Główne etapy badań wirusologicznych. Badania wirusologiczne. Korzystanie z wehikułu czasu

Badania wirusologiczne w klinice chorób zakaźnych zyskują coraz większe znaczenie wyższa wartość, co wynika przede wszystkim ze wzrostu odsetka infekcji wirusowych, których obraz kliniczny nie zawsze jest typowy. Jednocześnie nie opracowano szybkich i niezawodnych metod diagnostyki wirusologicznej dla wszystkich chorób zakaźnych, wiele z nich jest pracochłonnych i wymaga specjalne warunki, zwierzęta doświadczalne, pożywki hodowlane i przeszkolony personel. Obecnie w celach diagnostycznych infekcje wirusowe Wykorzystują 3 główne typy badań.
1. Badanie mikroskopowe materiału zakaźnego w celu identyfikacji antygenu wirusa lub zmian patognomonicznych w tkankach. Do celów diagnostycznych bezpośrednio badanie mikroskopowe materiał zakaźny od pacjentów wykorzystuje się w przypadku ograniczonej liczby infekcji wirusowych (wścieklizna, ospa wietrzna, żółta febra, opryszczka itp.). Coraz szerzej stosowana jest metoda oparta na detekcji antygenu wirusa za pomocą przeciwciał fluorescencyjnych. Metoda immunofluorescencyjna może być niezawodna tylko wtedy, gdy zostaną ściśle spełnione wszystkie wymagania techniczne.
2. Metody wirusologiczne.
3. Badania serologiczne mające na celu określenie wzrostu miana przeciwciał w trakcie choroby. Metody badań serologicznych są bardziej dostępne w warunkach laboratoryjnych.
Do tych badań konieczne jest pobranie surowicy krwi w ostrym okresie choroby oraz w okresie rekonwalescencji (surowice sparowane). Próbki krwi dla badania serologiczne przyjmowane sterylnie, bez antykoagulantów i konserwantów.
Głównymi etapami badań wirusologicznych jest izolacja wirusów, ich identyfikacja i charakterystyka podstawowych właściwości biologicznych. Obecnie nie ma jednolitej metody izolowania różnych grup wirusów. Wynika to przede wszystkim z różnorodności ich właściwości i specyfiki uprawy poza organizmem gospodarza. Do badań wykorzystuje się biosubstraty (wypłukania błon śluzowych, krwi i jej składników, płynu mózgowo-rdzeniowego, moczu i kału, biopsje narządów i tkanek lub ich fragmentów pobrane podczas sekcji zwłok), które poddaje się specjalnej obróbce, a następnie pasażowaniu materiału. Materiał pobrany do badań należy przechowywać w temperaturze od -20°C do -70°C. W zależności od wstępnej diagnozy obróbka materiału ma swoją własną charakterystykę, ale we wszystkich przypadkach zakłada się uzyskanie substratu maksymalnie oczyszczonego z zanieczyszczeń śluzowych, komórek narządów i tkanek lub ich fragmentów oraz bakterii. Osiąga się to poprzez homogenizację badanego materiału w specjalnej aparacie lub poprzez rozdrobnienie go w moździerzu porcelanowym na zimno ze szkłem kwarcowym (kawałki narządów i tkanek) z dodatkiem sterylnie schłodzonego (+4 C) 0,9 %

roztworem chlorku sodu do uzyskania 10-30% zawiesiny, a następnie wirować przy 1500-3000 obr/min przez 10-15 minut. Otrzymany w ten sposób płyn supernatantu wykorzystuje się do dalszych badań.
Zanim intensywny rozwój oraz wprowadzeniu do powszechnej praktyki metody hodowli tkankowych i komórkowych, stosowano infekcję zwierząt doświadczalnych lub zarodków kurzych. Metody te są stosowane do dziś. Wykrywanie wirusów przy użyciu zwierząt jest najwłaściwsze w przypadkach, gdy możliwe jest odtworzenie typowego obrazu w eksperymencie choroba zakaźna lub jego indywidualne przejawy. Zatem patogeny z grupy arbowirusów i Coxsackie można wykryć poprzez infekcję mózgu ssących myszy, grypę poprzez infekcję zarodków kurzych lub przez donosowe podanie myszom materiału testowego. W laboratoriach wirusologicznych w ostatnie lata Najpowszechniej stosowana stała się metoda hodowli komórkowej i tkankowej, która umożliwia izolację adenowirusów, wirusów opryszczki, syncytialnego wirusa oddechowego, myksowirusów i innych oraz przeprowadzenie diagnostyki etiologicznej choroby już na pierwszych etapach badań. Podstawą tego są dobrze zbadane cechy cytologiczne interakcji większości wirusów i komórek. Zatem infekcja komórek HeLa, Hep-2 materiałem zawierającym adenowirusa typu 2 już w 3 dniu prowadzi do zmiany wzorca wzrostu monowarstwy komórek i pojawienia się typowych komórek w postaci kiści winogron itp. , dobrze widoczne w zwykłym mikroskopie świetlnym przy małym powiększeniu.
Wyjątkowe znaczenie w diagnostyce etiologicznej choroby zakaźnej ma standaryzacja izolacji wirusa z materiału badawczego, która na tym etapie Praca polega na wykorzystaniu genetycznie czystych zwierząt liniowych, z uwzględnieniem ich cech fenotypowych (przede wszystkim wieku). Wynika to przede wszystkim z faktu, że zwierzęta doświadczalne o różnych liniach genetycznych i różnym wieku różnym stopniu podatny na wirusy. I tak, podczas śródmózgowego zakażenia myszy neurotropowym szczepem WSN wirusa grypy, wrażliwość zwierząt linii BALB/c, A, CBA i niekrewnianych była największa; ten sam schemat stwierdzono w przypadku donosowego podania testu materiał. Niezbędny dla ostateczne rezultaty prace nad izolacją wirusa obejmują wstępne badanie zwierząt, zarodków kurzych, hodowli komórkowych i tkankowych pod kątem przenoszenia utajonego wirusa. Zarodki kurze, szeroko stosowane w praktyce laboratoryjnej, mogą zostać zakażone wirusami ptasiej białaczki, ptasiego zapalenia mózgu i rdzenia, zakaźnego zapalenia zatok, papuzicy, rzekomego pomoru drobiu i patogenami niektórych infekcje bakteryjne(dur paratyfusowy itp.), a także mykoplazma. Więcej większa liczba czynniki bakteryjne, a zwłaszcza wirusowe, są zdolne do spontanicznego infekowania hodowanych komórek i tkanek oraz przeżywania w nich. Ich obecność znacząco wpływa na ocenę badanego materiału. Niektóre typy mykoplazm w hodowli komórkowej
może powodować hemaglutynację i hemadsorpcję, a nawet tworzyć łysinki podobne do tych tworzonych przez wirusy pod powłoką agarową. Niemałe znaczenie ma także zanieczyszczenie kultur komórkowych jednego typu innymi, najczęściej jest to związane z komórkami HeLa i obserwuje się je podczas pracy z różnymi typami kultur w tym samym pomieszczeniu, gdy szkło laboratoryjne jest słabo przetworzone itp. Obecność skażenia hodowli komórkowych lub zakażenia zwierząt czynnikami bakteryjnymi, np. Z reguły objawia się to dość wyraźnie (zmiany we wzorcu wzrostu monowarstwy komórek, właściwościach pożywki hodowlanej, śmierć zarodków kurzych lub zwierząt z określonymi objawami itp.) i nie nastręcza szczególnych trudności w ocenie wyników. Sytuacja jest bardziej skomplikowana w przypadku utajonych form infekcji, gdzie wymagane jest zastosowanie metod serologicznych i innych. Zalecenia te należy uwzględnić w pracy wirusologa, zwłaszcza przy przeprowadzaniu diagnostyki etiologicznej niejasnych przypadków choroby.

Metody badań wirusologicznych

metody badania biologii wirusów i ich identyfikacji. W wirusologii szeroko stosowane są metody biologii molekularnej, za pomocą których udało się ustalić strukturę molekularną cząstek wirusa, metody ich przenikania do komórki i cechy reprodukcji wirusa, pierwotną strukturę wirusowych kwasów nukleinowych i białek. Trwają prace nad metodami określania sekwencji elementów składowych wirusowych kwasów nukleinowych i aminokwasów białkowych. Możliwe staje się powiązanie funkcji kwasów nukleinowych i kodowanych przez nie białek z sekwencją nukleotydów oraz ustalenie przyczyn procesów wewnątrzkomórkowych odgrywających ważną rolę w patogenezie infekcji wirusowej.

Metody badań wirusologicznych opierają się również na procesach immunologicznych (oddziaływanie antygenu z przeciwciałami), właściwościach biologicznych wirusa (zdolność do hemaglutynacji, hemolizy, aktywność enzymatyczna), cechach interakcji wirusa z komórką gospodarza (charakter efektu cytopatycznego , tworzenie wtrętów wewnątrzkomórkowych itp.).

W diagnostyce infekcji wirusowych, w hodowli, izolacji i identyfikacji wirusów, a także w produkcji preparatów szczepionkowych, szeroko stosuje się metodę hodowli tkankowej i komórkowej. Stosuje się pierwotne, wtórne, stabilne, ciągłe i diploidalne hodowle komórkowe. Hodowle pierwotne uzyskuje się poprzez zdyspergowanie tkanki za pomocą enzymów proteolitycznych (trypsyna, kolagenaza). Źródłem komórek mogą być tkanki i narządy (najczęściej nerki) zarodków ludzkich i zwierzęcych. Zawiesinę komórek w pożywce umieszcza się w tzw. materacykach, butelkach lub szalkach Petriego, gdzie po przyczepieniu do powierzchni naczynia komórki zaczynają się namnażać. W przypadku infekcji wirusowej zwykle stosuje się monowarstwę komórkową. Pożywkę odsącza się, dodaje się zawiesinę wirusa w określonych rozcieńczeniach, a po kontakcie z komórkami dodaje się świeżą pożywkę, zwykle bez surowicy.

Komórki większości kultur pierwotnych można hodować wtórnie; taką hodowlę nazywa się hodowlą wtórną. Wraz z dalszym pasażem komórek tworzy się populacja komórek podobnych do fibroblastów, zdolna do szybkiej reprodukcji, większość który zachowuje oryginalny zestaw chromosomów. Są to tak zwane komórki diploidalne. Przez seryjną hodowlę komórek uzyskuje się stabilne, ciągłe hodowle komórkowe. Podczas pasaży pojawiają się szybko dzielące się jednorodne komórki z heteroploidalnym zestawem chromosomów. Stabilne linie komórkowe mogą być jednowarstwowe lub zawieszone. Kultury jednowarstwowe rosną w postaci ciągłej warstwy na powierzchni szkła, natomiast kultury zawiesinowe rosną w postaci zawiesin w różnych naczyniach za pomocą urządzeń mieszających. Istnieje ponad 400 linii komórkowych pochodzących z 40 różne rodzaje zwierzęta (w tym naczelne, ptaki, gady, płazy, ryby, owady) i ludzie.

Fragmenty poszczególnych narządów i tkanek (hodowle narządów) można hodować w sztucznych pożywkach. Hodowle tego typu zachowują strukturę tkanki, co jest szczególnie ważne w przypadku izolacji i pasażu wirusów, które nie rozmnażają się w niezróżnicowanych kulturach tkankowych (na przykład koronawirusów).

W zakażonych hodowlach komórkowych wirusy można wykryć na podstawie zmian w morfologii komórek, efektów cytopatycznych, które mogą być specyficzne, pojawienia się wtrąceń, poprzez oznaczenie antygenów wirusowych w komórce i płynie hodowlanym; ustalanie właściwości biologicznych potomstwa wirusa w płynie hodowlanym i miareczkowanie wirusów w hodowli tkankowej, zarodkach kurzych lub wrażliwych zwierzętach; poprzez identyfikację poszczególnych wirusowych kwasów nukleinowych w komórkach poprzez hybrydyzację molekularną lub akumulację kwasów nukleinowych metodą cytochemiczną z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej.

Izolowanie wirusów jest procesem pracochłonnym i czasochłonnym. Przeprowadza się go w celu określenia rodzaju lub wariantu wirusa krążącego w populacji (na przykład w celu identyfikacji serowarianta wirusa grypy, dzikiego lub szczepionkowego szczepu wirusa polio itp.); w przypadkach, gdy konieczne jest podjęcie pilnych działań epidemiologicznych; kiedy pojawiają się nowe typy lub warianty wirusów; w razie potrzeby potwierdź wstępną diagnozę; do wskazywania wirusów w obiektach środowisko. Izolując wirusy, bierze się pod uwagę możliwość ich utrzymywania się w organizmie człowieka, a także wystąpienie infekcji mieszanej wywołanej przez dwa lub więcej wirusów. Genetycznie jednorodna populacja wirusa uzyskana z jednego wirionu nazywana jest klonem wirusa, a proces jej uzyskiwania nazywa się klonowaniem.

Do izolacji wirusów stosuje się infekcję podatnych zwierząt laboratoryjnych i zarodków kurzych, ale najczęściej stosuje się hodowlę tkankową. Obecność wirusa zwykle określa się na podstawie specyficznej degeneracji komórek (efekt cytopatyczny), tworzenia symplastów i syncytii, wykrywania wtrętów wewnątrzkomórkowych, a także specyficznego antygenu wykrywanego za pomocą immunofluorescencji, hemadsorpcji, hemaglutynacji (w przypadku wirusów hemaglutynujących) itp. . Objawy te można wykryć dopiero po 2-3 pasażach wirusa.

Do wyizolowania szeregu wirusów, takich jak wirusy grypy, stosuje się zarodki kurze, a do izolowania niektórych wirusów Coxsackie i szeregu arbowirusów wykorzystuje się nowonarodzone myszy. Identyfikację izolowanych wirusów przeprowadza się za pomocą reakcje serologiczne i inne metody.

Podczas pracy z wirusami określa się ich miano. Miareczkowanie wirusów zwykle przeprowadza się w hodowli tkankowej, określając najwyższe rozcieńczenie cieczy zawierającej wirusa, przy którym następuje degeneracja tkanki, powstają wtrącenia i antygeny specyficzne dla wirusa. Metodę łysinkową można zastosować do miareczkowania wielu wirusów. Płytki lub negatywne kolonie wirusów to ogniska komórek zniszczonych przez wirusa w jednowarstwowej hodowli tkankowej pod powłoką agarową. Pozwala na to liczenie kolonii analiza ilościowa aktywność zakaźna wirusów w oparciu o obliczenie, że jedna zakaźna cząsteczka wirusa tworzy jedną łysinkę. Płytki wykrywa się poprzez barwienie hodowli barwnikami dożylnymi, zwykle neutralną czerwienią; płytki nie adsorbują barwnika i dlatego są widoczne jako jasne plamki na tle wybarwionych żywych komórek. Miano wirusa wyraża się jako liczbę jednostek tworzących łysinki na 1 ml.

Oczyszczanie i zagęszczanie wirusów zwykle przeprowadza się poprzez ultrawirowanie różnicowe, a następnie wirowanie w gradiencie stężenia lub gęstości. Do oczyszczania wirusów stosuje się metody immunologiczne, chromatografię jonowymienną, immunosorbenty itp.

Diagnostyka laboratoryjna infekcji wirusowych obejmuje wykrycie patogenu lub jego składników w materiale klinicznym; izolowanie wirusa z tego materiału; serodiagnoza. Wybór metody diagnostyki laboratoryjnej w każdym z nich szczególny przypadek zależy od charakteru choroby, okresu choroby i możliwości laboratorium. Nowoczesna diagnostyka infekcji wirusowych opiera się na metodach ekspresowych, które pozwalają uzyskać odpowiedź już w kilka godzin po pobraniu materiału klinicznego wczesne daty po chorobie, Należą do nich mikroskopia elektronowa i immunologiczna, a także immunofluorescencja, metoda hybrydyzacji molekularnej, wykrywanie przeciwciał klasy IgM itp.

Mikroskopia elektronowa wirusów wybarwionych ujemnie umożliwia różnicowanie wirusów i określenie ich stężenia. Zastosowanie mikroskopii elektronowej w diagnostyce infekcji wirusowych ogranicza się do przypadków, w których stężenie cząstek wirusa w materiale klinicznym jest dość wysokie (10 5 w 1 ml i wyżej). Wadą tej metody jest brak możliwości rozróżnienia wirusów należących do tej samej grupy taksonomicznej. Niedobór ten można przezwyciężyć poprzez zastosowanie immunologicznej mikroskopii elektronowej. Metoda polega na tworzeniu kompleksów immunologicznych poprzez dodanie specyficznej surowicy do cząstek wirusa, przy jednoczesnym zagęszczeniu cząstek wirusa, co pozwala na ich identyfikację. Metodę tę stosuje się także do wykrywania przeciwciał. W celu wyraźnej diagnostyki przeprowadza się badanie mikroskopem elektronowym ekstraktów tkankowych, kału, płynu z pęcherzyków i wydzieliny z nosogardzieli. Do badania morfogenezy wirusa szeroko wykorzystuje się mikroskopię elektronową, której możliwości poszerza się dzięki zastosowaniu znakowanych przeciwciał.

Metoda hybrydyzacji molekularnej, oparta na wykrywaniu specyficznych dla wirusa kwasów nukleinowych, umożliwia wykrywanie pojedynczych kopii genów i nie ma sobie równych pod względem czułości. Reakcja polega na hybrydyzacji komplementarnych nici DNA lub RNA (sondach) i utworzeniu struktur dwuniciowych. Najtańszą sondą jest sklonowany rekombinowany DNA. Sonda jest znakowana prekursorami radioaktywnymi (najczęściej radioaktywnym fosforem). Obiecujące jest zastosowanie reakcji kolorymetrycznych. Istnieje kilka opcji hybrydyzacji molekularnej: hybrydyzacja punktowa, hybrydyzacja blot, hybrydyzacja kanapkowa, hybrydyzacja in situ itp.

Przeciwciała klasy IgM pojawiają się wcześniej niż przeciwciała klasy G (w 3-5 dniu choroby) i znikają po kilku tygodniach, więc ich wykrycie wskazuje na świeżą infekcję. Przeciwciała klasy IgM wykrywa się metodą immunofluorescencji lub za pomocą test immunologiczny enzymatyczny przy użyciu antysurowic anty-μ (surowic anty-IgM przeciwko łańcuchom ciężkim).

Metody serologiczne w wirusologii opierają się na klasycznych reakcjach immunologicznych (patrz Immunologiczne metody badań) : reakcje wiązania dopełniacza, hamowanie hemaglutynacji, neutralizacja biologiczna, immunodyfuzja, hemaglutynacja pośrednia, hemoliza promieniowa, immunofluorescencja, test immunologiczny enzymatyczny, test radioimmunologiczny. Opracowano mikrometody wielu reakcji, a ich techniki są stale udoskonalane. Metody te służą do identyfikacji wirusów przy pomocy zestawu znanych surowic oraz do serodiagnostyki w celu określenia wzrostu przeciwciał w drugiej surowicy w porównaniu do pierwszej (pierwszą surowicę pobiera się w pierwszych dniach po chorobie, drugą - po 2- 3 tygodnie). Wartość diagnostyczną stanowi nie mniej niż czterokrotny wzrost przeciwciał w drugiej surowicy. Jeśli wykrycie przeciwciał klasy IgM wskazuje na niedawną infekcję, wówczas przeciwciała klasy IgC utrzymują się przez kilka lat, a czasem przez całe życie.

Aby zidentyfikować poszczególne antygeny wirusów i przeciwciała przeciwko nim w złożonych mieszaninach bez wstępnego oczyszczania białek, stosuje się immunoblotting. Metoda łączy frakcjonowanie białek metodą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z późniejszą immunoindykacją białek metodą enzymatyczną. Separacja białek zmniejsza wymagania dotyczące czystości chemicznej antygenu i umożliwia identyfikację poszczególnych par antygen-przeciwciało. To zadanie jest istotne na przykład w serodiagnostyce zakażenia wirusem HIV, gdy jest fałszywe pozytywne reakcje testów immunologicznych enzymatycznych spowodowane są obecnością przeciwciał przeciwko antygenom komórkowym, które powstają w wyniku niedostatecznego oczyszczenia białek wirusowych. Identyfikacja przeciwciał w surowicy pacjentów przeciwko wewnętrznym i zewnętrznym antygenom wirusowym pozwala określić stopień zaawansowania choroby, a w przypadku analizy populacji zmienność białek wirusowych. Immunoblotting w przypadku zakażenia wirusem HIV służy jako test potwierdzający w celu identyfikacji poszczególnych antygenów wirusowych i przeciwciał przeciwko nim. Analizując populacje, metodę stosuje się do określenia zmienności białek wirusowych. Ogromną wartością metody jest możliwość analizy antygenów syntetyzowanych przy użyciu technologii rekombinacji DNA, ustalenia ich wielkości oraz obecności determinant antygenowych.

Badania wirusologiczne to badania mające na celu izolację wirusów i badanie ich właściwości, a także ustalenie etiologicznego powiązania wirusów z określonymi chorobami.

Materiał do badań pobierany jest w zależności od lokalizacji dominujących wirusów w organizmie pacjenta oraz dróg ich uwalniania do środowiska zewnętrznego. Materiał pobiera się do sterylnych pojemników, jak najszybciej dostarcza do laboratorium i przechowuje w postaci zamrożonej lub w lodzie do czasu badania. Przed użyciem materiał do izolacji wirusa jest przetwarzany (i) w celu stłumienia obcej mikroflory i przetwarzany w celu usunięcia dużych cząstek.

Wirusy izoluje się poprzez infekowanie zwierząt laboratoryjnych, zarodków kurzych i kultur tkankowych materiałem zawierającym wirusa. Wybór metody izolacji zależy od podejrzanego czynnika sprawczego choroby. Zatem hodowle tkankowe (patrz) są stosowane podczas pracy z wirusami, które nie są chorobotwórcze dla zwierząt laboratoryjnych lub gdy są wykrywane w hodowli tkankowej wcześniej niż podczas zakażania zwierząt. Zarodki kurze są infekowane w celu izolacji patogenów, zakaźnej świnki (w jamach owodniowych i omoczniowych), (w woreczku żółtkowym), ospy prawdziwej (w błonie kosmówkowo-moczniowej).

Wśród zwierząt laboratoryjnych do izolacji wirusów najczęściej wykorzystuje się myszy białe, następnie króliki, szczury, świnki morskie, małpy. W przypadku arbowirusów najskuteczniejsze jest wprowadzenie materiału zawierającego wirusa do głowy lub w przypadku wirusów pneumotropowych na błonę śluzową drogi oddechowe, w przypadku wirusów ospy, - na stwardniałej rogówce.

Izolacja wirusa jest najskuteczniejsza w ostry okres choroby. Istotnym punktem w ustaleniu wirusowego charakteru choroby są wyniki badań serologicznych surowic pobranych wielokrotnie od tego samego pacjenta na początku choroby oraz w okresie rekonwalescencji. Wykrycie w drugiej surowicy przeciwciał przeciwko wyizolowanym wirusom w mianie 4 lub więcej razy większym niż w pierwszej surowicy wskazuje na etiologiczny związek wirusów z tą chorobą.

Wczesne i szybka metoda wykrywanie antygenów wirusowych to metoda wykorzystująca przeciwciała fluorescencyjne, polegająca na specyficznym wiązaniu przeciwciał znakowanych fluorochromem na powierzchni antygenu. Antygen można łatwo wykryć za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (patrz) ze względu na jasną fluorescencję przeciwciał zaadsorbowanych na antygenie. Metodę przeciwciał fluorescencyjnych wykorzystuje się do badania wymazów pobranych od pacjentów, skrawków histologicznych zajętych tkanek oraz preparatów hodowli tkankowych. Służą również do wykrywania ciał elementarnych (wirionów) (patrz). Wśród innych metod morfologicznych stosuje się te, które wykrywają wewnątrzkomórkowe wtręty wirusowe w skrawkach dotkniętych narządów i tkanek. Wykrycie wtrętów wskazuje na infekcję, a w niektórych przypadkach pomaga w rozpoznaniu choroby wirusowej. Różne są stosowane do wykrywania przeciwciał wirusowych we krwi pacjentów i badania struktury antygenowej wirusów. Reakcję neutralizacji stosuje się w przypadku prawie wszystkich infekcji wirusowych. Opiera się na zdolności przeciwciał immunologicznych do neutralizowania zakaźnych właściwości wirusów po wprowadzeniu mieszaniny do organizmu podatnych zwierząt lub do hodowli tkankowej. Aby określić wskaźnik neutralizacji, stałą dawkę surowicy miesza się z różnymi rozcieńczeniami wirusów, a w celu określenia miana przeciwciał miesza się różne rozcieńczenia surowicy ze stałą dawką wirusów. Kontrolą jest zakażenie zwierząt (lub hodowla tkankowa) mieszaniną wirusów z normalną surowicą lub z roztwór soli. Reakcję neutralizacji przeprowadza się nie tylko w celu wykrycia przeciwciał, ale także w celu określenia rodzaju i rodzaju wirusów.

Reakcję wiązania dopełniacza [na przykład reakcję Bordeta-Giangou (patrz)] wykorzystuje się do wykrywania zarówno antygenów wirusowych, jak i przeciwciał. W pierwszym przypadku reakcja polega na oddziaływaniu znanej surowicy odpornościowej z materiałem, w którym zakłada się obecność antygenów: surowicą krwi, wymazami z nosogardzieli, ekstraktami tkankowymi zakażonego organizmu. W drugim przypadku - znany antygen (diagnosticum) i surowica pacjenta lub rekonwalescencji.

RSK służy do diagnostyki chorób wywoływanych przez wirusy grypy, wirusy ospy, adenowirusy i arbowirusy.

W diagnostyka laboratoryjna infekcji wirusowych istnieją trzy główne podejścia

1) bezpośrednie badanie materiału na obecność antygenu wirusowego lub kwasów nukleinowych;

2) izolacja i identyfikacja wirusa z materiału klinicznego;

Bezpośrednie metody diagnozowania materiału klinicznego

Metody bezpośrednie to metody, które pozwalają na wykrycie wirusa, antygenu wirusa lub wirusowego kwasu nukleinowego (NA) bezpośrednio w materiale klinicznym, czyli są najszybsze (2–24 godziny).

Mikroskopia elektronowa (EM). Za pomocą tej metody możesz wykryć samego wirusa.

immunologiczna mikroskopia elektronowa (IEM), która wykorzystuje specyficzne przeciwciała przeciwko wirusom. W wyniku oddziaływania przeciwciał z wirusami tworzą się kompleksy, które łatwiej wykryć po ujemnym kontraście.

Reakcja immunofluorescencyjna (RIF). Metoda opiera się na wykorzystaniu przeciwciał związanych z barwnikiem

Metoda RIF jest szeroko stosowana do szybkiego rozszyfrowania etiologii ostrych infekcji wirusowych dróg oddechowych podczas analizy rozmazów linii papilarnych z błony śluzowej górnych dróg oddechowych.

Test immunoenzymatyczny (ELISA). Metody testów immunoenzymatycznych służące do oznaczania antygenów wirusowych są w zasadzie podobne do metod RIF, ale opierają się na znakowaniu przeciwciał enzymami, a nie barwnikami.

Test radioimmunologiczny (RIA). Metoda polega na znakowaniu przeciwciał radioizotopami, co zapewnia wysoką czułość w oznaczaniu antygenu wirusa.

Metody molekularne. Początkowo wysoce specyficzną metodę hybrydyzacji NK uważano za klasyczną metodę identyfikacji genomu wirusa, obecnie coraz częściej stosuje się izolację genomów wirusa przy użyciu polimerazy. reakcja łańcuchowa(PCR).

Hybrydyzacja molekularna kwasów nukleinowych. Metoda polega na hybrydyzacji komplementarnych nici DNA lub RNA z utworzeniem struktur dwuniciowych i ich identyfikacji

PCR opiera się na zasadzie naturalnej replikacji DNA. Istotą metody jest powtarzanie wielokrotnych cykli syntezy (amplifikacji) specyficznej dla wirusa sekwencji DNA z wykorzystaniem termostabilnej polimerazy DNA Taq i dwóch specyficznych starterów – tzw. starterów.

Metody cytologiczne mają obecnie ograniczone możliwości wartość diagnostyczna, ale w przypadku wielu infekcji należy je nadal stosować. Badane są materiały z sekcji zwłok, biopsje i rozmazy, które po odpowiedniej obróbce są barwione i analizowane pod mikroskopem.

Do skutecznej izolacji wirusa materiał kliniczny należy podjąć zgodnie z patogenezą podejrzewanej choroby i w najwcześniejszym możliwym terminie.

Z reguły biorą:

– przy infekcjach dróg oddechowych – płukanie nosogardzieli;

– przy infekcjach enterowirusowych – wydzieliny i kał (reo-, enterowirusy);

– w przypadku zmian skórnych i błon śluzowych – zeskrobiny, zawartość pęcherzy (opryszczka, ospa wietrzna);

– przy infekcjach wykwitowych – popłuczyny (odra, różyczka);

– w przypadku infekcji arbowirusowych – krew, płyn mózgowo-rdzeniowy.

Do izolacji wirusów wykorzystuje się hodowle komórkowe, zwierzęta laboratoryjne i zarodki kurze. Proces jest długotrwały i czasami wymaga kilku pasaży, zanim wirus zostanie wykryty i zidentyfikowany przy użyciu jednej lub więcej metod – reakcji neutralizacji (RN), RIF, ELISA lub PCR.

Serodiagnoza

Diagnostyka serologiczna, oparta na reakcji antygen-przeciwciało, może być wykorzystana do określenia obu czynników i odgrywa rolę w ustaleniu etiologii infekcji wirusowej nawet w przypadku wyniki negatywne izolacja wirusa.

RSK jest jednym z tradycyjnych testów serologicznych i służy do diagnozowania wielu infekcji wirusowych. W reakcji biorą udział dwa układy: przeciwciała z surowicy pacjenta + wirus standardowy i czerwone krwinki owiec + przeciwciała przeciwko nim oraz miareczkowany dopełniacz. Jeśli przeciwciała i wirus pasują, kompleks ten wiąże dopełniacz i nie następuje liza czerwonych krwinek owiec (reakcja pozytywna). Przy ujemnym RSC dopełniacz sprzyja lizie erytrocytów. Wadą tej metody jest niewystarczająco wysoka czułość i trudność standaryzacji odczynników.Metoda IF, podobnie jak ELISA, służy do oznaczania przeciwciał w surowicy.

Badania w celu diagnostyki chorób o charakterze wirusowym. Jest to konieczne do zidentyfikowania wirusa, zbadania jego biologii i zdolności do oddziaływania na komórki zwierzęce i ludzkie. W ten sposób możliwe staje się zrozumienie patogenezy choroby wirusowe i odpowiednio wybrać odpowiednią metodę leczenia.

Jaka jest diagnoza?

W żywych komórkach. Aby go zbadać, należy go uprawiać na poziomie organizmu doświadczalnego lub w tym celu w praktyka lekarska i ogólnie mikrobiologia, prowadzone są wirusologiczne metody badawcze, które mają następujące główne podejścia:

prosty;
pośredni;
serologiczne.

Materiał można bezpośrednio zbadać pod kątem obecności kwasów nukleinowych, antygenu wirusa lub np. wirusa można wyizolować i zidentyfikować z materiału klinicznego.

Oprócz możliwości ustalenia etiologii choroby i monitorowania efektu terapeutycznego, metody badań wirusologicznych odgrywają ważną rolę w działaniach przeciwepidemicznych. Do izolacji wykorzystuje się zarodki kurze, zwierzęta laboratoryjne lub hodowle komórkowe.

Jak to jest badane?

Najszybsza jest metoda bezpośrednia. Pozwala wykryć wirusa, antygen lub NA (kwas nukleinowy) w samym materiale klinicznym. Zajmuje to od dwóch godzin do jednego dnia.

EM - mikroskopia elektronowa. Bezpośrednio wykrywa wirusa.
IEM - immunologiczna mikroskopia elektronowa. Wykorzystuje specyficzne przeciwciała przeciwko wirusom.
RIF – reakcja immunofluorescencyjna. Wykorzystuje przeciwciała związane z barwnikiem. Takie wirusologiczne metody badań są szeroko stosowane w celu szybkiego rozszyfrowania etiologii ARVI (ostrych wirusowych infekcji dróg oddechowych), gdy pobiera się rozmazy linii papilarnych z błony śluzowej górnych dróg oddechowych.
ELISA – enzymatyczny test immunoenzymatyczny – oznaczanie antygenów wirusowych na wzór RIF, ale oparty na znakowaniu przeciwciał enzymami.
RIA - test radioimmunologiczny. Wykorzystuje radioznakowanie przeciwciał, aby zapewnić wysoką czułość w wykrywaniu antygenu wirusowego.
Molekularna - hybrydyzacja NK lub izolacja genomów wirusa metodą PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy).
Cytologia jest rzadko stosowana, ale w przypadku niektórych infekcji te wirusologiczne metody badawcze są bardzo skuteczne. Badane są materiały biopsyjne, autopsje i wymazy przygotowane do barwienia i analizy pod mikroskopem.

Jaki jest sens badań?

Aby skutecznie wyizolować wirusy, materiał kliniczny pobiera się zgodnie z patogenezą i możliwie najwcześniej. Często proces ten wymaga kilku przejść przed zastosowaniem określonych metod badań wirusologicznych.

Mikrobiologia to nauka o mikroskopijnych stworzeniach. A jej dziedzina to nie tylko medycyna. Jest to nauka podstawowa Rolnictwo, weterynaria, przemysł kosmiczny i techniczny, geologia.

Ale oczywiście wszystko zostało stworzone z myślą o człowieku i jego rozwoju na tej pięknej planecie. Dlatego bardzo ważne jest, aby w porę wykryć zagrożenie i je zneutralizować. Wirusy różnią się od bakterii. Są to struktury, które przedostają się do organizmu i powodują powstawanie nowego pokolenia. Wyglądają jak kryształy i mają na celu kontrolowanie procesu ich rozmnażania, chociaż same nie żywią się, nie rosną i nie wydzielają produktów przemiany materii.

Wirus może wywołać ciężką chorobę w każdym żywym organizmie, do którego przedostanie się. Co więcej, może ewoluować. Dlatego należy rozwijać i udoskonalać metody badań wirusologicznych w mikrobiologii, gdyż cywilizacja ludzka jako całość może być zagrożona.

Materiały

Aby wykryć i zidentyfikować wirusy w medycynie, z reguły podejmuje się:

płukanie nosogardzieli ( infekcje dróg oddechowych);
spłukanie i kał ( zakażenia enterowirusami);
zeskrobiny, zawartość pęcherzy (zmiany skórne, błony śluzowe, np. opryszczka, ospa wietrzna);
uderzenia gorąca (zakażenia wysypkowe, takie jak odra, różyczka);
krew, płyn mózgowo-rdzeniowy (zakażenia arbowirusami).

Fazy

Wszystkie etapy metody badań wirusologicznych obejmują:

zbieranie materiału;
selekcja, uzyskanie systemu testowego, określenie jego żywotności;
infekcja systemu testowego;
wskazanie wirusa;
określenie rodzaju wirusa.

Zasadniczo wirusy chorobotwórcze różnią się obecnością specyficzności tkankowej i typu. Weźmy na przykład wirusa polio, który rozmnaża się wyłącznie u naczelnych (w ich komórkach). Odpowiednio, do wyizolowania określonego wirusa stosuje się specyficzną hodowlę tkankową. Jeśli mówimy o nieznanym patogenie, wskazane byłoby jednoczesne zainfekowanie trzech, a najlepiej czterech kultur komórkowych.

Być może więc któryś z nich będzie wrażliwy. Aby określić obecność wirusa w zakażonych kulturach, bada się rozwój specyficznej degeneracji komórek, wtręty wewnątrzkomórkowe, identyfikację specyficznego antygenu, dodatnią reakcję hemaglutynacji i hemadsorpcji.

Wszystkie metody badań wirusologicznych (bezpośrednie i pośrednie, serologiczne) należy dobierać jako najwłaściwsze dla konkretnego przypadku podejrzenia zakażenia.

Metody pośrednie opierają się na izolacji i identyfikacji wirusa. Są pracochłonne, czasochłonne, ale dokładne.

Serodiagnoza

Diagnoza ta odnosi się do metody opartej na reakcji antygen-przeciwciało. Najczęściej wykorzystuje się surowice krwi sparowane, pobierane w odstępach kilkutygodniowych. Jeśli miano przeciwciał wzrośnie 4 lub więcej razy, reakcję uważa się za pozytywną. Aby określić specyficzność typu wirusa, stosuje się reakcję neutralizacji wirusa. Aby określić specyficzność grupy, konieczne jest uzyskanie reakcji wiązania dopełniacza.

Popularne różne opcje test immunologiczny enzymatyczny, reakcja hamowania hemaglutynacji, bierna hemaglutynacja, odwrotna hemaglutynacja bierna, RIF. Nawet w inżynierii genetycznej opracowano metodę wytwarzania przeciwciał monoklonalnych. Wąską specyficzność monoklonów można przezwyciężyć, stosując kilka przeciwciał monoklonalnych przeciwko różnym determinantom wirusowym. Tym samym zwiększono swoistość i czułość testu na wykrywanie antygenu.

Niektóre funkcje

Obecnie stworzono wiele różnych systemów testowych do diagnostyki immunologicznej infekcji wynikających z przedostania się wirusa do żywego organizmu.

Zatem wirusologiczne metody badawcze to metody izolacji wirusów, badania ich właściwości i ustalania ich etiologicznego związku z określonymi chorobami.