser195 (slika 3.10).
riž. 3.10 Sistem prenosa naboja v aktivnem mestu kimotripsina v odsotnosti substrata (Blow D.M., Steitz T.A., Študije rentgenske difrakcije encimov, Ann. Rev. Biochem., 1976, 39, 86-95).
Karboksilatni ion Asp-102 polarizira imidazolno skupino His-57, kar poveča njeno sposobnost izvajanja vezave protonskega shuttlea, in ko substrat interagira z molekulo kimotripsina, Asp-102 in His-57 sprejmeta proton hidroksilne skupine Ser-195.
riž. 3.11 Sistem prenosa naboja v aktivnem centru kimotripsina v prisotnosti substrata. Ko je dodan substrat, pride do vmesne vezave protona z aspartatom-102 in histidinom-57 (Blow D.M., Steitz T.A., Študije rentgenske difrakcije encimov, Ann. Rev. Biochem., 1976, 39, 86-95).
Lokalizacija specifičnih substratnih vezavnih mest in verjetna orientacija hidrolizirane peptidne vezi je bila ugotovljena z rentgensko difrakcijsko analizo kimotripsinskih kompleksov s substratnimi analogi. Zlasti je bilo prikazano na primeru preučevanja kompleksov kimotripsina z nehidrolizabilnim analogom substrata - formil-L-triptofana, obstoj globokega hidrofobnega encima v encimu.
žep v bližini serina-195, ki po velikosti ustreza stranskim radikalom aromatskih aminokislin (slika 3. 12).
riž. 3.12 Shematski prikaz vezave formil-L-triptofana s kimotripsinom.
Prisotnost tega globokega žepa pojasnjuje specifičnost kimotripsina za aminokisline z aromatično ali drugo veliko hidrofobno stransko verigo. Rentgenska difrakcijska analiza kompleksov kimotripsina z analogi polipeptidnih substratov je pokazala velika številka vodikove vezi med glavnimi verigami encima in substratom, ki se nahajajo na enak način kot v antiparalelnih β-plasteh.
Mehanizem katalitičnega delovanja kimotripsina
Intenzivna in celovita rentgenska difrakcija in biokemične raziskave kimotripsina nam je omogočilo, da smo prišli do določenega zaključka o mehanizmu njegovega katalitičnega delovanja. Kot že omenjeno, His-57 in Ser-195 neposredno sodelujeta pri cepljenju substratne peptidne vezi. Hidroliza te vezi se začne, ko kisikov atom OH skupine Ser-195 napade ogljikov atom karbonilne skupine
hidrolizirana peptidna vez substrata. Zaradi tega postane vez med C in O atomoma v karbonilni skupini enojna in O atom pridobi negativni naboj. V tem primeru so štirje različni atomi, povezani z ogljikom karbonilne skupine, razporejeni v obliki tetraedra. Izobraževanje takih tetraedrski intermediat se izkaže za možno zaradi tvorbe vodikovih vezi med negativno nabitim atomom kisika (imenovanim oksianion) in dvema NH skupinama glavne verige encima (slika 3.13).
riž. 3.13 Tetraedrski intermediat v reakcijah acilacije in deacilacije kimotripsina. Stabilnost intermediata zagotavljajo vodikove vezi, ki jih tvorijo NH skupine glavne verige encima.
Ta regija kimotripsina se imenuje oksianionska votlina. V mehanizmu nastanka omenjenega intermediata ima najpomembnejšo vlogo prenos protona iz Ser-195 na His-57.
riž. 3.14 Prva stopnja hidrolize peptida s kimotripsinom je acilacija. Nastane tetraedrski intermediat. Aminska komponenta substrata se nato hitro loči od encima, sam encim pa se pretvori v vmesni produkt, encim acil.
Prenos protonov je močno olajšan s prisotnostjo sistema za prenos naboja. Ostanek Asp-102 strogo usmerja položaj imidazola histidin-57 in delno nevtralizira naboj, ki se pojavi na tem obroču. Proton, vezan s parom His-Asp, gre nato do atoma dušika hidrolizirane peptidne vezi, ki se zaradi tega prekine. Na tej stopnji je aminska komponenta substrata vezana z vodikovo vezjo na His-57, kisla komponenta pa je povezana z estrsko (kovalentno) vezjo na Ser-195, s čimer se zaključi korak aciliranja. Tako pri acilaciji kimotripsina nastane vmesna tetraedrična spojina (1), nato pa se aminska komponenta substrata (2) hitro loči od encima. Sam encim se pretvori v vmesni produkt katalize - acil encim (3) (slika 3.14).
riž. 3.15 Druga stopnja hidrolize peptida s kimotripsinom je deacilacija. Encim acil hidrolizira voda. Deacilacija je v bistvu obratna reakcija acilacije, vendar voda prevzame mesto aminske komponente substrata.
Na naslednji stopnji, deacilaciji, aminska komponenta difundira iz encima in voda prevzame svoje mesto v aktivnem središču.
Pravzaprav je deacilacija obraten proces acilacije. Prvič, sistem za prenos naboja odvzame proton iz vode.
