Immunoblotting (wykrywanie przeciwciał w surowicy pacjenta przeciwko określonym antygenom patogenu). Jak diagnozuje się AIDS metodą immunoblottingu na HIV III. Immunochemiczne barwienie białek unieruchomionych na membranie nitrocelulozowej

Co to jest immunoblot? Jest to powszechna metoda diagnostyka laboratoryjna infekcje wirusowe osoba. Jest uważana za jedną z najdokładniejszych i najbardziej niezawodnych metod wykrywania obecności wirusa HIV. W swojej wiarygodności przewyższa nawet wyniki immunoblotów, które są uważane za niepodważalne i ostateczne.

informacje ogólne

Immunoblot – co to jest? Aby rozpoznać zakażenie wirusem HIV u danej osoby, konieczne jest wykonanie laboratoryjnego badania surowicy krwi na obecność przeciwciał. Technika immunoblottingu nazywana jest również metodą Western blot. Służy do wykrywania ludzkich infekcji wirusowych jako dodatkowa metoda ekspercka. Konieczne jest potwierdzenie testu ELISA – badania laboratoryjnego, które pozwala określić obecność przeciwciał HIV we krwi. Sprawdź ponownie za pomocą immunoblottingu pozytywny test ELISA. Uważany jest za najbardziej wrażliwy, złożony i kosztowny.

Zamiar

Co to jest immunoblot? Jest to laboratoryjna metoda badania surowicy krwi na obecność przeciwciał przeciwko wirusowi. Podczas badania specjalista najpierw oddziela białka wirusowe w żelu i przenosi je na membranę nitrocelulozową. Procedura immunoblottingu ma na celu wykrycie wirusa HIV różne etapy. W pierwszym etapie oczyszczony wirus z jego części składowych poddawany jest elektroforezie, a antygeny zawarte w jego składzie oddzielane są według masy cząsteczkowej.

Rozmnaża się w żywej komórce, osadzając w niej swoją informację genetyczną. Na tym etapie osoba staje się nosicielem wirusa HIV, jeśli została zakażona. Specyfika choroby polega na tym, że przez długi czas może w ogóle się nie pokazać. Wirus niszczy limfocyty, przez co odporność człowieka spada, a organizm nie jest w stanie przeciwstawić się infekcjom. Jeśli HIV będzie leczony prawidłowo i na czas, pacjent dożyje sędziwego wieku. Brak terapii nieuchronnie prowadzi do fatalny wynik. Od momentu zakażenia, ale bez leczenia, maksymalna długość życia wynosi nie więcej niż dziesięć lat.

Osobliwości

Analiza immunoblot jest niezawodną metodą, która pozwala określić obecność przeciwciał przeciwko antygenom HIV pierwszego i drugiego typu. Jeśli dana osoba jest zarażona, w ciągu dwóch tygodni pojawiają się przeciwciała, które można wykryć znacznie później. Osobliwością wirusa HIV jest to, że ilość przeciwciał szybko wzrasta i pozostaje we krwi pacjenta. Nawet jeśli są obecne, choroba może nie ujawnić się przez dwa lub więcej lat. Metoda ELISA nie zawsze pozwala dokładnie określić obecność choroby, dlatego w przypadku pozytywnego wyniku testu immunologicznego enzymatycznego konieczne jest potwierdzenie wyników za pomocą immunoblottingu i PCR.

Wskazania do stosowania

Odkryto już, czym jest „immunoblot”, ale dla kogo jest przepisane to badanie? Powodem wykonania badania metodą immunoblottingu jest pozytywny wynik testu ELISA. U pacjentów poddawanych operacji konieczne jest wykonanie testu immunoenzymatycznego. Ponadto powinny się przebadać kobiety planujące ciążę, a także wszystkie osoby, u których występują zaburzenia. życie seksualne. Immunoblotting jest przepisywany pacjentom zakażonym wirusem HIV, jeśli wyniki testu ELISA są wątpliwe. Powodami konsultacji z lekarzem mogą być: niepokojące objawy:

nagła utrata masy ciała;
osłabienie, utrata wydajności;
rozstrój jelit (biegunka) utrzymujący się przez trzy tygodnie;
odwodnienie organizmu;
gorączka;
zwiększyć węzły chłonne na ciele;
rozwój kandydozy, gruźlicy, zapalenia płuc, toksoplazmozy, zaostrzenia opryszczki.

Pacjent nie musi przygotowywać się przed badaniem krew żylna. Nie należy jeść jedzenia na 8-10 godzin przed badaniem. Na dzień przed oddaniem krwi nie zaleca się spożywania napojów alkoholowych, kawowych, wykonywania forsownych ćwiczeń fizycznych ani odczuwania niepokoju.

Gdzie przeprowadzić analizę?

Gdzie mogę wykonać test na HIV? Badania ELISA i immunoblot przeprowadzane są w prywatnych klinikach miejskich, wyniki wydawane są w ciągu 24 godzin. Możliwa jest także pilna diagnoza. W publicznych placówkach medycznych badania ELISA i immunobloting przeprowadzane są bezpłatnie, zgodnie z ustawodawstwem Federacji Rosyjskiej. Sprawdzenie jest obowiązkowe choroba zakaźna kobiety w ciąży, a także pacjenci w trakcie hospitalizacji lub operacji.

Jak przebiega badanie?

Jak przeprowadzana jest analiza ELISA? Pozytywny/ujemny immunoblot potwierdza lub zaprzecza wynikom testu immunologicznego enzymatycznego. Procedura badawcza jest dość prosta. Specjalista pobiera krew żylną, co zajmuje nie więcej niż pięć minut. Po pobraniu próbek miejsce wstrzyknięcia należy zdezynfekować i okleić bandażem. Pobieranie próbek odbywa się na czczo, więc po zabiegu nie zaszkodzi zjeść tabliczkę ciemnej czekolady lub wypić słodki, gorący napój.

Aby otrzymać skierowanie na bezpłatne badanie w publicznej placówce medycznej należy udać się do lekarza pierwszego kontaktu. Generalnie immunoblot nie różni się od innych badań krwi sposobem pobierania próbek. Metodologia badań jest prosta. Jeśli we krwi danej osoby znajduje się wirus, organizm zaczyna wytwarzać przeciwciała, aby go zniszczyć. Każdy wirus ma swój własny zestaw białek antygenowych. Wykrywanie tych przeciwciał jest podstawą techniki immunoblottingu.

Cena

Ile kosztuje analiza? Immunoblot na HIV nie jest tanim testem. Średnio badanie przesiewowe z wykorzystaniem metod immunoenzymatycznych kosztuje od 500 do 900 rubli. Immunoblotting to badanie weryfikacyjne, którego koszt wynosi od trzech do pięciu tysięcy rubli. Więcej złożone metody są dużo droższe. Na przykład będziesz musiał zapłacić około 12 000 rubli.

Interpretacja wyniku

Najczęstszymi metodami diagnozowania zakażenia wirusem HIV są testy immunoenzymatyczne i immunobloty. Służą do oznaczania przeciwciał przeciwko wirusowi niedoboru odporności w surowicy krwi. Obecność zakażenia potwierdza się zwykle dwoma badaniami: przesiewowym i potwierdzającym. Interpretacji wyników badania powinien dokonać lekarz, który jednocześnie stawia diagnozę i przepisuje leczenie. Jeśli wynik immunoblotu jest pozytywny, oznacza to, że w organizmie człowieka obecny jest wirus.

Pozytywny wynik nie powinien być powodem samoleczenie, ponieważ każdy pacjent może mieć inny obraz choroby. Analiza jakościowa obejmuje kontrolę i weryfikację. Jeśli pacjent nie ma wirusa, wynik jest oznaczany jako „ujemny”. W przypadku wykrycia w drodze badań przesiewowych przeprowadza się dodatkowe badanie weryfikacyjne. Immunoblot to test potwierdzający lub zaprzeczający wynikowi badania przesiewowego. Jeżeli na pasku testowym w niektórych obszarach (miejscach występowania białek) pojawią się ciemnienia, stawiana jest diagnoza HIV. Jeżeli wyniki budzą wątpliwości, badania przeprowadza się w ciągu trzech miesięcy.

Stosując się do zaleceń, możesz zapobiec zakażeniu wirusem niedoboru odporności pewne zasady: unikaj przypadkowego seksu, podczas kontaktu używaj prezerwatywy, nie zażywaj narkotyków. Jeśli choroba zostanie wykryta u kobiety w ciąży, ważne jest, aby ściśle przestrzegać zaleceń lekarza prowadzącego i nie zapomnieć o poddaniu się badaniom na obecność wirusa.

Krew pobierana jest z żyły. Następnie badanie przebiega zgodnie z instrukcją:

próbkę umieszcza się w żelu w celu rozdziału elektroforetycznego, w wyniku czego powstają specyficzne białka wrażliwe na wirusa;
na poddany obróbce żel nakłada się papier nitrocelulozowy;
przygotowaną próbkę umieszcza się w aparacie do blottingu.

Aby zidentyfikować konkretne enzymy, należy odpowiednio przygotować papier do badań laboratoryjnych. W tym celu nanosi się na niego przeciwciała i znakowany radioaktywny koniugat. Wynik badania ocenia się wizualnie, bada się skonstruowane łańcuchy enzymatyczne.

Dekodowanie wyników

Po manipulacji na papierze pozostają smugi. Znajdują się one tam, gdzie nastąpiła koniugacja, czyli zastosowany lek wszedł w reakcję z białkiem wirusa. W ten sposób można wykryć części białka:

z rdzenia HIV-1 – p17, p24, p55;
patogen HIV-2 – p16, p26, p56.

Wyniki immunoblottingu uważa się za pozytywne, jeśli wykryte zostaną 2 z 3 białek HIV-1 lub HIV-2. Ponieważ Western blot (druga nazwa badania) jest często używany do potwierdzenia pozytywny wynik testu ELISA, następnie sprawdza się reakcję pod kątem konkretnych białek: gp120/160, gp41 lub p24. Są częścią trzech głównych genów AIDS – gag, pol i env. Podczas wstępnej diagnozy badanie przeprowadza się tylko dla białek p25, gp110/120 i gp160, w przypadku wyniku pozytywnego badanie wykonuje się dla p24. Ta część białka umożliwia wykrycie wirusa we wczesnym stadium.

Wynik pozytywny jest powodem do poszukiwania bardziej złożonej diagnostyki. Jest fałszywe tylko w 3 przypadkach:

u pacjentów z wysoki poziom bilirubina;
w kontakcie z antygenami wirusowymi;
w przypadku patologii tkanki łącznej.

Jeśli u pacjenta nie ma linii odpowiadających białkom AIDS, wynik ocenia się jako negatywny. Oznacza to, że dana osoba nie jest zarażona wirusem HIV lub znajduje się w okresie okienka. To drugie oznacza, że wirus mógł przedostać się do organizmu, ale jeszcze się w nim nie rozwinął. Aby zwiększyć dokładność diagnozy, stosuje się systemy testowe:

rekombinowany wirus HIV;
Antygen;
Peptoekran.

Po ich sprawdzeniu wynik uznaje się za ujemny, jeżeli w próbce nie stwierdzono białek gp120, gp160, Sp4.

Istnieje inna opcja interpretacji - wynik neutralny lub wątpliwy. Występuje u osób mających kontakt seksualny z partnerem zakażonym wirusem HIV. W ich krwi znajdują się przeciwciała przeciwko białkom gp120 i gp160. Również wątpliwą odpowiedź podczas blotowania podaje się, gdy infekcja przebiega bezobjawowo, to znaczy jest w stanie uśpienia.

Ważne jest, aby dokładnie sprawdzić wątpliwy wynik. W tym celu wykorzystuje się dynamiczne badanie surowicy krwi, czyli regularne kontrole metodą immunoblottingu i ELISA przez okres sześciu miesięcy. Również mianowany dodatkowe badania, gdyż obecność autoprzeciwciał i kompleksów immunologicznych we krwi może wynikać z:

choroba zakaźna;
obecność guzów nowotworowych;
alergie.

Immunoblot (immunoblot, Western Blot, Western Blot)- łączy w sobie test immunoenzymatyczny (ELISA) ze wstępnym elektroforetycznym przeniesieniem antygenów wirusa na pasek nitrocelulozowy (pasek).

W tej pięknej naukowej nazwie „plamka” jest najprawdopodobniej tłumaczona jako „plamka”, a „zachodni” jako „zachodni” odzwierciedla kierunek rozprzestrzeniania się tej „plamy” na papierze od lewej do prawej, to znaczy do mapa geograficzna odpowiada to kierunkowi z zachodu na wschód.” Istotą metody „immune blot” jest to, że reakcję immunoenzymatyczną przeprowadza się nie z mieszaniną antygenów, ale z antygenami HIV, uprzednio rozdzielonymi metodą immunoforezy na frakcje zlokalizowane według masy cząsteczkowej na powierzchni błony nitrocelulozowej. W rezultacie główne białka wirusa HIV, będące nośnikami determinant antygenowych, są rozmieszczone na powierzchni w postaci oddzielnych pasków, które pojawiają się podczas enzymatycznej reakcji immunosorpcyjnej.

Immunoblot obejmuje kilka etapów:

Przygotowanie pasków. Wirus niedoboru odporności (HIV), uprzednio oczyszczony i rozłożony na składniki składowe, poddawany jest elektroforezie, a antygeny tworzące wirusa HIV są rozdzielane na podstawie masy cząsteczkowej. Następnie metodą blottingu (analogicznie do wyciśnięcia nadmiaru atramentu na bibulę) antygeny przenoszone są na pasek nitrocelulozy, który zawiera teraz widmo prążków antygenowych charakterystycznych dla wirusa HIV, a które jest jeszcze niewidoczne dla oka.

Próbne badanie. Materiał testowy (surowica, osocze pacjenta itp.) nakładany jest na pasek nitrocelulozowy i jeśli w próbce znajdują się specyficzne przeciwciała, wiążą się one ze ściśle odpowiadającymi (komplementarnymi) prążkami antygenowymi. W wyniku kolejnych manipulacji rezultat tej interakcji zostaje zwizualizowany – uwidoczniony.

Interpretacja wyniku. Obecność prążków w niektórych obszarach płytki nitrocelulozowej potwierdza obecność w badanej surowicy przeciwciał przeciwko ściśle określonym antygenom wirusa HIV.

Pasek A – kontrola dodatnia

Pasek B – Słaba kontrola dodatnia

Ścieżka C – Kontrola ujemna

Ścieżka D – Próbka pozytywna (wykryto przeciwciała przeciwko HIV-1)

Obecnie główną metodą potwierdzania obecności przeciwciał swoistych dla wirusa w badanej surowicy jest immunoblot (immunoblot). W niektórych przypadkach zakażenia wirusem HIV, przed wystąpieniem serokonwersji, swoiste przeciwciała są skuteczniej wykrywane przez immunoblot niż ELISA. Podczas badań metodą immunoblottingu stwierdzono, że najczęściej przeciwciała przeciwko gp 41 wykrywa się w surowicy pacjentów chorych na AIDS, a wykrycie p24 u osób badanych w celach profilaktycznych wymaga dodatkowych badań w celu ustalenia, czy są one zakażone wirusem HIV. Systemy testowe immunoblottingu oparte na genetycznie modyfikowanych rekombinowanych białkach okazały się bardziej specyficzne niż konwencjonalne systemy oparte na oczyszczonym lizacie wirusowym. W przypadku stosowania rekombinowanego antygenu nie tworzy się rozproszony, ale wyraźnie określony wąski pasek antygenu, który jest łatwo dostępny do rejestracji i oceny.

Surowice osób zakażonych HIV-1 wykazują przeciwciała przeciwko następującym głównym białkom i glikoproteinom - strukturalne białka otoczki (env) - gp160, gp120, gp41; rdzeń (gag) - p17, p24, p55, a także enzymy wirusowe (pol) - p31, p51, p66. Przeciwciała przeciwko env są typowe dla HIV-2 - gp140, gp105, gp36; knebel - p16, p25, p56; pol - p68.

Wśród metod laboratoryjnych niezbędnych do ustalenia specyficzności reakcji najbardziej rozpoznawalną jest wykrywanie przeciwciał przeciwko białkom otoczki HIV-1 - gp41, gp120, gp160 i HIV-2 - gp36, gp105, gp140.

WHO uznaje surowice za dodatnie, w których metodą immunoblottingu wykryto przeciwciała przeciwko dowolnym dwóm glikoproteinom HIV. Zgodnie z tymi zaleceniami, jeśli zachodzi reakcja tylko z jednym z białek otoczki (gp 160, gp 120, gp 41) w połączeniu lub bez reakcji z innymi białkami, wynik uważa się za wątpliwy i zaleca się ponowne badanie przy użyciu zestaw z innej serii lub innej firmy. Jeżeli nawet po tym wynik pozostaje wątpliwy, zaleca się obserwację przez 6 miesięcy (badanie po 3 miesiącach).

Dostępność pozytywna reakcja z antygenem p24 może wskazywać na okres serokonwersji, ponieważ czasami jako pierwsze pojawiają się przeciwciała przeciwko temu białku. W takim przypadku zaleca się, w zależności od danych klinicznych i epidemiologicznych, powtórzenie badania z próbką surowicy pobraną co najmniej 2 tygodnie później, co ma dokładnie miejsce w przypadku konieczności badania sparowanych surowic w przypadku zakażenia wirusem HIV.

Pozytywne reakcje z białkami gag i pol bez reakcji z białkami env mogą odzwierciedlać wczesną serokonwersję i mogą również wskazywać na zakażenie HIV-2 lub niespecyficzną reakcję. Osoby z takimi wynikami po badaniu na obecność wirusa HIV-2 są ponownie badane po 3 miesiącach (w ciągu 6 miesięcy).

W tej pięknej naukowej nazwie „blot” jest najprawdopodobniej tłumaczony jako „blot”, a „western” - ponieważ „western” odzwierciedla kierunek rozmieszczenia tej „plamy” na papierze od lewej do prawej, czyli na papierze mapa geograficzna odpowiada kierunkowi z zachodu na wschód. ” Istotą metody „immune blot” jest to, że reakcję immunoenzymatyczną przeprowadza się nie z mieszaniną antygenów, ale z antygenami HIV, uprzednio rozdzielonymi metodą immunoforezy na frakcje zlokalizowane według masy cząsteczkowej na powierzchni błony nitrocelulozowej. W rezultacie główne białka wirusa HIV, będące nośnikami determinant antygenowych, są rozmieszczone na powierzchni w postaci oddzielnych pasków, które pojawiają się podczas enzymatycznej reakcji immunosorpcyjnej.

Immunoblot obejmuje kilka etapów:

Pasek A – kontrola dodatnia

Pasek B – Słaba kontrola dodatnia

Ścieżka C – Kontrola ujemna

Ścieżka D – Próbka pozytywna (wykryto przeciwciała przeciwko HIV-1)

Obecnie główną metodą potwierdzania obecności przeciwciał swoistych dla wirusa w badanej surowicy jest immunoblot (immunoblot). W niektórych przypadkach zakażenia wirusem HIV, przed wystąpieniem serokonwersji, swoiste przeciwciała są skuteczniej wykrywane metodą immunoblottingu niż metodą ELISA. Podczas badań metodą immunoblottingu stwierdzono, że najczęściej przeciwciała przeciwko gp 41 wykrywa się w surowicy pacjentów chorych na AIDS, a wykrycie p24 u osób badanych w celach profilaktycznych wymaga dodatkowych badań w celu ustalenia, czy są one zakażone wirusem HIV. Systemy testowe immunoblottingu oparte na genetycznie modyfikowanych rekombinowanych białkach okazały się bardziej specyficzne niż konwencjonalne systemy oparte na oczyszczonym lizacie wirusowym. W przypadku stosowania rekombinowanego antygenu nie tworzy się rozproszony, ale wyraźnie określony wąski pasek antygenu, który jest łatwo dostępny do rejestracji i oceny.

Obecność dodatniej reakcji z antygenem p24 może wskazywać na okres serokonwersji, gdyż czasami jako pierwsze pojawiają się przeciwciała przeciwko temu białku. W takim przypadku zaleca się, w zależności od danych klinicznych i epidemiologicznych, powtórzenie badania z próbką surowicy pobraną co najmniej 2 tygodnie później, co ma dokładnie miejsce w przypadku konieczności badania sparowanych surowic w przypadku zakażenia wirusem HIV.

Immunoblot –(od angielskiego „blot” - plamka) - metoda identyfikacji antygenów (lub przeciwciał) przy użyciu znanych surowic (lub antygenów). Jest to połączenie elektroforezy żelowej i testu ELISA. Początkowo komórki bakteryjne lub wiriony są niszczone za pomocą ultradźwięków, a następnie wszystkie antygeny wirusa lub komórki bakteryjne rozdzielane są poprzez elektroforezę i otrzymuje się komercyjny odczynnik na specjalnej folii nitrocelulozowej. Podczas wykonywania immunoblottingu badaną surowicę pacjenta nakłada się na film ze znanymi antygenami. Po inkubacji i przemyciu niezwiązanych przeciwciał przystępuje się do testu ELISA - na błonę nakłada się surowicę odpornościową przeciwko ludzkim immunoglobulinom znakowanym enzymem i chromogennym substratem, który zmienia kolor pod wpływem interakcji z enzymem. W obecności kompleksów antygen-przeciwciało-surowica odpornościowa przeciwko kompleksom immunoglobulina-enzym na nośniku pojawiają się kolorowe plamy. Metoda immunoblottingu pozwala na osobne wykrycie przeciwciał różne antygeny patogen (na przykład w przypadku zakażenia wirusem HIV immunoblot wykrywa przeciwciała przeciwko gp120, gp24 i innym antygenom wirusa).

Test radioimmunologiczny (RIA)

Metoda opiera się na reakcji antygen-przeciwciało z wykorzystaniem antygenu lub przeciwciała znakowanego radionuklidem. Jako znaczniki stosuje się 125I, 14C, 3H, 51Cr i inne radionuklidy. Powstałe kompleksy immunologiczne izoluje się z ustroju i określa się ich radioaktywność za pomocą liczników (promieniowanie β). Intensywność promieniowania jest wprost proporcjonalna do liczby związanych cząsteczek antygenu i przeciwciała.

Powszechna jest wersja RIA w fazie stałej, wykorzystująca znakowane przeciwciała lub antygeny zaabsorbowane w dołkach płyt styropianowych.

RIA służy do wykrywania antygenów drobnoustrojów, wirusów, różne hormony, enzymy, substancje lecznicze, immunoglobuliny oraz inne substancje zawarte w materiale badawczym w niewielkich stężeniach 10-12-10-15 g/l.

Pytania kontrolne

Reakcja bakteriolizy immunologicznej: jaki to rodzaj reakcji; czym jest antygen, czym jest przeciwciało, mechanizm reakcji, metody wytwarzania, praktyczne użycie. Reakcja hemolizy immunologicznej: niezbędne składniki, procedura; sterowanie, zastosowanie praktyczne. Reakcja miejscowej hemolizy w żelu (reakcja Jerne’a): zasada reakcji, sposób formułowania, zastosowanie praktyczne. Reakcja wiązania dopełniacza: zasada reakcji; co powstaje, gdy surowica immunologiczna wchodzi w interakcję z określonym antygenem; co się dzieje z dopełnieniem, jeśli jest obecne podczas tej interakcji? Jaki los czeka dopełniacz, jeśli nie ma swoistego powinowactwa pomiędzy antygenem i przeciwciałami? Jakiej reakcji można użyć do ustalenia, co stało się z dopełniaczem; dlaczego zastosowano tę konkretną reakcję; Jaki jest widoczny pozytywny wynik RSC? Dlaczego? Jaka właściwość dopełnienia jest wykorzystywana w pierwszej fazie RSC? W drugiej fazie? Jeśli wynik końcowy RSC to hemoliza, co to znaczy - dodatnia lub wynik negatywny? Wyjaśnij wyniki: RSK+ + + +, RSK+ + +, RSK+ +, RSK+. Wymień składniki pierwszego systemu RSK i składniki drugiego systemu RSK. Dlaczego surowica testowa musi być inaktywowana? W jaki sposób miareczkuje się dopełniacz? Surowica hemolityczna: co zawiera, jak się ją otrzymuje, jakie jest miano i jak się ją oznacza? Jakie zwierzęta wykorzystuje się do uzyskania komponentów RSC? Metodologia ustawiania RSC na zimno. Która z reakcji wymaga udziału dopełniacza podczas określania stopnia zaawansowania: wytrącanie, flokulacja, aglutynacja, wykrywanie niekompletnych przeciwciał, bakterioliza immunologiczna, hemoliza immunologiczna, Jerne, RSC? Reakcja immunofluorescencyjna (RIF) – wskazać sekwencję zdarzeń w bezpośredniej reakcji Koonsa; niezbędne składniki. Co to jest antygen, co to jest przeciwciało, czym są znakowane przeciwciała, jak uwzględnia się wynik reakcji, jak wygląda wynik pozytywny? Praktyczne zastosowanie - co można wyznaczyć za pomocą tej reakcji? Pośrednia reakcja immunofluorescencyjna – wskazać kolejność zdarzeń podczas tej reakcji, niezbędne składniki, jaki jest antygen, jakie surowice odpornościowe są stosowane; praktyczne użycie; zaleta pośredniego RIF w porównaniu z reakcją bezpośrednią. Połączony test immunoabsorpcyjny(ELISA) – zasada reakcji; niezbędne składniki; wskazać kolejność zdarzeń podczas przeprowadzania reakcji mającej na celu wykrycie antygenu w badanym materiale; niezbędne składniki; Co się dzieje, gdy wynik jest pozytywny, jak to wygląda? Wskazać kolejność czynności podczas wykonywania testu ELISA w celu wykrycia przeciwciał w surowicy testowej; niezbędne składniki; co się stanie, jeśli wynik będzie pozytywny? Immunoblot – zasada reakcji; główne etapy; niezbędne składniki; jak wynik jest brany pod uwagę; korzyści z reakcji. Test radioimmunologiczny (RIA) – jakie są główne etapy reakcji; Czym znakowane są przeciwciała lub antygeny i jak uwzględniany jest wynik? Mikroskopia immunoelektronowa – zasada metody; główne etapy; niezbędne składniki; czym są znakowane przeciwciała? jak uwzględniany jest wynik reakcji. Reakcje unieruchomienia – zasada metody, technika zestalania, składniki, rejestracja wyników.

Zadania do wykonania w trakcie samodzielnej nauki.

Wypełnij tabelę „Reakcje immunologiczne” w odniesieniu do reakcji omówionych w tym temacie.

Reakcje immunologiczne

Praca studenta podczas zajęć praktycznych

Pracę rozpocznij natychmiast od skonfigurowania fazy 1 RSK, ale zapisz to później w swoim notatniku (patrz poniżej).

1. Reakcja hemolizy immunologicznej. Obejrzyj demonstrację reakcji hemolizy immunologicznej, naszkicuj ją w formie diagramu, wyjaśnij wynik w probówce doświadczalnej i kontrolnej.

2. Reakcja wiązania dopełniacza

a) przeanalizuj RSK zgodnie z tabelą;

b) narysować w zeszycie schemat konfiguracji RSC w formie tabeli;

c) umieść drugą fazę RSK (pierwsza faza jest umieszczona na początku lekcji);

d) analizować przygotowania diagnostyczne niezbędne do RSC;

d) wziąć pod uwagę wynik. Sformułuj wniosek na temat obecności swoistych przeciwciał w badanej surowicy.

3. Reakcja immunofluorescencyjna. Przestudiuj tabelę, zrób diagram reakcji w swoim notatniku; spójrz na surowice diagnostyczne; określić, co zawiera surowica, jak jest przygotowywana, do jakiej reakcji (bezpośredniej lub pośredniej RIF) się ją wykorzystuje. Spójrz na wynik demonstracji RIF w mikroskopie fluorescencyjnym.

4. Test immunoenzymatyczny (ELISA). Narysuj w zeszycie schemat ustawienia reakcji w dwóch wersjach: do wykrywania antygenu w badanym materiale i do wykrywania przeciwciał w surowicy. Zapoznaj się z zestawem składników na HIV i wirusowe zapalenie wątroby typu B. Określ, co zawiera każdy składnik i do czego jest używany.

5. Immunoblot. Zrób w zeszycie diagram reakcji; obejrzyj demonstrację - wynik reakcji.

6. Test radioimmunologiczny (RIA). Zrób w zeszycie diagram reakcji.

7. Immunologiczna mikroskopia elektronowa (IEM). Obejrzyj demonstrację - wynik reakcji, sporządź w zeszycie schemat reakcji, zaznacz strzałkami antygen (wirus) i oznaczone przeciwciała.

Immunoblotting to bardzo czuła metoda wykrywania białek, oparta na połączeniu elektroforezy i testu ELISA lub RIA. Immunoblotting stosuje się jako metoda diagnostyczna na zakażenie wirusem HIV itp.

W ogólnym sensie immunoblotting odnosi się do analizy mieszaniny białek przeniesionych na stały nośnik membranowy, z którym są one związane wiązaniami kowalencyjnymi, a następnie przeprowadza się immunodetekcję.

Można analizować mieszaninę białek nałożoną bezpośrednio na podłoże - analiza dot blot - lub po jej wstępnym frakcjonowaniu metodą elektroogniskowania, elektroforezy krążkowej lub elektroforezy dwuwymiarowej - analiza Western blot.

Antygeny patogenów oddziela się za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym, następnie przenosi się z żelu na aktywowany papier lub membranę nitrocelulozową i wywołuje metodą ELISA.

Firmy produkują takie paski z „plamkami” antygenów. Na te paski nakłada się surowicę pacjenta. . Następnie po inkubacji pacjenta płucze się z niezwiązanych przeciwciał i podaje surowicę przeciwko immunoglobulinom ludzkim znakowaną enzymem . Kompleks utworzony na pasku (antygen + przeciwciało pacjenta + przeciwciało przeciwko ludzkiej Ig) wykrywa się poprzez dodanie chromogennego substratu, który zmienia kolor pod wpływem enzymu.

Metodologię tę stosuje się również do selekcji klonów bakterii, fagów lub wirusów, które wyrażają docelowe sklonowane produkty genowe.

Przenoszenie białek na membranę odbywa się biernie lub przy użyciu sprzętu do elektrotransferu. Na skuteczność transferu białek na membranę wpływa wiele czynników, takich jak masa cząsteczkowa białek, porowatość żelu, czas transferu oraz skład użytego roztworu buforowego (trans-bufora).

W zależności od celów i warunków eksperymentu dobiera się warunki transferu zapewniające zapewnienie najlepsze wyniki. Jako substraty powszechnie stosuje się nitrocelulozę, difluorek poliwinylidenu (PVDF) lub dodatnio naładowane membrany nylonowe. Nitroceluloza może związać do 80 - 100 µg białka na 1 cm2.

W wyniku przemywania mogą zostać utracone białka niskocząsteczkowe (o masie cząsteczkowej mniejszej niż 20 kDa), co umożliwia wstępne badanie polimorfizmu określonych loci genetycznych na podstawie długości odpowiednich fragmentów restrykcyjnych DNA.

Ponadto, stosując hybrydyzację Southern, można łatwo dowiedzieć się, czy gen docelowy posiada w swojej wewnętrznej części miejsce hydrolizy przez określony enzym restrykcyjny, co pozwala wybrać optymalną strategię klonowania badanego regionu genomu.

Stosując podobny schemat, cząsteczki RNA można przenieść z żelu agarozowego na filtr nitrocelulozowy. Metodę tę nazwano Northern blot, w przeciwieństwie do Southern blot, ponieważ nazwisko Southern w język angielski oznacza „południowy”.

Przeniesienie białek na filtry z żelu nazwano odpowiednio Western blot. Duże białka (>100 kDa) zdenaturowane w roztworze dodecylosiarczanu sodu (SDS) mogą być słabo przenoszone na membranę, jeśli w buforze trans obecny jest etanol. Alkohol znacząco poprawia transfer białek z żelu SDS-poliakryloamidowego, jednak zwęża pory w żelu, co prowadzi do retencji dużych białek.

Membrana PVDF jest zoptymalizowana pod kątem immunodetekcji i jest w stanie zatrzymać do 160 μg/cm2 specyficznie związanych białek przy bardzo niskim poziomie wiązania nieswoistego.

Immunoblot

Ważną właściwością tej membrany jest możliwość jej wielokrotnego użycia. Membrany nylonowe Zeta-Probe skutecznie wiążą białka SDS w nieobecności alkoholu, a wiązanie to jest odporne na późniejsze zabiegi. Skutecznie zatrzymuje się także białka o niskiej masie cząsteczkowej. Dzięki dużej zdolności wiązania wynoszącej około 480 μg białka na cm2, membrany Zeta-Probe umożliwiają wykrywanie śladowych ilości białka w mieszaninach testowych.

Po unieruchomieniu antygenu na błonie pozostałe miejsca wiązania blokuje się roztworami żelatyny, albuminy surowicy bydlęcej lub odtłuszczonego mleka.

Następnie membranę inkubuje się w roztworze przeciwciał poliklonalnych lub monoklonalnych skierowanych przeciwko badanemu antygenowi. Po wypłukaniu niezwiązanych przeciwciał błonę inkubuje się w roztworze przeciwciał wtórnych, które są koniugatem enzymów fosfatazy alkalicznej (AP) lub peroksydazy chrzanowej (HRP) z przeciwciałami antygatunkowymi (przeciwciała kozie przeciwko immunoglobulinom króliczym, mysim lub ludzkim ) lub białka A (białko Staphylococcus aureus) lub G (białko Streptococcus sp.), posiadające wysokie powinowactwo do regionu Fc immunoglobulin.

Wykrywanie powstałych kompleksów immunologicznych przeprowadza się chemicznie lub chemiluminescencyjnie. Podłoża dla Reakcja chemiczna W przypadku stosowania koniugatów fosfatazy alkalicznej należy stosować fosforan 5-bromo-4-chloro-3-indolilu (BCIP) lub błękit tetrazolowy (NBT), a w przypadku koniugatów peroksydazy chrzanowej należy stosować 4-chloro-1-naftol i nadtlenek wodoru.

W wyniku reakcji enzymatycznych na membranie w miejscu lokalizacji kompleksu antygen-przeciwciało powstaje kolorowy pasek lub plamka.

Czułość tej metody wynosi 100 pg białka przy zastosowaniu koniugatów AP i 100-500 pg przy zastosowaniu koniugatów HRP. Chemiluminescencyjne wykrywanie kompleksów immunologicznych pozwala na wykrycie mniej niż 5 pg antygenu. Zasada tej metody polega na tym, że podczas reakcji HRP z nadtlenkiem wodoru i cyklicznym diacylohydrazynoluminolem emitowane jest światło o długości fali 428 nm, które można zarejestrować na kliszy światłoczułej.

Na podstawie testu ELISA opracowano reakcję immunoblottingu (IB). Jest to najbardziej specyficzna i czuła metoda analizy immunochemicznej. Immunoblotting (z angielskiego blot - blot, barwienie) łączy test ELISA z elektroforezą. Służy do wykrywania nie złożonych przeciwciał przeciwko HIV, ale przeciwciał przeciwko jego poszczególnym białkom strukturalnym (białka p24, glikoproteiny gp120, gp 41 itp.). Dotyczy reakcji eksperckich (potwierdzających) w celu rozpoznania zakażenia wirusem HIV.

Reakcję prowadzi się w kilku etapach:

Wirus rozkłada się na składniki - antygeny (p24, gp120, gp 41 itp.), które poddaje się elektroforezie w żelu poliakryloamidowym, czyli rozdzielaniu antygenów na frakcje według masy cząsteczkowej.

2. Żel pokrywa się membraną nitrocelulozową i za pomocą elektroforezy przenosi się do niego frakcje antygenowe. Nitroceluloza zachowuje się jak bibuła. Membrana jest cięta na paski. Firmy produkują takie paski z „plamkami” antygenów.

Immunoblotting – dodatkowa metoda pośrednia

Paski pokryte antygenami HIV zanurza się w surowicy pacjenta, a następnie przemywa w celu usunięcia niezwiązanego materiału.

4. Paski inkubuje się z surowicą antyglobulinową znakowaną peroksydazą i przemywa.

Dodaje się substrat i notuje liczbę zabarwionych frakcji (plam) odpowiadających strefie lokalizacji kompleksu AG-AT.

Obecność prążków w niektórych obszarach paska potwierdza obecność w badanej surowicy przeciwciał przeciwko ściśle określonym antygenom wirusa HIV. Wynik immunoblottingu uznaje się za pozytywny, jeżeli na membranie widoczne są prążki odpowiadające dowolnym dwóm z trzech antygenów HIV – p24, gp41 i gp 120 (ryc. 37).

RYSUNKI

WYKAZ WYKORZYSTANYCH BIBLIOGRAFII

Literatura główna

Mikrobiologia medyczna, wirusologia i immunologia: podręcznik dla studentów medycyny. uniwersytety, wyd. 2, wyd. i dodatkowe — 702 s. wyd. AA Worobiowa. M.: MIA, 2012.

2. Mikrobiologia, wirusologia i immunologia: podręcznik do zajęć laboratoryjnych: podręcznik/(V.B. Sboychakov i in.); edytowany przez V.B. Sboyczakova, M.M. Karapats. – M.: GEOTAR-Media, 2014.- 320 s.: il.

3. Mikrobiologia medyczna, immunologia i wirusologia [Zasoby elektroniczne]: podręcznik dotyczący miodu.

uniwersytety - 760 s. — Tryb dostępu: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN9785299004250.html Korotyaev A.I., Babichev S.A. Petersburg: Spetslit, 2010.

4. Mikrobiologia medyczna, wirusologia i immunologia [Zasoby elektroniczne]: podręcznik: w 2 tomach / tom 1. - 448 s. — Tryb dostępu: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142241.html Zverev V.V., Boychenko M.N.

M.: Geotar Media, 2010. .

5. Mikrobiologia medyczna, wirusologia i immunologia [Zasoby elektroniczne]: podręcznik: w 2 tomach T. 2. - 480 s. Tryb dostępu: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142242.html Zverev V.V., Boychenko M.N. M.: Geotar Media, 2010.

dodatkowa literatura

1. Reakcje immunodiagnostyczne: instruktaż/ oprac.: G.K.Davletshina, Z.G.Gabidullin, A.A.Akhtarieva, M.M.Tuigunov, A.K.Bulgakov, T.A.Savchenko, R.F.

Khusnarizanova, Yu.Z. Gabidullin, M.M. Alsynbaev - Ufa: Wydawnictwo Państwowej Budżetowej Instytucji Edukacyjnej Wyższego Kształcenia Zawodowego BSMU Ministerstwa Zdrowia Rosji, 2016. - 86 s.

2. Cechy niektórych właściwości decydujących o patogennym potencjale współhodowanych odmian bakterii Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E.coli, Proteus: publikacja naukowa / Yu. Z. Gabidullin, R. S. Sufiyarov, I. I. Dolgushin - Ufa, 2015. - 250 s.

Strona główna » Immunoblot – co to jest? Immunoblot w diagnostyce chorób zakaźnych

Immunoblot – co to jest? Immunoblot w diagnostyce chorób zakaźnych

Co to jest immunoblot? Jest to powszechna metoda diagnostyki laboratoryjnej ludzkich infekcji wirusowych. Jest to jeden z najdokładniejszych i najbardziej niezawodnych sposobów wykrywania obecności wirusa HIV.

Aby zapewnić niezawodność, jest on nawet większy niż test immunoenzymatyczny (elisa). Wyniki immunoblotu uważa się za rozstrzygające i rozstrzygające.Informacje ogólne

Immunoblot – co to jest? Aby rozpoznać osobę jako zakażoną wirusem HIV, należy przejść test metoda laboratoryjna badania surowicy krwi na obecność przeciwciał.

Skrawki Western blot nazywane są także Western blot. Służy do wykrywania ludzkich infekcji wirusowych jako dodatkowa metoda ekspercka. Jest to konieczne, aby potwierdzić ELISA - badanie laboratoryjne, które pozwala określić obecność przeciwciał przeciwko wirusowi HIV we krwi. Immunoblot ponownie sprawdza pozytywny wynik testu ELISA.

Uważany jest za najbardziej wrażliwy, złożony i kosztowny.

Cel

Co to jest immunoblot? Ta technika badania laboratoryjne surowica krwi na obecność przeciwciał przeciwko wirusowi.

Podczas specjalne badania całkowite białka wirusowe w żelu i na błonie nitrocelulozowej.

Immunoblotting (wykrywanie przeciwciał w surowicy pacjenta przeciwko określonym antygenom patogenu)

Procedura Western blot ma na celu określenie zakażenia wirusem HIV na różnych etapach. W pierwszym etapie oczyszczony wirus z części składowych poddawany jest elektroforezie, a zawarte w nim antygeny rozdzielane są według masy cząsteczkowej.

Ludzki wirus niedoboru odporności rozmnaża się w żywych komórkach osadzonych w jego informacji genetycznej. Na tym etapie osoba, która została zakażona, staje się nosicielem wirusa HIV.

Specyfika tej choroby polega na tym, że nie objawia się ona przez długi czas. Wirus niszczy limfocyty, przez co odporność człowieka spada, a organizm nie jest w stanie walczyć z infekcjami.

Jeśli HIV będzie leczony prawidłowo i szybko, pacjent dożyje sędziwego wieku. Brak leczenia nieuchronnie prowadzi do śmierci. Od momentu zakażenia, ale bez leczenia, maksymalny okres nie przekracza dziesięciu lat.

Osobliwości

Analiza immunoblot jest niezawodną metodą, która pozwala określić obecność przeciwciał przeciwko antygenom HIV pierwszego i drugiego typu.

Jeśli dana osoba jest zarażona, po dwóch tygodniach przeciwciała można wykryć znacznie później. Szczególną cechą wirusa HIV jest to, że ilość przeciwciał szybko wzrasta i pozostaje we krwi pacjenta. Nawet jeśli są obecne, choroba może nie ujawnić się przez dwa lub więcej lat. Metoda ELISA nie zawsze dokładnie wskazuje obecność choroby, wymaga potwierdzenia wyników skrawków PCR i Western blot, jeśli test immunologiczny enzymatyczny wykazał wynik pozytywny.

Wskazania dla

Jaki rodzaj „immunoblotu” już odkryto, ale jaki jest wprowadzany do badań?

Powodem wykonywania badań na obecność ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV) jest immunoblot. wynik pozytywny ELISA. U pacjentów, którzy mają zostać poddani operacji, konieczne jest wykonanie testu immunoenzymatycznego. Dodatkowo warto zrobić analizę kobiet planujących ciążę, a także tych, które są rozwiązłe. Skrawki Western blot są przepisywane pacjentom zakażonym wirusem HIV, jeśli wyniki testu Elisa są niejednoznaczne.

Powodem zgłoszenia się do lekarza mogą być następujące niepokojące objawy: szybka utrata masy ciała; osłabienie, utrata funkcji; zaburzenia jelitowe (biegunka), które trwają do trzech tygodni; odwodnienie; gorączka; powiększone węzły chłonne w organizmie; rozwój kandydozy, gruźlicy , zapalenie płuc, toksoplazmoza, zaostrzenie opryszczki.

Pacjent nie musi przygotowywać się przed oddaniem krwi żylnej.

Nie jeść na 8-10 godzin przed badaniem. Nie zaleca się spożywania alkoholu ani mocnych napojów kawowych na dzień przed oddaniem krwi. ćwiczenia fizyczne, bądź podekscytowany.

Gdzie przeprowadzić analizę?

Gdzie mogę wykonać test na HIV?

ELISA, czyli analiza immunoblot, przeprowadzana w prywatnych klinikach miejskich, daje wyniki w ciągu jednego dnia. Możliwa jest także pilna diagnoza. W placówkach publicznych badania lekarskie Elisa i Western blot są bezpłatne, zgodnie z ustawodawstwem Federacji Rosyjskiej.

Obowiązkowe badania przesiewowe w kierunku chorób zakaźnych u kobiet w ciąży oraz pacjentów wymagających hospitalizacji lub operacji.Jak przeprowadza się to badanie?

Jak wykonać test ELISA? Immunoblot dodatni/ujemny potwierdza lub zaprzecza wynikom testu Elisa. Procedura jest dość prosta. Specjalista pobiera krew żylną, co zajmuje mniej niż pięć minut.

Po pobraniu próbki miejsce wstrzyknięcia należy zdezynfekować i przykryć bandażem. Pobieranie próbek odbywa się na czczo, więc po zabiegu nie zaszkodzi zjeść tabliczkę gorzkiej czekolady lub słodki, gorący napój.

Aby otrzymać skierowanie na bezpłatne badanie w publicznej placówce medycznej, należy udać się do terapeuty.

Ogólnie rzecz biorąc, immunoblot nie różni się od innych badań krwi pod względem pobrania. Metodologia badań jest prosta. Jeśli we krwi danej osoby obecny jest wirus, organizm zaczyna wytwarzać przeciwciała, aby go zniszczyć. Dla każdego wirusa istnieje wiele antygenów białkowych. Wykrywanie tych przeciwciał jest podstawą metody przekrojowej Western blot. Cena

Jak długo trwa analiza? Immunoblot na HIV jest jednym z najtańszych testów.

Średnio metody przesiewowe testów immunologicznych wahają się od 500 do 900 rubli. Sekcje Western blot to badanie testów, których koszt waha się od trzech do pięciu tysięcy rubli. Bardziej złożone metody są znacznie droższe. Na przykład do analizy polimerazy reakcja łańcuchowa(PCR) będziesz musiał zapłacić około 12 000 rubli.

Interpretacja wyników

Najczęstszymi metodami diagnozowania zakażenia wirusem HIV są testy immunoenzymatyczne i immunoblot.

Służą do oznaczania przeciwciał przeciwko ludzkiemu wirusowi niedoboru odporności w surowicy. Zakażenie potwierdza się zwykle dwoma badaniami: przesiewowym i potwierdzającym. Wyniki musi zinterpretować lekarz, który stawia diagnozę i przepisuje leczenie. Jeśli wynik immunoblotu jest pozytywny, oznacza to, że w organizmie człowieka znajduje się wirus.

Pozytywny wynik nie powinien być powodem do samodzielnego leczenia, ponieważ każdy pacjent może mieć swój własny obraz choroby.

Analiza jakościowa obejmuje kontrolę i certyfikację. Jeżeli u pacjenta nie wykryto wirusa, wynik jest „ujemny”. W przypadku wykrycia tego certyfikatu przeprowadzane są dodatkowe badania przesiewowe. Analiza immunoblot, która potwierdza lub odrzuca badanie przesiewowe. Jeżeli paski testowe pojawiają się w pewnych ciemnych obszarach (lokalizacja białek), stawiana jest diagnoza HIV.

Jeżeli wyniki są wątpliwe, badania przeprowadza się w ciągu trzech miesięcy.

Aby zapobiec zakażeniu ludzkim wirusem niedoboru odporności, można przestrzegać pewnych zasad: unikać przypadkowych kontaktów seksualnych, podczas kontaktu używać prezerwatyw, nie zażywać narkotyków.

Jeśli choroba zostanie wykryta u kobiety w ciąży, ważne jest, aby postępować zgodnie z zaleceniami lekarza prowadzącego i nie zapomnieć o badaniu na obecność wirusa.

Co to jest Western Blot?

Identyfikacja białek w złożonych mieszaninach lub ekstraktach różnych tkanek jest jednym z często spotykanych problemów. Stosując narzędzie takie jak specyficzne przeciwciała, możliwe jest oznaczenie badanego białka przy minimalnym nakładzie czasu i kosztów finansowych.

W metodzie Western blot w pierwszym etapie mieszaninę białek rozdziela się metodą elektroforezy w obecności dodecylosiarczanu sodu (SDS), a następnie metodą elektroblottingu przenosi na membranę nitrocelulozową.

Istota tej metody polega na tym, że po elektroforezie żel umieszcza się na membranie nitrocelulozowej pomiędzy warstwami bibuły filtracyjnej. Tak zmontowaną „kanapkę” umieszcza się w polu elektrycznym, dzięki czemu kompleksy białko-SDS przemieszczają się po płytce żelowej i zostają unieruchomione (w wyniku nieswoistej sorpcji) na powierzchni membrany nitrocelulozowej.

Siły wiązania kompleksu białko-SDS z membraną nitrocelulozową to głównie charakter elektryczny, a oddziaływanie to jest wielopunktowe i prowadzi do „rozprzestrzeniania się” białek na powierzchni błony. Tym samym po elektrotransferze otrzymujemy replikę żelu na nitrocelulozie z białkami umiejscowionymi analogicznie jak w żelu poliakryloamidowym.

Po elektroforezie SDS, elektrotransferze i sorpcji białek z żelu na membranę nitrocelulozową, trzeciorzędowa konformacja białka ulega znacznej zmianie, jeśli ogólnie rzecz biorąc słuszne jest mówienie o istnieniu trzeciorzędowej struktury białka po tak ostrej obróbce. Dlatego do immunochemicznej detekcji badanego białka stosuje się zwykle wyłącznie przeciwciała mono- lub poliklonalne specyficzne dla liniowych regionów cząsteczki białka.

51. Test immunologiczny enzymatyczny, immunoblot. Mechanizm, komponenty, zastosowanie.

Przeciwciała specyficzne dla epitopów konformacyjnych (lub regionów obejmujących kontakty między podjednostkami) na ogół nie nadają się do stosowania w analizie Western blot.

Po transferze białka błonę inkubuje się kolejno z przeciwciałami specyficznymi dla badanego białka, a następnie z przeciwciałami wtórnymi specyficznymi dla fragmentów Fc przeciwciał pierwotnych, skoniugowanych ze znacznikiem enzymatycznym (lub innym) (ryc.

1A). W przypadku, gdy przeciwciała pierwotne specyficzne dla badanego antygenu są bezpośrednio skoniugowane ze znacznikiem, przeciwciała wtórne nie są wymagane (ryc. 1 B). Kompleksy immunologiczne powstające w miejscu lokalizacji badanego białka „ujawniają się” za pomocą substratu chromogennego (w zależności od rodzaju znacznika).

Czułość i swoistość metody w dużej mierze zależą od tego, jakie przeciwciała zostaną użyte w badaniu.

Stosowane przeciwciała muszą być specyficzne dla unikalnej sekwencji aminokwasów charakterystycznej tylko dla badanego białka. W przeciwnym razie możliwa jest interakcja (szczególnie w przypadku surowych ekstraktów białkowych) przeciwciał z kilkoma cząsteczkami białka, co w efekcie doprowadzi do pojawienia się na membranie kilku kolorowych pasm.

Identyfikacja badanego białka w tym przypadku jest często trudna lub wręcz niemożliwa.

Drugim ważnym czynnikiem, o którym należy pamiętać przy wyborze przeciwciał, jest powinowactwo. Im wyższe powinowactwo zastosowanych przeciwciał, tym jaśniejsze i wyraźniejsze są wybarwione prążki białkowe, tym wyższa czułość metody. Stosując przeciwciała o wysokim powinowactwie, można osiągnąć czułość 1 ng lub nawet wyższą.

Aby uwidocznić wynik interakcji pomiędzy antygenem związanym z błoną a przeciwciałami, stosuje się przeciwciała wtórne, skoniugowane z czynnikami zdolnymi do wytworzenia określonego sygnału w określonych warunkach.

Zazwyczaj jako taki środek stosuje się enzym (peroksydazę lub fosfatazę), którego produkt reakcji zabarwia się i wytrąca się na membranie w postaci nierozpuszczalnego osadu.

także w Ta metoda istnieje możliwość zastosowania etykiet fluorescencyjnych.

Ryż. 1. Schemat barwienia immunochemicznego badanego białka: A - z wykorzystaniem przeciwciał wtórnych skoniugowanych ze znacznikiem enzymatycznym; B - przeciwciało pierwszorzędowe jest bezpośrednio sprzężone ze znacznikiem enzymatycznym.

Protokół:

I. Przygotowanie żeli i błon oraz elektrotransfer białek

Po elektroforezie żel poliakryloamidowy umieszcza się w kąpieli z buforem do blottingu (25 mM Tris, pH 8,3, 192 mM glicyna, 10% etanol).

Na część kasety zwróconą w stronę anody umieszcza się dwa arkusze bibuły filtracyjnej, przycięte do kształtu kasety i zwilżone buforem bibułowym. Następnie na bibule filtracyjnej umieszcza się membranę nitrocelulozową zwilżoną tym samym buforem, upewniając się, że pomiędzy membraną a bibułą nie ma pęcherzyków powietrza.

Następnie żel należy ostrożnie umieścić na membranie, ponownie obracając Specjalna uwaga ze względu na brak pęcherzyków powietrza pomiędzy żelem a membraną. Formowanie kanapki dopełniają dwie warstwy zwilżonej bibuły filtracyjnej, które umieszcza się na powierzchni żelu (ryc. 2). Powstałą kanapkę mocuje się w kasecie i umieszcza pomiędzy elektrodami tak, aby membrana była skierowana w stronę anody.

Ryż. 2. Schemat elektrotransferu białek na błonę.

II. Transfer elektryczny

Elektrotransfer białek na membranę nitrocelulozową przeprowadza się w buforze zawierającym 25 mM Tris, pH 8,3, 192 mM glicynę, 10% etanol przez 30-50 min przy stałym napięciu 100 V.

Czas elektrotransferu zależy od wielkości przenoszonych białek; im większe białko, tym dłużej trwa elektrotransfer. Jakość elektrotransferu i lokalizację prążków białkowych ocenia się barwiąc membranę nitrocelulozową 0,3% roztworem Ponceau S w 1% kwas octowy. Przed barwieniem immunochemicznym membranę należy kilkakrotnie przemyć słabo alkalicznym roztworem roztwór wodny Tris do usuwania barwnika związanego z białkami.

III. Immunochemiczne barwienie białek unieruchomionych na membranie nitrocelulozowej

Aby zablokować miejsca nieswoistego wiązania przeciwciał, membranę inkubuje się przy ciągłym mieszaniu w temperaturze pokojowej przez 30 minut w PBST (np. lepsze blokowanie Można zastosować roztwór PBST zawierający 10% odtłuszczonego mleka w proszku).

Po zablokowaniu membranę inkubuje się przez godzinę w temperaturze pokojowej, stale mieszając, w PBST zawierającym 1-10 µg/ml swoistych przeciwciał.

Optymalne stężenie przeciwciał dobiera się empirycznie i zależy od powinowactwa oddziaływania przeciwciał z antygenem.

Na koniec inkubacji przemyć membranę 5 razy PBST i przenieść do roztworu przeciwciał wtórnych sprzężonych z peroksydazą chrzanową. Rozcieńczenie koniugatu jest zwykle wskazane przez producenta na opakowaniu lub dobierane jest empirycznie przez badacza. Inkubować membranę w roztworze przeciwciał drugorzędowych przez 1 godzinę, ciągle mieszając.

Po dokładnym przemyciu (zmiana buforu co najmniej 5-6 razy) membranę PBST przenosi się do chromogennego roztworu substratu zawierającego 3 mg diaminobenzydyny (DAB) i 10 µl 30% nadtlenku wodoru w 10 ml 0,1 M Tris-HCl , pH 7,6.

Inkubację prowadzi się mieszając przez 5 - 10 minut. Po zakończeniu inkubacji z podłożem membranę należy przemyć PBST, osuszyć bibułą filtracyjną i natychmiast kopia elektroniczna, skanowanie w kolorze. Jeśli membrana całkowicie wyschnie, pomalowane paski białkowe blakną, a obraz okazuje się mniej jasny i kontrastowy.

Uwaga: DAB jest toksyczny i potencjalnie rakotwórczy. Pracuj wyłącznie w gumowych rękawiczkach!