Nowoczesne metody diagnostyki zakażenia wirusem HIV. Stosowanie testu Combibest w diagnostyce wirusa HIV Czego można się spodziewać po wynikach badania w kierunku zakażenia HIV

Zaczęto stosować test ELISA (enzyme-linked immunosorbent test, ELISA). medycyna praktyczna gdzieś w latach 60-tych ubiegłego wieku. Jego początkowym zadaniem było badania histologiczne do celów naukowych, które sprowadzały się do poszukiwania i identyfikacji struktury antygenowej komórek żywego organizmu.

Metoda ELISA opiera się na oddziaływaniu antygenów specyficznych (AT) i pokrewnych (AG) w wyniku tworzenia kompleksu „antygen-przeciwciało”, który jest wykrywany za pomocą enzymu. Fakt ten skłonił naukowców do rozważenia, że ​​metodę tę można zastosować w celach diagnostycznych do identyfikacji swoistych immunoglobulin różnych klas biorących udział w odpowiedzi immunologicznej na konkretną infekcję. I to był przełom w klinicznej diagnostyce laboratoryjnej!

Metodę zaczęto aktywnie stosować dopiero na początku lat 80., a następnie głównie w wyspecjalizowanych instytucjach. Pierwsze analizatory immunoenzymów zostały wyposażone w ośrodki i stacje transfuzji krwi, choroby zakaźne i szpitale wenerologiczne, ponieważ na naszym horyzoncie pojawił się groźny AIDS, urodzony na kontynencie afrykańskim, i natychmiast dołączył do „starych” infekcji, wymagał natychmiastowych działań diagnostycznych i poszukiwań za działające na niego leki lecznicze.

Zakres stosowania metody ELISA

Możliwości testów immunologicznych enzymatycznych są naprawdę szerokie. Teraz trudno sobie wyobrazić, jak można obejść się bez takich badań, które są wykorzystywane dosłownie we wszystkich gałęziach medycyny. Wydaje się, co ELISA może zrobić w onkologii? Okazuje się, że można. I sporo. Zdolność analizy do znalezienia markerów charakterystycznych dla określonych gatunków nowotwory złośliwe, to podstawa wczesne wykrycie guza, gdy nie jest on jeszcze w żaden inny sposób określony ze względu na jego niewielkie rozmiary.

Współczesna kliniczna diagnostyka laboratoryjna (CDL) oprócz markerów nowotworowych dysponuje znaczącym arsenałem paneli ELISA i wykorzystuje je do diagnozowania różnych stanów patologicznych (procesy zakaźne, zaburzenia hormonalne) oraz monitorowanie leków farmaceutycznych w celu określenia ich wpływu na organizm pacjenta, a przy okazji nie tylko na człowieka. Obecnie badanie immunoenzymatyczne ma szerokie zastosowanie w służbach weterynaryjnych, gdyż „nasi mali bracia” także są podatni na wiele chorób, na które czasami bardzo cierpią.

Zatem, Test ELISA, ze względu na swoją czułość i swoistość, pozwala na podstawie próbki krwi pobranej z żyły określić:

• Stan hormonalny (hormony Tarczyca i nadnercza, hormony płciowe);
• Obecność wirusów i infekcja bakteryjna(HIV, B i C, chlamydia, kiła i, a także wiele innych chorób wywoływanych przez patogenne mikroorganizmy);
• Ślady życiowej aktywności mikroorganizmów, które zapoczątkowały proces zakaźny, który pomyślnie zakończył się i przeszedł do etapu tworzenia odpowiedzi immunologicznej na ten patogen. Takie ślady, czyli przeciwciała, w wielu przypadkach krążą we krwi przez całe życie, chroniąc w ten sposób osobę przed ponownym zakażeniem.

Jaka jest istota testu ELISA?

Metoda immunoenzymatyczna pozwala określić nie tylko obecność samego patogenu (analiza jakościowa), ale także jego zawartość ilościową w surowicy krwi pacjenta.

Dawka wirusa lub bakterii ma zatem istotny wpływ na przebieg procesu zakaźnego i jego wynik analiza ilościowa odgrywa ważną rolę w diagnostyce i leczeniu chorób różne formy i etapy.

Znając jednak badania immunoenzymatyczne jako metodę ELISA, nawet nie myślimy o tym, jak udaje się nią objąć tak szeroką gamę mikroorganizmów zamieszkujących naszą planetę, z których wiele stanowi bezpośrednie zagrożenie dla zdrowia i życia ludzi i zwierząt. Ale faktem jest, że ELISA ma wiele opcji (niekonkurencyjnych i konkurencyjnych - bezpośrednich i pośrednich), z których każda rozwiązuje swój własny problem, a tym samym pozwala na ukierunkowane wyszukiwanie.

Do identyfikacji immunoglobulin tej czy innej klasy stosuje się tradycyjny 96-dołkowy panel polistyrenowy (płytkę), w którego dołkach zatężają się zaadsorbowane rekombinowane białka w fazie stałej. Przeciwciała lub antygeny, które dostaną się do dołka z surowicą krwi, znajdą „znany” obiekt i utworzą z nim kompleks (AG – AT), który utrwalony koniugatem enzymatycznym będzie objawiał się zmianą koloru dołka, gdy czytanie wyników.

Test immunoenzymatyczny przeprowadza się przy użyciu systemów testowych o określonej swoistości, produkowanych w specjalnych laboratoriach i wyposażonych we wszystkie niezbędne składniki reagujące. Badania można prowadzić wykorzystując urządzenia myjące („myjki”) oraz spektrofotometry odczytowe, gdzie przez większą część wymagana praca fizyczna. Na w pełni automatycznych maszynach, które uwalniają asystenta laboratoryjnego od monotonnego wkraplania, mycia i innych rutynowych zadań, praca jest oczywiście szybsza i wygodniejsza, ale nie wszystkie laboratoria mogą sobie pozwolić na taki luksus i nadal pracować w staromodny sposób - na maszyny półautomatyczne.

Interpretacja wyników testu ELISA należy do kompetencji lekarza. diagnostyka laboratoryjna w tym przypadku brana jest również pod uwagę nieodłączna właściwość prawie wszystkich reakcji immunochemicznych polegająca na dawaniu odpowiedzi fałszywie dodatnich lub fałszywie ujemnych.

Wideo: nowoczesny test immunologiczny enzymatyczny

Wyniki testu ELISA na przykładzie kiły

Test immunologiczny enzymatyczny jest odpowiedni do wykrywania wszystkich form i dodatkowo jest wykorzystywana w badaniach przesiewowych. Aby przeprowadzić analizę, użyj krew żylna pacjent przyjmowany na pusty żołądek. W pracy wykorzystuje się tabletki o określonej swoistości (klasy AB A, M, G) lub przeciwciała całkowite.

Biorąc pod uwagę, że przeciwciała w kile powstają w określonej kolejności, w teście ELISA można łatwo odpowiedzieć na pytanie, kiedy doszło do zakażenia i na jakim etapie jest ten proces, a interpretację uzyskanych wyników można przedstawić w postaci:

• IgM wskazuje czas trwania procesu zakaźnego (może pojawić się podczas zaostrzenia przewlekłych chorób zapalnych);
• IgA stwierdza, że ​​do zakażenia doszło ponad miesiąc temu;
• IgG wskazuje, że infekcja jest w pełnym stadium lub że niedawno przeprowadzono leczenie, co można łatwo ustalić na podstawie wywiadu.

Podczas badania na kiłę studzienki ujemne (i kontrola ujemna) pozostaną bezbarwne, podczas gdy studzienki dodatnie (i kontrola dodatnia) będą miały jasnożółty kolor ze względu na zmianę koloru chromogenu dodanego podczas testu. Jednak intensywność barwy nie zawsze pokrywa się z kontrolą, to znaczy może być nieco jaśniejsza lub lekko żółtawa. Są to wątpliwe wyniki, które z reguły podlegają ponownemu badaniu z obowiązkowym uwzględnieniem wskaźników ilościowych uzyskanych na spektrofotometrze, ale ogólnie kolor jest wprost proporcjonalny do liczby kompleksów immunologicznych (powiązanych Ag i AT) .

Najbardziej ekscytującym testem immunoenzymatycznym jest test ELISA na obecność wirusa HIV

Analiza dotycząca jest być może bardziej interesująca dla szerokiego kręgu populacji niż inne, ponieważ nadal nie można z całą pewnością stwierdzić, że wiele osób zniknęło problemy społeczne(prostytucja, narkomania itp.). Niestety wirus HIV atakuje nie tylko te warstwy społeczeństwa; można się nim zarazić w różnych okolicznościach, niezwiązanych z niemoralnością seksualną czy zażywaniem narkotyków. Ale jeśli zajdzie potrzeba wykonania testu na HIV, nie powinieneś się obawiać, że wszyscy wokół ciebie dowiedzą się o Twojej wizycie w takim laboratorium. Teraz osoby zakażone wirusem HIV są chronione przez prawo, a ci, którzy mają wątpliwości, mogą zwrócić się do anonimowych biur, gdzie mogą rozwiązać problem bez obawy przed rozgłosem i potępieniem.

Metoda immunoenzymatyczna stosowana w diagnostyce zakażenia wirusem HIV jest jednym z najważniejszych badań standardowych, wymagającym jednak specjalne warunki, ponieważ temat jest bardzo drażliwy.

Test ELISA HIV ma sens przeprowadzać po kontakcie seksualnym, transfuzji krwi, innych zabiegach medycznych sugerujących zakażenie oraz po upływie okresu inkubacji („okno seronegatywne”), jednak należy pamiętać, że okres ten nie jest stały. Może zakończyć się za 14-30 dni lub może trwać do sześciu miesięcy, dlatego za średnią wartość uważa się przedział od 45 do 90 dni. NA Krew HIV Podaje się je w taki sam sposób, jak w przypadku innych infekcji - z żyły na pusty żołądek. Wyniki będą gotowe w zależności od nagromadzenia materiału w laboratorium i jego obciążenia pracą (od 2 do 10 dni), choć najczęściej laboratoria udzielają odpowiedzi tego samego dnia lub następnego.

Czego możesz się spodziewać po wynikach badania na obecność wirusa HIV?

Test ELISA do wykrywania zakażenia wirusem HIV wykrywa przeciwciała przeciwko dwóm typom wirusa: HIV-1 (częściej w Rosji i innych krajach Europy i Azji) oraz HIV-2 (częściej w Afryce Zachodniej).

Zadaniem testu HIV ELISA jest poszukiwanie przeciwciał klasy G, które wykrywane są we wszystkich systemach testowych, ale w późniejszym terminie oraz przeciwciał klasy A i M, wykrywanych w testach rekombinowanych nowej generacji, które umożliwiają wykrycie przeciwciał na najbardziej wczesne stadia (okres wylęgania– „okno seronegatywne”). Po teście ELISA możesz spodziewać się następujących odpowiedzi:

1. Wynik pierwotny pozytywny: krew należy zbadać ponownie przy użyciu systemu testowego tego samego typu, ale jeśli to możliwe, innej serii i przez inną osobę (asystenta laboratoryjnego);
2. Powtarzający się (+) sugeruje nowe ogrodzenie krew od pacjenta z badaniem podobnym do analizy pierwotnej;
3. Kolejny pozytywny wynik poddawany jest analizie referencyjnej, w której wykorzystuje się wysoce specyficzne zestawy testowe (2-3 szt.);
4. Pozytywny wynik w obu (lub trzech) systemach jest wysyłany do immunoblottingu (tego samego testu ELISA, ale wykonywanego w indywidualnie w przypadku zestawów testowych o szczególnie wysokiej swoistości).

Wniosek o zakażeniu wirusem HIV wyciąga się wyłącznie na podstawie immunoblottingu. Rozmowa z osobą zakażoną prowadzona jest z zachowaniem całkowitej poufności. Ujawnianie tajemnicy lekarskiej w Rosji, a także w innych krajach, podlega karze karnej.

Szczególną popularność zyskały także testy na chlamydię i cytomegalię metodą immunoenzymatyczną, gdyż pozwalają określić czas zakażenia, stopień zaawansowania choroby oraz skuteczność stosowanych środków leczniczych.

Podczas wdrażania można również zaobserwować pojawienie się przeciwciał różnych klas. w różnych fazach stanu patologicznego spowodowanego czynnikiem zakaźnym:

• IgM można wykryć już po siedmiu dniach od zakażenia;
• IgA wskazuje, że infekcja żyje w organizmie dłużej niż miesiąc;
• IgG potwierdza rozpoznanie chlamydii, pomaga monitorować leczenie i określać jego skuteczność. Należy zauważyć, że przeciwciała klasy G pozostają i krążą w organizmie niezależnie od czasu trwania choroby, dlatego aby poprawnie zinterpretować analizę, należy wziąć pod uwagę wartości referencyjne (normy), które nawiasem mówiąc , są różne dla każdego CDL: biorąc pod uwagę markę systemu testowego i specyfikę odczynników znajdujących się w zestawie. Wartości prawidłowe wpisuje się w formularzu obok wyniku testu ELISA.

Jeśli chodzi o , tutaj jest trochę inaczej: Przeciwciała klasy M pojawiają się po około półtora miesiąca, czyli wynik (IgM+) staje się dodatni w fazie pierwotnej infekcji lub w trakcie reaktywacji ukryta infekcja i pozostaje na tym poziomie od 4 do 6 miesięcy.

Obecność klasy G AT jest charakterystyczna dla początku pierwotnego ostra infekcja lub ponowna infekcja. Analiza stwierdza, że ​​wirus jest obecny, ale nie dostarcza informacji, na jakim etapie jest proces zakaźny. Tymczasem określenie prawidłowego miana IgG również powoduje trudności, ponieważ jest to całkowicie zależne od stan odporności konkretna osoba, co jednak ustala się identyfikując immunoglobuliny klasy G. Biorąc pod uwagę takie zachowanie przeciwciał, w diagnostyce CMV istnieje potrzeba oceny zdolności przeciwciał klasy G do interakcji z CMV, aby następnie ją „neutralizować” (awidność AT ). NA etap początkowy Choroby IgG bardzo słabo wiążą się z antygenami wirusowymi (mała awidność) i dopiero wtedy zaczynają wykazywać aktywność, dlatego można mówić o wzroście awidności przeciwciał.

O zaletach testu immunologicznego enzymatycznego można dużo mówić, gdyż dzięki tej metodzie udało się rozwiązać wiele problemów diagnostycznych wykorzystując wyłącznie krew żylną. Nie ma konieczności długiego oczekiwania, zmartwień i problemów z zebraniem materiału do badań. Ponadto systemy testowe do testu ELISA są stale udoskonalane i niedaleki jest dzień, w którym test da wynik w 100% wiarygodny.

Wideo: film edukacyjny Moskiewskiego Państwowego Uniwersytetu Medycznego im. Sechenov o podstawach testu ELISA

Właściciele patentu RU 2283497:

Wynalazek dotyczy dziedziny biotechnologii i medycyny. System testu immunoenzymatycznego do identyfikacji spektrum przeciwciał przeciwko ludzkiemu wirusowi niedoboru odporności (HIV) pierwszego i drugiego typu, pierwszego typu grupy O oraz identyfikacji antygenu ludzkiego wirusa niedoboru odporności pierwszego typu p24 obejmuje immunosorbent na bazie antygenów ludzkiego wirusa niedoboru odporności reprezentujących gp41 (env HIV-1 i HIV-2 grupa O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), gp36 (env HIV-2), przeciwciała przeciwko antygenowi HIV 1 p24 i odczynniki wykrywające, do sorpcji stosuje się powyższe antygeny HIV i przeciwciała HIV zaadsorbowane w różnych dołkach płytek do testu immunoenzymatycznego oraz składane lub nierozdzielne płytki polistyrenowe o 96 dołkach. Wynalazek zapewnia zwiększoną czułość, uproszczenie i eliminację subiektywizmu w ocenie wyników. 1 pensja akta, 10 tablic, 1 il.

Wynalazek dotyczy dziedziny biotechnologii i medycyny. Zastosowanie: zróżnicowane wykrywanie wszystkich klas swoistych przeciwciał przeciwko białkom 1 i 2 ludzkiego wirusa niedoboru odporności, HIV 1 grupa O i antygenowi p24 HIV 1.

Istota: uzyskanie enzymatycznego systemu testowego immunosorbcyjnego do identyfikacji spektrum przeciwciał wszystkich klas przeciwko poszczególnym białkom oraz antygenom HIV 1 i 2, HIV 1 grupy O i HIV 1 p24 w surowicy krwi (osoczu), immunoglobulinach i produktach krwi ludzkiej w w celu identyfikacji widma przeciwciał przeciwko HIV 1 i 2, HIV 1 grupa O, wykrycia antygenu HIV 1 p24 oraz potwierdzenia pozytywnych lub wątpliwych wyników badań przesiewowych na obecność przeciwciał przeciwko HIV 1 i 2, HIV 1 grupa O i antygenowi HIV 1 p24.

OPIS WYNALAZKU

Diagnostyka laboratoryjna zakażenia wirusem HIV opiera się na trzech obszarach: a) oznaczaniu wirusa HIV i jego składników; b) wykrycie przeciwciał przeciwko HIV; c) określenie zmian w układzie odpornościowym. Wśród istniejących metod Najczęstszą diagnostyką laboratoryjną jest diagnostyka serologiczna – wykrywanie przeciwciał przeciwko antygenom wirusa.

Do wykrywania przeciwciał w zakażeniu HIV stosuje się głównie test immunoenzymatyczny (ELISA) i immunoblot (IB). Test ELISA polega na immobilizacji antygenów wirusowych na płytkach, z którymi wiążą się przeciwciała pacjenta, a wykrywanie kompleksu antygen-przeciwciało odbywa się za pomocą mysich przeciwciał monoklonalnych sprzężonych z peroksydazą chrzanową, skierowanych przeciwko ludzkim immunoglobulinom G i M. Metoda jest dość specyficzna i czuła, pozwala na wykrycie przeciwciał swoistych dla wirusa u 95% pacjentów. Pozostałe 5% przypadków występuje we wczesnych stadiach infekcji, gdy w surowicy krwi jest jeszcze niewiele przeciwciał, lub w końcowych fazach choroby, gdy organizm nie jest już w stanie syntetyzować przeciwciał z powodu znacznego ich wyczerpania układ odpornościowy. Możliwe są także fałszywie dodatnie wyniki testu ELISA, głównie u pacjentów z chorobami autoimmunologicznymi, onkologicznymi, a także w przypadku infekcji wywołanej wirusem Eshptaina-Barra. W tym przypadku dochodzi do reakcji krzyżowej przeciwciał na czynnik reumatoidalny, Wirus Epsteina-Barra lub determinantom antygenowym, które są podobne do białek głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy 1 i 2 (HLA-4 i DQW3) i mają zdolność wiązania się z antygenami HIV. Wyniki fałszywie dodatnie są częste u kobiet w ciąży i osób starszych. Hemoliza, lipemia i zanieczyszczenie bakteryjne surowicy mogą również powodować niewiarygodne wyniki.

W związku z tym zaproponowano i zastosowano wiele metod badania specyficzności wyników wykrywania przeciwciał. Spośród tych metod najczęściej stosowaną reakcją jest „immune blot” w modyfikacji „Western Blot”. Istota metody jest następująca: w pierwszym etapie białka HIV rozdziela się według masy cząsteczkowej za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym. Następnie przeprowadza się elektroforetyczny transfer z żelu poliakryloamidowego na powierzchnię membrana nitrocelulozowa. Przeniesione w ten sposób antygeny wykrywa się na membranie metodą analizy pośredniej: membranę inkubuje się z materiałem testowym; zawarte przeciwciała wiążą się z antygenami HIV przeniesionymi na membranę nitrocelulozową, następnie paski membrany inkubuje się z koniugatem; Kiedy tworzy się kompleks antygen-przeciwciało, przyłącza się do niego koniugat, po wypłukaniu z koniugatu i inkubacji z podłożem następuje barwienie w tych obszarach nitrocelulozy, w których nastąpiło utworzenie kompleksu antygen-przeciwciało-koniugat. Na rysunku przedstawiono przykłady pozytywnych, słabo pozytywnych i negatywnych wyników immunoblotu.

W surowicy osób zakażonych HIV-1 i HIV-2 wykrywa się przeciwciała przeciwko następującym białkom (p) i glikoproteinom (gp): Tabela A.

W tabeli B przedstawiono kryteria oceny wyników immunoblottingu zalecane przez WHO i Rosyjskie Centrum Zapobiegania i Kontroli AIDS.

W oparciu o kryteria WHO surowice, w których metodą IB wykryto przeciwciała przeciwko dowolnym dwóm białkom otoczki HIV-1, uważa się za dodatnie. Jeżeli zachodzi reakcja tylko z jednym z białek otoczki (gp160, gp120, gp41) w połączeniu z reakcją lub bez reakcji z innymi białkami, wynik uważa się za wątpliwy. Według Federalnego Centrum Naukowo-Metodologicznego Ministerstwa Zdrowia Federacji Rosyjskiej ds. Zapobiegania i Kontroli AIDS surowice można interpretować jako pozytywne nawet w obecności przeciwciał tylko przeciwko jednemu białku błonowemu.

Wykrycie przeciwciał przeciwko antygenowi p24 może wskazywać na moment wystąpienia serokonwersji, gdyż przeciwciała przeciwko temu białku pojawiają się jako pierwsze. Pozytywne reakcje z białkami gag i pol bez obecności reakcji z białkami env mogą odzwierciedlać etap wczesnej serokonwersji, a także wskazywać na obecność zakażenia HIV-2 lub niespecyficzną reakcję.

Zastosowanie reakcji immunoblottingu jako eksperckiej metody diagnozowania wirusa HIV ma wiele istotnych wad:

1. Brak możliwości potwierdzenia wykrycia antygenu HIV 1 p24 w przypadku stosowania testów wykrywających jednocześnie antygen i przeciwciała przeciwko HIV, co powoduje, że niewłaściwe (bezsensowne) jest stosowanie testów przesiewowych do jednoczesnego wykrywania antygenu i przeciwciał przeciwko HIV ( Zarządzenie Ministerstwa Zdrowia Federacji Rosyjskiej nr 292 z dnia 30 lipca 2001 r.: „w celu badania dawców w stacjach transfuzji krwi konieczne jest stosowanie systemów testowych, które jednocześnie wykrywają antygen i przeciwciała przeciwko HIV”).

2. Wykrywanie wyłącznie przeciwciał klasy IgG. Nie da się w pełni potwierdzić pozytywnych wyników uzyskanych przy użyciu testów III i IV generacji (wykrywających Przeciwciała IgG i IgM).

3. Subiektywność w interpretacji wyników testów, szczególnie w przypadku wyników „wątpliwych” i „niepewnych” oraz początkowe etapy serokonwersja (wykryte prążki na błonach nitrocelulozowych są w tych przypadkach niewyraźne, ledwo widoczne gołym okiem i przy ocenie przez różne osoby często dochodzi do nieporozumień).

4. Niemożność zautomatyzowania ujęcie ilościowe Wyniki analizy.

5. Niższa czułość w porównaniu do testu ELISA.

6. Krótki okres trwałości (w czasie przechowywania paski membrany nitrocelulozowej blakną i nie mogą być obiektywnym potwierdzeniem wykrycia lub niewykrycia wirusa HIV w kontrowersyjnych przypadkach).

7. Trudności w przygotowaniu reakcji i przechowywaniu (paski membran nitrocelulozowych są bardzo delikatne i często pękają).

8. Wysoki koszt zestawów bezpieczeństwa informacji.

Znanym odczynnikiem jest zestaw do jednoczesnego oznaczania antygenów i przeciwciał tego samego patogenu, w tym wirusa HIV (DE 4236189 F1, 28.04.1994). Nie ujawniono jednak systemu testowego umożliwiającego diagnozowanie zakażenia wirusem HIV na różnych etapach.

Celem niniejszego wynalazku jest otrzymanie układu testowego, za pomocą którego możliwe jest potwierdzenie pozytywnych lub wątpliwych wyników badań przesiewowych na obecność przeciwciał przeciwko antygenowi HIV 1 i 2, HIV 1 grupy O i HIV 1 p24 przy zastosowaniu testów do jednoczesnego wykrywania antygenów i przeciwciał.

Zaproponowano rozwiązanie techniczne osiąga się za pomocą systemu testowego immunoenzymatycznego do identyfikacji spektrum przeciwciał przeciwko ludzkiemu wirusowi niedoboru odporności (HIV) pierwszego i drugiego typu, pierwszego typu grupy O oraz identyfikacji antygenu p24 ludzkiego wirusa niedoboru odporności pierwszego typ p24, znamienny tym, że zawiera immunosorbent na bazie antygenów ludzkiego wirusa niedoboru odporności, reprezentujący gp41 (env HIV-1 i HIV-2 grupa O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), gp36 (env HIV-2), przeciwciała przeciwko antygenowi HIV 1 p24 i odczynniki wykrywające, podczas gdy wyżej wymienione antygeny HIV i przeciwciała przeciwko HIV są absorbowane w różnych dołkach płytek w celu przeprowadzenia testu immunoenzymatycznego.

Dodatkowo do sorpcji wykorzystuje się 96-studzienkowe, składane lub niedemontowalne płytki polistyrenowe do testów immunologicznych.

Rezultatem technicznym osiągniętym dzięki niniejszemu wynalazkowi jest możliwość potwierdzenia pozytywnych wyników dla przeciwciał przeciwko HIV 1 i 2, antygenowi HIV 1 grupy O i HIV 1 p24, wysoka czułość, możliwość automatycznej interpretacji wyników, co eliminuje subiektywizm oceny oceny, łatwość przeprowadzenia testu, mniejsza niż przy istniejących kosztach zestawów bezpieczeństwa informacji.

To rozwiązanie techniczne różni się od znanych:

1. Zastosowanie płytki do reakcji immunologicznych jako nośnika w fazie stałej.

2. Jednoczesne zastosowanie przeciwciał przeciwko HIV s. 24 i zestawu antygenów HIV jako sorbentu.

Wynalazek ilustruje następujący przykład.

Aktywne zasady opracowanego systemu testowego „DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM + AG p24 HIV 1” to:

Immunosorbent - rekombinowane antygeny podobne do białek strukturalnych wirusa HIV-1: gp41 (env HIV-1 i HIV 1 grupa O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), HIV-2: gp36 (env) i monoklonalne mysie przeciwciała przeciwko antygenowi HIV 1(p24), adsorbowane oddzielnie na paskach składanej płytki polistyrenowej.

Aby przygotować zastosowanie immunosorpcyjne:

1. HIV-1 gp41 jest białkiem wytwarzanym przez szczep E. Coli nr AHIV 103.

2. HIV-1 gp120 jest białkiem wytwarzanym przez szczep E. Coli nr AHIV 109.

3. HIV-1 p24 jest białkiem wytwarzanym przez szczep E. Coli nr AHIV 105.

4. HIV-1 p31 jest białkiem wytwarzanym przez szczep E. Coli nr AHIV 108.

5. HIV-2 p36 jest białkiem wytwarzanym przez szczep E. Coli nr AHIV 106.

Koniugat 1, liofilizowany lub płynny, jest mysim przeciwciałem monoklonalnym przeciwko antygenowi p24 HIV1 skoniugowanym z biotyną.

1. Koniugat 2, liofilizowany lub płynny, jest mieszaniną rekombinowanych antygenów podobnych do białek strukturalnych wirusa HIV-1: gp41 (env HIV-1 i HIV 1 grupa O), gp120 (env), p24 (gag), p31( po1); HIV-2: gp36 (env), sprzężony z biotyną;

2. Koniugaty 3, 4 - liofilizowane lub płynne - streptawidyna, znakowane peroksydazą chrzanową;

W trakcie badań wstępnych wybrano projekt układu badawczego, opracowano technologię przygotowania jego elementów oraz zoptymalizowano warunki prowadzenia reakcji enzymatycznej.

Podczas wykonywania testu ELISA w systemie testowym „DS - ELISA - ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM + Ag p24 HIV 1”, do dołków płytki z zaadsorbowanymi przeciwciałami przeciwko p24 dodaje się 25 µl koniugatu-1 oraz 25 µl koniugatu-1 dodaje się do dołków z zaadsorbowanymi antygenami 25 µl koniugatu-2. Schemat reakcji pokazano poniżej. Następnie do każdego dołka dodaje się 25 µl badanej próbki. Jednocześnie w dołkach z antygenami zmienia się kolor z pomarańczowego na różowy, a w dołku z przeciwciałami – z zielonego na szary. Mieszaninę inkubuje się przez 45 minut w temperaturze 37°C na wytrząsarce (lub 1 godzinę w temperaturze 37°C w termostacie). Następnie, bez przemywania, dodać 50 µl koniugatu-3 do dołków płytki w celu oznaczenia antygenu p24 i 50 µl koniugatu-4 do dołków do oznaczenia przeciwciał. Po inkubacji przez 20 minut w temperaturze 37°C na wytrząsarce (lub 30 minut w temperaturze 37°C w termostacie), płytkę przemywa się i wywołuje mieszaniną substratów. Całkowity czas reakcji 1 godzina 25 minut (lub 1 godzina 50 minut). Antygen p24 obecny w badanej próbce wiąże się z przeciwciałami monoklonalnymi skierowanymi przeciwko p24, a specyficzne przeciwciała tworzą na płytce kompleks z rekombinowanymi antygenami. Powstały kompleks immunologiczny anty-p24 z p24 wykrywa się za pomocą koniugatów anty-p24-biotyna, następnie za pomocą streptawidyny-peroksydazy, a kompleksy immunologiczne Ag-HIV z At-HIV wykrywa się za pomocą koniugatu Ag-biotyna, następnie za pomocą streptawidyny-peroksydazy. peroksydaza.

Schemat przygotowania reakcji.

Wyniki uwzględniane są spektrofotometrycznie przy dwóch długościach fal: 450/620-680 nm przy urządzeniu skonfigurowanym „drogą powietrzną”. Weźmy pod uwagę wyniki przy jednej długości fali 450 nm.

Wyniki analizy uwzględnia się, jeśli średnie wartości gęstości optycznej (OD) w dołkach z K- wynoszą nie więcej niż 0,2, w dołkach z K+ - nie mniej niż 1,0. Krytyka OP. obliczane według wzoru:

Krytyka OP. gp41 = śr. oznaczający OP K-(gp41)+0,15

Krytyka OP. gp120 = śr. oznaczający OP K-(gp120)+0,15

Krytyka OP. p24 = średnio. oznaczający OP K-(р24)+0,15

Krytyka OP. p31 = średnio. oznaczający OP K-(р31)+0,15

Krytyka OP. gp36 = śr. oznaczający OP K-(gp36)+0,15

Krytyka OP. Ag p24 = śr. oznaczający OP k- (Ag p24)+0,04

gdzie 0,15 i 0,04 to współczynniki ustalone w drodze przetwarzania statystycznego u producenta. Podczas opracowywania systemu testowego wykorzystano:

1. Próbki surowicy krwi od zdrowych dawców (n=610).

2. Próbki surowicy krwi od pacjentów z różnymi chorobami choroba zakaźna niezwiązane z HIV (ostre infekcje dróg oddechowych, zapalenie płuc, zapalenie migdałków, opryszczka i zakażenie wirusem cytomegalii, kiła, chlamydia, wirusowe zapalenie wątroby typu A, B i C (n=224)).

3. Próbki surowicy krwi od pacjentów z różnymi chorobami Choroby niezakaźne- urazy, choroby układu sercowo-naczyniowego, onkologia (n=35).

4. Próbki surowicy krwi od kobiet w ciąży (n=40).

5. Próbki surowicy krwi seropozytywne w teście ELISA i potwierdzone immunoblotem (n=428).

6. Próbki surowicy z wynikiem dodatnim uzyskanym w systemach testów immunoenzymatycznych do jednoczesnego oznaczania przeciwciał HIV 1.2 i antygenu p24 oraz wynikiem nieokreślonym metodą immunoblot (n=123).

7. Wewnętrzny panel surowic zawierających i niezawierających przeciwciała przeciwko HIV 1,2, przebadanych systemami testów immunoenzymatycznych i immunoblot zarejestrowanymi przez Ministerstwo Zdrowia Federacji Rosyjskiej (n=21).

8. Standard „HIV 1 ANTIGEN STANDARD”, „BIO RAD”, Francja, nr kat. nr 72217, który jest antygenem uzyskanym z lizatu wirusa.

9. Wewnętrzny standard przedsiębiorstwa. Próbka zawierająca antygen p 24 w stężeniu 200 pg/ml, otrzymana z lizatu wirusa i miareczkowana zgodnie ze standardem „HIV 1 ANTIGEN STANDARD” firmy „BIO RAD”, Francja, nr kat. Nr 72217.

10. Panel wzorcowy surowic zawierających przeciwciała przeciwko ludzkiemu wirusowi niedoboru odporności typu 1 (HIV 1) - OSO 42-28-212-93-02P, „Unia Medyczno-Biologiczna”, Nowosybirsk.

11. Standardowy panel surowic zawierających przeciwciała przeciwko ludzkiemu wirusowi niedoboru odporności typu 2 (HIV 2) - OSO-42-28-216-02P, „Unia Medyczno-Biologiczna”, Nowosybirsk.

12. Standardowy panel surowic niezawierających przeciwciał przeciwko ludzkiemu wirusowi niedoboru odporności typu 1 i 2 (HIV 1, 2) - OSO-42-28-214-94-02P, „Unia Medyczno-Biologiczna”, Nowosybirsk.

Czułość systemu testowego do wykrywania antygenu p24 oceniano za pomocą „HIV I ANTIGEN STANDARD”, „BIO RAD” i wewnętrznego standardu przedsiębiorstwa. Stosując standard wewnętrzny, przygotowano 4 seryjne 2-krotne rozcieńczenia od 40 pg/ml do 5 pg/ml z osoczem normalnego dawcy, wolnym od przeciwciał przeciwko HIV 1, 2, jako rozcieńczalnikiem. Za kryterium czułości przyjęto najmniejszą ilość wykrywalnego antygenu. Uzyskane dane przedstawiono w tabeli 1.

Do oceny czułości systemu testowego w wykrywaniu swoistych przeciwciał wykorzystano standardowe panele próbek zawierające przeciwciała przeciwko ludzkiemu wirusowi niedoboru odporności (HIV 1, 2) (OSO 42-28-212-93-02P p.012, OSO 42- 28-216-02P (HIV 2) s.003).

Uzyskane dane przedstawiono w tabelach 3, 4.

Porównano skuteczność diagnostyczną systemu testowego „DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTR+AGr24 HIV 1” z systemami testowymi „Jenskrin-HIV-Ag/At” (Bio-Rad), „DIA-HIV 1/2" (Diaprof-Med), "Vironostika HIV Uni-form II Ag/At" (Biomerioux), "Recombinant-HIV1,2 DSM" (MBS), "Amercard Anti-HIV-1,2 K" (Amercard ), „HIV-1, HIV-2-ELISA-Awicenna” (Awicenna). W tym celu próbki surowicy z panelu wewnętrznego zostały przebadane we wszystkich określonych testach. Wyniki przedstawione w tabeli 5 wskazują na wysoką skuteczność diagnostyczną testu „DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1”.

Badania czułości systemu testowego „DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1” przeprowadzono także z surowicami krwi pacjentów, u których w badaniu immunoblottingu potwierdzono obecność wirusa HIV. Łącznie przebadano 428 próbek takich surowic. Uzyskano kilka możliwości wykrywania przeciwciał przeciwko różnym białkom HIV i antygenowi p24. Wyniki przedstawiono w tabeli 6.

Podczas badania próbek pozytywnych pod względem wirusa HIV 1 wykazano 3% surowicy pozytywna reakcja z gp36 (HIV env 2). OP/OPkryt. w tych próbach nie przekroczyła 2,0. Nasze dane dotyczące reaktywności krzyżowej białek otoczki zewnętrznej HIV 1 (gp41) i HIV 2 (gp36) pokrywają się z danymi literaturowymi.

Interpretacja wyników

Analiza badań surowic HIV-dodatnich oraz próbek z paneli standardowych i wewnętrznych w programie „DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTR+AGr24 HIV 1” pozwoliła na opracowanie kryteriów interpretacji wyników tego testu. Zalecane kryteria podano w tabeli 7.

W oparciu o te kryteria wszystkie próbki surowicy zakażonej wirusem HIV (n=428) uznano za dodatnie w teście „DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV1”. Z 16 próbek panelu standardowego zawierających przeciwciała przeciwko HIV 1, 14 uznano za pozytywne, a 2 uznano za nieokreślone. Wszystkie 8 próbek z panelu standardowego zawierających przeciwciała przeciwko HIV 2 uznano za pozytywne. Z 10 próbek panelu wewnętrznego zawierających przeciwciała przeciwko HIV 1, 7 uznano za pozytywne, a 3 uznano za nieokreślone.

Badania wrażliwości systemu testowego „DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1” przeprowadzono także z surowicami krwi pacjentów, którzy uzyskali pozytywny wynik w testach immunoenzymatycznych, wykrywających jednocześnie przeciwciała i antygen p24 i nieokreślony w immunoblocie. Łącznie przebadano 123 takie próbki. Dane przedstawiono w tabeli 8.

Podczas badania surowic z nieokreślonym wynikiem immunoblotu (n=123) w „DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1” 72 próbki (58,5%) wykazały wynik dodatni. Spośród nich 26 surowic (21,1%) było dodatnich tylko dla p24, 20 (16,3%) – tylko dla przeciwciał, 16 (13%) – dla p24 z przeciwciałami przeciwko jednemu z białek, 10 (8,1%) – dla p24 z przeciwciała przeciwko dwóm lub większej liczbie białek. Zatem badanie wyłącznie na obecność przeciwciał (bez wykrywania p24) pozwoliłoby zidentyfikować 30 próbek (24,4%) jako pozytywne. Wykrycie w teście antygenu p24 umożliwiło identyfikację dodatkowych 42 próbek (34,1%) jako pozytywnych.

Do oceny specyficzności systemu testowego użyto standardowego panelu surowic niezawierających przeciwciał przeciwko HIV 1, 2 (n=20); próbki surowicy krwi od zdrowych dawców (n=610), próbki surowicy krwi od pacjentów z różnymi chorobami zakaźnymi (n=224) niezwiązanymi z HIV; próbki surowicy krwi od pacjentów z różnymi chorobami niezakaźnymi – urazowymi, chorobami układu sercowo-naczyniowego, onkologicznymi (n=35); próbki surowicy krwi od kobiet w ciąży (n=40). W sumie przebadano 929 próbek. W jednej próbce surowicy krwi zdrowych dawców uzyskano wynik fałszywie dodatni – wykryto przeciwciała przeciwko gp41 i p24. 7 próbek surowicy krwi od zdrowych dawców i 2 próbki surowicy krwi od pacjentów z chorobami zakaźnymi niezwiązanymi z wirusem HIV wykazały fałszywie dodatni wynik dla p24.

Do oceny specyfiki układu badawczego wykorzystano standardowy panel próbek ujemnych (OSO 42-28-214-94-02p, s. 009). Swoistość była stuprocentowa.

Tym samym badania wykazały, że specyficzność systemu testowego „DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTR+AGr24 HIV 1” przy badaniu próbek surowicy krwi od zdrowych dawców i pacjentów z różnymi chorobami zakaźnymi i somatycznymi wynosi 99%. .

Uzyskane dane wskazują na wysoką skuteczność diagnostyczną opracowanego systemu testowego „DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTR+AGr24 HIV 1”. System testowy może być stosowany do wykrywania przeciwciał dla poszczególnych białek wirusa HIV typu 1 i 2 oraz antygenu HIV1 p24 w celu potwierdzenia pozytywnego wyniku badania przesiewowego za pomocą systemów testowych wykrywających przeciwciała lub systemów testowych wykrywających jednocześnie przeciwciała i antygen p24 HIV1. System testowy może być stosowany jako alternatywny test immunoblot w celu potwierdzenia pozytywnych wyników, a także do badania dynamiki przeciwciał HIV i antygenu p24 na różne etapy infekcje.

ZALETY TESTU

1. Potwierdzający test immunoenzymatyczny w formie tabletek

2. Test potwierdzający łączący oznaczenie widma przeciwciał HIV 1, 2 i antygenu p24 HIV 1

3. Wykrywanie przeciwciał wszystkich klas Ig

4. Czułość wykrywania p24 wynosi co najmniej 5 pg/ml

5. Redukuje nieokreślone wyniki w porównaniu do immunoblottingu

6. Czas analizy – 1 godzina 25 minut (immunoblot – od 3 do 20 godzin)

7. Wizualna ocena dodania wszystkich składników i próbek.

1. System testu immunoenzymatycznego do identyfikacji spektrum przeciwciał przeciwko ludzkiemu wirusowi niedoboru odporności (HIV) pierwszego i drugiego typu, pierwszego typu grupy O oraz identyfikacji antygenu p24 przeciwko ludzkiemu wirusowi niedoboru odporności typu pierwszego p24, znamienny tym, że zawiera immunosorbent oparty na antygenach wirusa niedoboru odporności człowieka, reprezentujący gp41 (env HIV-1 i HIV-2 grupa O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), gp36 (env HIV -2), przeciwciała przeciwko antygenowi HIV 1 p24 oraz odczynniki wykrywające, przy czym wyżej wymienione antygeny HIV i przeciwciała przeciwko HIV są absorbowane w różnych dołkach płytek w celu przeprowadzenia testu immunoenzymatycznego.

2. System testu immunologicznego enzymatycznego według zastrzeżenia 1, znamienny tym, że do sorpcji stosuje się składane lub nierozdzielne płytki polistyrenowe o 96 dołkach do testu immunologicznego enzymatycznego.

Terminowe rozpoznanie zakażenia wirusem HIV staje się niezwykle ważnym środkiem, ponieważ wcześniejsze rozpoczęcie leczenia może w dużej mierze decydować dalszy rozwój choroby i przedłużyć życie pacjenta. W ostatnie lata Poczyniono znaczne postępy w identyfikowaniu tego problemu straszna choroba: Stare systemy testowe są zastępowane bardziej zaawansowanymi, metody badawcze stają się coraz bardziej dostępne, a ich dokładność znacznie wzrasta.

W tym artykule porozmawiamy o nowoczesnych metodach diagnozowania zakażenia wirusem HIV, których znajomość jest przydatna do szybkiego leczenia tego problemu i utrzymania normalnej jakości życia pacjenta.

Metody diagnostyki HIV

W Rosji przeprowadzana jest standardowa procedura diagnozowania zakażenia wirusem HIV, która obejmuje dwa poziomy:

• System testowy ELISA (analiza przesiewowa);
• immunoblot (IB).

Do diagnozy można również zastosować inne metody:

• szybkie testy.

Systemy testów ELISA

Na pierwszym etapie diagnozy do wykrycia zakażenia wirusem HIV wykorzystuje się test przesiewowy (ELISA), który opiera się na powstałych w laboratoriach białkach wirusa HIV, które wychwytują specyficzne przeciwciała wytwarzane w organizmie w odpowiedzi na zakażenie. Po ich interakcji z odczynnikami (enzymami) układu testowego zmienia się kolor wskaźnika. Następnie te zmiany barwy poddawane są obróbce przy użyciu specjalnego sprzętu, który determinuje wynik przeprowadzonej analizy.

Takie testy ELISA mogą dać wyniki w ciągu kilku tygodni po wprowadzeniu zakażenia wirusem HIV. Test ten nie określa obecności wirusa, ale wykrywa wytwarzanie przeciwko niemu przeciwciał. Czasami w organizmie człowieka produkcja przeciwciał przeciwko wirusowi HIV rozpoczyna się już po 2 tygodniach od zakażenia, jednak u większości osób są one produkowane dłużej później, po 3-6 tygodniach.

Istnieją cztery generacje testów ELISA o różnej czułości. W ostatnich latach coraz częściej stosuje się systemy testowe trzeciej i czwartej generacji, które opierają się na syntetycznych peptydach lub białkach rekombinowanych i charakteryzują się większą swoistością i dokładnością. Można ich używać do diagnozowania zakażenia wirusem HIV, monitorowania częstości występowania wirusa HIV i zapewnienia bezpieczeństwa podczas badania oddanej krwi. Dokładność systemów testów ELISA III i IV generacji wynosi 93-99% (testy produkowane w krajach są bardziej czułe Zachodnia Europa – 99%).

Do wykonania testu ELISA pobiera się z żyły pacjenta 5 ml krwi. Pomiędzy ostatnim posiłkiem a analizą musi upłynąć co najmniej 8 godzin (zwykle wykonuje się ją rano na czczo). Zaleca się wykonanie takiego badania nie wcześniej niż 3 tygodnie od podejrzenia zakażenia (np. po stosunku płciowym bez zabezpieczenia z nowym partnerem seksualnym).

Wyniki testu ELISA uzyskuje się w ciągu 2-10 dni:

• wynik negatywny: wskazuje na brak zakażenia wirusem HIV i nie wymaga konsultacji ze specjalistą;
• wynik fałszywie ujemny: można zaobserwować we wczesnych stadiach infekcji (do 3 tygodni), w późniejszych stadiach AIDS z ciężką supresją układu odpornościowego i niewłaściwym przygotowaniem krwi;
• wynik fałszywie dodatni: można zaobserwować w niektórych chorobach oraz w przypadku nieprawidłowego przygotowania krwi;
• wynik pozytywny: wskazuje na zakażenie wirusem HIV, wymaga przeprowadzenia IB i skontaktowania się pacjenta ze specjalistą w ośrodku AIDS.

Dlaczego test ELISA może dawać fałszywie dodatnie wyniki?

Fałszywie dodatnie wyniki testu ELISA na HIV mogą wystąpić w wyniku nieprawidłowego przetwarzania krwi lub u pacjentów z następującymi schorzeniami i chorobami:

• szpiczak mnogi;
• choroby zakaźne wywołane wirusem Epsteina-Barra;
• stan po;
• choroby autoimmunologiczne;
• na tle ciąży;
• stan po szczepieniu.

Z powodów opisanych powyżej we krwi mogą znajdować się nieswoiste przeciwciała reagujące krzyżowo, których wytwarzanie nie zostało spowodowane zakażeniem wirusem HIV.

W ostatnich latach częstotliwość wyników fałszywie dodatnich znacznie spadła ze względu na stosowanie systemów testowych III i IV generacji, które zawierają bardziej czułe peptydy i białka rekombinowane (są syntetyzowane metodą inżynierii genetycznej in vitro). Po wprowadzeniu takich testów ELISA częstotliwość wyników fałszywie pozytywnych znacznie spadła i wynosi około 0,02-0,5%.

Wynik fałszywie dodatni nie oznacza, że ​​dana osoba jest zakażona wirusem HIV. W takich przypadkach WHO zaleca wykonanie kolejnego testu ELISA (koniecznie IV generacji).

Krew pacjenta przesyłana jest do laboratorium referencyjnego lub arbitrażowego z oznaczeniem „powtórz” i badana systemem testowym ELISA IV generacji. Jeżeli wynik nowej analizy jest negatywny, wówczas pierwszy wynik uważa się za błędny (fałszywie dodatni) i nie przeprowadza się IS. Jeśli wynik drugiego testu będzie pozytywny lub wątpliwy, pacjent musi po 4-6 tygodniach przejść IB, aby potwierdzić lub wykluczyć zakażenie wirusem HIV.

Immunoblotting

Ostateczną diagnozę zakażenia wirusem HIV można postawić dopiero po uzyskaniu dodatniego wyniku immunoblottingu (IB). Do jego przeprowadzenia wykorzystuje się pasek nitrocelulozowy, na który nanoszone są białka wirusowe.

Pobieranie krwi w kierunku IB pobiera się z żyły. Następnie poddaje się go specjalnej obróbce, a zawarte w jego surowicy białka zostają rozdzielone w specjalnym żelu według ich ładunku i masy cząsteczkowej (manipulacja odbywa się na specjalnym sprzęcie pod wpływem pole elektryczne). Na żel surowicy krwi nakłada się pasek nitrocelulozowy i w specjalnej komorze przeprowadza się bloting („blotting”). Pasek jest przetwarzany i jeśli użyte materiały zawierają przeciwciała przeciwko wirusowi HIV, wiążą się one z prążkami antygenowymi na IB i pojawiają się w postaci linii.

IB uważa się za pozytywne, jeżeli:

• według amerykańskich kryteriów CDC - na pasku znajdują się dwie lub trzy linie gp41, p24, gp120/gp160;
• zgodnie z amerykańskimi kryteriami FDA pasek ma dwie linie p24, p31 i linię gp41 lub gp120/gp160.

W 99,9% przypadków dodatni wynik IB wskazuje na zakażenie wirusem HIV.

Jeśli nie ma linii, IB jest ujemne.

Identyfikując linie z gr160, gr120 i gr41, IB jest wątpliwe. Wynik ten może wystąpić, gdy:

• choroby onkologiczne;
• ciąża;
• częste transfuzje krwi.

W takich przypadkach zaleca się powtórzenie badania z użyciem zestawu innej firmy. Jeżeli po dodatkowym IB wynik pozostaje wątpliwy, konieczna jest obserwacja przez pół roku (IB przeprowadza się co 3 miesiące).

Reakcja łańcuchowa polimerazy

Test PCR może wykryć RNA wirusa. Jego czułość jest dość wysoka i pozwala wykryć zakażenie wirusem HIV w ciągu 10 dni od zakażenia. W niektórych przypadkach PCR może dać wyniki fałszywie dodatnie, ponieważ jego wysoka czułość może również reagować na przeciwciała przeciwko innym infekcjom.

Ta technika diagnostyczna jest kosztowna i wymaga specjalnego sprzętu oraz wysoko wykwalifikowanych specjalistów. Powody te nie pozwalają na przeprowadzanie masowych badań populacji.

PCR stosuje się w następujących przypadkach:

• do wykrywania wirusa HIV u noworodków urodzonych przez matki zakażone wirusem HIV;
• w celu wykrycia wirusa HIV w „okresie okna” lub w przypadku wątpliwego IB;
• kontrolować stężenie wirusa HIV we krwi;
• do badania krwi dawców.

Sam test PCR nie pozwala na rozpoznanie wirusa HIV, ale jest przeprowadzany jako dodatkowa metoda diagnostyczna w celu rozwiązania kontrowersyjnych sytuacji.

Metody ekspresowe

Jedną z innowacji w diagnostyce HIV są szybkie testy, których wyniki można ocenić w ciągu 10-15 minut. Najbardziej efektywne i dokładne wyniki uzyskuje się stosując testy immunochromatograficzne oparte na zasadzie przepływu kapilarnego. Są to specjalne paski, na które nanosi się krew lub inne płyny testowe (ślina, mocz). Jeżeli obecne są przeciwciała przeciwko wirusowi HIV, po 10-15 minutach na teście pojawia się kolorowy pasek kontrolny – wynik pozytywny. Jeśli wynik będzie negatywny, pojawi się tylko pasek kontrolny.

Podobnie jak w przypadku testów ELISA, wyniki szybkich testów należy potwierdzić analizą IB. Dopiero po tym można postawić diagnozę zakażenia wirusem HIV.

Dostępne są zestawy do szybkich testów domowych. Test OraSure Technologies1 (USA) jest zatwierdzony przez FDA, jest dostępny bez recepty i może być stosowany do wykrywania wirusa HIV. Po badaniu, jeśli wynik jest pozytywny, zaleca się pacjentowi poddanie się badaniu w specjalistycznym ośrodku w celu potwierdzenia diagnozy.

Inne testy do użytku domowego nie zostały jeszcze zatwierdzone przez FDA, a ich wyniki mogą być bardzo wątpliwe.

Pomimo tego, że szybkie testy mają gorszą dokładność niż testy ELISA IV generacji, są one powszechnie stosowane w dodatkowych badaniach populacji.

Testy na wykrycie zakażenia wirusem HIV można wykonać w dowolnej przychodni, centralnym szpitalu powiatowym lub wyspecjalizowanych ośrodkach AIDS. Na terytorium Rosji przeprowadzane są one w sposób całkowicie poufny lub anonimowy. Każdy pacjent może liczyć na konsultację lekarską lub psychologiczną przed lub po badaniu. Za testy na HIV będziesz musiał zapłacić jedynie w handlu instytucje medyczne, i w kliniki państwowe i szpitalach wykonywane są bezpłatnie.

Przeczytaj, w jaki sposób można zarazić się wirusem HIV i jakie mity krążą na temat możliwości zarażenia się.

Najbardziej rozpowszechnionym wirusem na świecie jest dziś AIDS, wirus z podrodziny retrowirusów, nazywanych także lentiwirusami, czyli „powolnymi”. Rzeczywiście, w organizmie człowieka zaczynają wykazywać aktywność po stosunkowo długim czasie, około 10 lat.

Istnieją niedobory odporności pierwszego i drugiego typu. Ale spokojnie możemy mówić o ekspansji pierwszego typu wirusa. Gdy wirus dostanie się do krwi i dołączy do komórki odpowiedzialnej za odporność, zaczyna się szybko namnażać. O ile odpowiedzialna za jego rozpoznanie cząsteczka CD4 identyfikuje podstępnego wroga, o tyle udaje jej się zainfekować cały organizm. Dlatego im wcześniej zostanie zdiagnozowana, tym większe szanse pacjenta na szybkie leczenie i dłuższe życie.

Jeśli dana osoba ma powód, aby poddać się testowi na AIDS, należy to zrobić natychmiast. Najczęściej podstawą takiej diagnozy jest oznaczenie we krwi przeciwciał przeciwko niedoborom odporności - białek, które powstają w reakcji na obecność wirusa i zaczynają się tworzyć w okresie od 1,5 do 6 miesięcy od momentu możliwego infekcja. W związku z tym bardziej wskazane jest poddanie się diagnostyce po tym okresie.

Ilość przeciwciał określa się za pomocą analizy zwanej testem immunoenzymatycznym (ELISA). Ta metoda jest godna zaufania, jest stosunkowo dokładna i bardzo czuła, wartości te wynoszą ponad 99,5%. Na rynku farmaceutycznym dostępnych jest szereg zestawów testów diagnostycznych do testu ELISA: CombiBest HIV, Anti-HIV 1 2, CombiBest anty-HIV, CombiBest anty-HIV 1 2, CombiBest anty-HIV 1 2 d 0172. Te systemy testowe należą do trzeciej Pokolenie. Wada tych odczynników: nie zawsze wykrywają chorobę wczesne daty. Osoba jest już nosicielem wirusa, jest potencjalnie niebezpieczna dla partnerów, ale we krwi nie ma jeszcze przeciwciał.

Zestawy wyposażone są głównie w szereg testów umożliwiających wykonanie 12*8 lub 192 testów anty-HIV. Nie zaleca się stosowania ich samodzielnie. Z opisu leków wynika, że ​​ich głównym celem jest wykrywanie ilości przeciwciał przeciwko obu typom AIDS. A także określić przeciwciała wszystkich klas na AIDS. Jeśli nie ma przeciwciał, choroba nie została zdiagnozowana.

Testy czwartej generacji „widzą” oprócz przeciwciał także antygeny AIDS, są w stanie wykryć infekcję wcześniej niż metody trzeciej generacji. Dla porównania: antygen HIV znajduje się we krwi już od 5 dnia, a pierwsze przeciwciała pojawiają się dopiero po miesiącu. CombiBest HIV 1, 2 AG/AT (zestaw 1) i CombiBest HIV 1, 2 AG/AT (zestaw 2) należą do testów czwartej generacji. Za pomocą zestawu tych odczynników wykrywa się przeciwciała przeciwko antygenom typu 1, 2 i p24 poprzez badanie ludzkiej surowicy krwi lub osocza. W wielu krajach stosuje się badanie ELISA czwartej generacji, zwane także antygenem/przeciwciałem, w skrócie AGAT.

Testowanie odbywa się anonimowo.

Opis

Przygotowanie

Wskazania

Interpretacja wyników

Opis

Metoda oznaczania Test immunoenzymatyczny (ELISA).

Materiał w trakcie badań Surowica krwi

Możliwość wizyty domowej

Połączone wykrywanie przeciwciał przeciwko HIV typu 1 i 2 oraz antygenowi p24 HIV, test jakościowy.

Uwaga. W przypadku reakcji pozytywnych i budzących wątpliwości termin wydania wyników może zostać wydłużony do 10 dni roboczych. HIV (ludzki wirus niedoboru odporności), który powoduje AIDS (zespół nabytego niedoboru odporności), należy do rodziny retrowirusów. Przenoszona z osoby na osobę poprzez użycie zanieczyszczonych igieł i strzykawek. podanie dożylne narkotyków lub zabiegów terapeutycznych, podczas kontaktów seksualnych, zarówno heteroseksualnych, jak i homoseksualnych. Do przeniesienia wirusa może dojść poprzez transfuzję zakażonej krwi i jej produktów, dawstwo narządów lub nasienia, a wśród pracowników medycznych – poprzez zranienie zakażonymi igłami lub narzędziami. Zakażenie wirusem HIV jest możliwe poprzez przeniesienie zakażenia z zakażonej matki na dziecko (drogą pionową), choć nowoczesne metody zapobiegania za pomocą terapii przeciwretrowirusowej, jeśli zastosuje się wszystkie zalecenia, mogą to ryzyko ograniczyć do minimum.

Proces interakcji wirusa z komórką składa się z kilku etapów: związanie wirusa z komórką, uwolnienie go z otoczki, penetracja cytoplazmy, synteza DNA przy użyciu wirusowego RNA, integracja wirusowego DNA z genomem komórka gospodarza. Następnie rozpoczyna się utajony etap infekcji. W tym stanie prowirusowe DNA może istnieć przez pewien czas, nie wykazując aktywności i nie wpływając na życie komórki gospodarza. Chociaż nie ma ekspresji białek wirusowych, nie ma odpowiedzi odpornościowej na wirusa. Przeciwciała przeciwko wirusowi HIV, które charakteryzują odpowiedź immunologiczną organizmu, pojawiają się po aktywacji wirusowego DNA i rozpoczęciu aktywnej reprodukcji wirusa. Czas trwania okresu utajonego zależy od wielu czynników, w tym od indywidualnych cech genetycznych organizmu.

Przeciwciała przeciwko wirusowi HIV mogą pojawiać się już od drugiego tygodnia po zakażeniu; ich zawartość wzrasta w ciągu 2-4 tygodni i utrzymuje się przez wiele lat. U 90-95% zakażonych pojawiają się w ciągu pierwszych trzech miesięcy po zakażeniu, u 5-9% - w okresie od trzech do sześciu miesięcy, u 0,5-1% - w późniejszym terminie.

W pierwszych tygodniach zakażenia, jeszcze przed pojawieniem się przeciwciał przeciwko wirusowi (tj. przed serokonwersją), w próbkach surowicy lub osocza można wykryć obecność antygenów wirusa HIV, w tym białka kapsydu p24. Później, po serokonwersji, zwykle staje się niewykrywalna.

Systemy testów kombinowanych IV generacji, do których zalicza się test HIV Ag/Ab Combo (Architect, Abbott), wykrywają zarówno przeciwciała przeciwko wirusowi HIV typu 1 i 2, jak i antygenowi p24 HIV, co pozwala na wczesne wykrycie zakażenia. Szczególną cechą testu przesiewowego stosowanego w laboratorium INVITRO do wykrywania zakażenia wirusem HIV jest wysoka swoistość badania (> 99,5%); Test jest w 100% czuły na przeciwciała charakterystyczne dla okresu serokonwersji, a czułość testu na antygen p24 wynosi około 18 pg/ml.

Procedura przeprowadzania badania laboratoryjnego na obecność wirusa HIV jest ściśle regulowana zarządzeniami Ministerstwa Zdrowia Federacji Rosyjskiej i obejmuje etap badania przesiewowego (selekcji) na obecność przeciwciał przeciwko wirusowi HIV za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA) metody dopuszczone do stosowania, a etap weryfikacji (potwierdzenia) bardziej szczegółowe badania w laboratorium miejskiego centrum AIDS. Należy zaznaczyć, że nawet najlepsze przesiewowe systemy ELISA nie gwarantują 100% swoistości, czyli istnieje pewne prawdopodobieństwo uzyskania nieswoistego, fałszywie dodatniego wyniku związanego z charakterystyką surowicy krwi pacjenta. Dlatego też pozytywny wynik przesiewowego badania ELISA może nie zostać potwierdzony badaniami potwierdzającymi, po których pacjent otrzyma wynik negatywny lub nieokreślony. Jeżeli wynik badania potwierdzającego jest niepewny, badanie należy powtórzyć po 2-3 tygodniach.

Diagnostyka laboratoryjna zakażenia wirusem HIV u dzieci urodzonych przez matki zakażone wirusem HIV ma swoją własną charakterystykę. Matczyne przeciwciała przeciwko wirusowi HIV (klasa IgG) mogą krążyć w ich krwi do 18 miesięcy od chwili urodzenia. Brak przeciwciał przeciwko wirusowi HIV u noworodków nie oznacza, że ​​wirus nie przedostał się przez barierę łożyskową. Dzieci matek zakażonych wirusem HIV poddawane są badaniom laboratoryjnym w ciągu 36 miesięcy od urodzenia.

Przygotowanie

Nie wymaga specjalnego przygotowania. Zaleca się pobieranie krwi nie wcześniej niż 4 godziny po ostatnim posiłku. Z ogólne zalecenia Aby przygotować się do badań, możesz przeczytać. Wskazane jest wykonanie testu na obecność antygenu i przeciwciał wirusa HIV nie wcześniej niż dwa tygodnie od ewentualnego zakażenia, a w przypadku zakażenia powtórzenie po trzech i sześciu tygodniach. wynik negatywny. Wnioski na badania w INVITRO LLC wypełnia się przy użyciu paszportu lub dokumentu go zastępującego (karta migracyjna, tymczasowa rejestracja w miejscu zamieszkania, legitymacja wojskowa, zaświadczenie z urzędu paszportowego w przypadku utraty paszportu, karta meldunkowa z hotel). Przedstawiony dokument musi koniecznie zawierać informację o czasowej lub stałej rejestracji w Federacji Rosyjskiej oraz zdjęcie. W przypadku braku paszportu (dokumentu go zastępującego) pacjent ma prawo wypełnić anonimowy wniosek o oddanie biomateriału. Podczas anonimowego badania, wniosku i otrzymanej od Klienta próbki biomateriału nadawany jest numer, który jest znany jedynie pacjentowi i personelowi medycznemu składającemu zamówienie. ! Wyniki badań wykonanych anonimowo nie podlegają hospitalizacji, badaniom zawodowym i nie podlegają rejestracji w ORUIB.

Wskazania do stosowania

• Zwiększyć węzły chłonne więcej niż dwa obszary.
• Leukopenia z limfopenią.
• Nocne poty.
• Nagła utrata masy ciała o nieznanej przyczynie.
• Biegunka utrzymująca się dłużej niż trzy tygodnie o nieznanej przyczynie.
• Gorączka o nieznanej przyczynie.
• Planowanie ciąży.
• Przygotowanie przedoperacyjne, hospitalizacja.
• Wykrywanie następujących infekcji lub ich kombinacji: gruźlica, jawna toksoplazmoza, często nawracająca zakażenie wirusem opryszczki, kandydoza narządy wewnętrzne, nawracająca nerwoból, półpasiec wywołany przez mykoplazmy, pneumocystis lub zapalenie płuc wywołane przez Legionellę.
• Mięsak Kaposiego w młodym wieku.
• Przypadkowe kontakty seksualne.

Interpretacja wyników

Interpretacja wyników badań zawiera informację dla lekarza prowadzącego i nie stanowi diagnozy. Informacje zawarte w tej sekcji nie powinny być wykorzystywane do samodzielnej diagnozy lub leczenia. Lekarz na podstawie wyników stawia trafną diagnozę tę ankietę, a także niezbędne informacje z innych źródeł: historia choroby, wyniki innych badań itp.

Jednostki miary w Niezależnym Laboratorium INVITRO: badanie jakościowe. Forma prezentacji wyników: w przypadku braku przeciwciał przeciwko wirusowi HIV 1 i 2 oraz antygenowi p24 odpowiedź brzmi „negatywna”. Jeżeli w przesiewowym teście immunoenzymatycznym wykryto przeciwciała przeciwko HIV lub antygenowi, próbka surowicy wysyłana jest w celu potwierdzenia metodą immunoblottingu do miejskiego ośrodka ds. AIDS, który weryfikuje wyniki pozytywne i nieokreślone.

Wynik pozytywny:

1. zakażenie wirusem HIV;
2. wynik fałszywie dodatni wymagający powtórnych lub dodatkowych badań*);
3. badanie nie ma charakteru informacyjnego dotyczącego dzieci w wieku poniżej 18 miesięcy urodzonych przez matki zakażone wirusem HIV.

*Specyfika systemu testów przesiewowych Przeciwciała przeciwko HIV 1 i 2 oraz antygenom HIV 1 i 2 (HIV Ag/Ab Combo, Abbott), według szacunków dostarczonych przez producenta odczynnika, wynosi około 99,6% zarówno w populacji ogólnej, jak i grupować pacjentów z potencjalnymi zakłóceniami (zakażenia HBV, HCV, różyczka, HAV, EBV, HNLV-I, HTLV-II, E.coli, Chl.trach. itp., patologie autoimmunologiczne(w tym reumatoidalne zapalenie stawów, obecność przeciwciał przeciwjądrowych), ciąża, podwyższony poziom IgG, IgM, gammopatie monoklonalne, hemodializa, wielokrotne transfuzje krwi).