Glavne faze viroloških istraživanja. Virološka istraživanja. Korištenje vremenskog stroja

Virološka istraživanja u klinici zaraznih bolesti stječu svi veća važnost, što je prvenstveno zbog povećanja udjela virusnih infekcija, čija klinika nije uvijek tipična. Istodobno, brze i pouzdane metode virološke dijagnostike nisu razvijene za sve zarazne bolesti, mnoge su od njih mučne i zahtijevaju posebni uvjeti, pokusne životinje, mediji za kulturu i obučeno osoblje. Trenutno na dijagnozi virusne infekcije koristiti 3 glavne vrste istraživanja.
1. Mikroskopski pregled zaraznog materijala radi otkrivanja virusnog antigena ili patognomoničnih promjena u tkivima. U dijagnostičke svrhe, izravno mikroskopski pregled infektivni materijal bolesnika koristi se s ograničenim brojem virusnih infekcija (bjesnoća, vodene kozice, žuta groznica, herpes itd.). Metoda koja se temelji na detekciji virusnog antigena pomoću fluorescentnih antitijela dobila je širu primjenu. Metoda imunofluorescencije može biti pouzdana samo ako su strogo zadovoljeni svi tehnički zahtjevi.
2. Virološke metode.
3. Serološke studije za utvrđivanje povećanja titra antitijela u dinamici bolesti. U laboratoriju su dostupnije serološke metode istraživanja.
Za ove studije potrebno je uzimati serum krvi tijekom akutnog razdoblja bolesti i tijekom razdoblja rekonvalescencije (upareni serumi). Uzorci krvi za serološka istraživanja uzimaju se sterilno bez antikoagulansa i konzervansa.
Glavne faze viroloških istraživanja su izolacija virusa, njihova identifikacija, karakterizacija glavnih bioloških svojstava. Trenutno ne postoji jedinstvena metodologija za izoliranje različitih skupina virusa. To je prije svega zbog raznolikosti njihovih svojstava i karakteristika uzgoja izvan organizma domaćina. Za istraživanje se koriste biosupstrati (ispiranje sa sluznice, krvi i njezinih komponenata, likvora, mokraće i izmeta, biopsije organa i tkiva ili njihovi dijelovi uzeti tijekom obdukcije), koji se podvrgavaju posebnoj obradi nakon čega slijedi prolazak materijala. Materijal uzet za istraživanje treba čuvati na temperaturama od -20 ° C do -70 ° C. Ovisno o preliminarnoj dijagnozi, obrada materijala ima svoje osobine, ali u svim se slučajevima pretpostavlja da se dobiva supstrat koji je maksimalno pročišćen od nečistoća sluzi, stanica organa i tkiva ili njihovih fragmenata, bakterija. To se postiže homogenizacijom ispitivanog materijala u posebnom aparatu ili mljevenjem u porculanskom mortu na hladnom s kvarcnim staklom (komadići organa i tkiva) uz dodatak sterilno ohlađenog (+4 C) 0,9 %

otopina natrijevog klorida da se dobije 10-30% suspenzija i naknadno centrifugiranje pri 1500-3000 o / min tijekom 10-15 minuta. Tako dobiveni supernatant koristi se za daljnja istraživanja.
Prije intenzivan razvoj i korišteno je uvođenje u široku praksu metode kulture tkiva i stanica, infekcije pokusnih životinja ili pilećih embrija. Ove se metode još uvijek koriste. Otkrivanje virusa pomoću životinja najprikladnije je u onim slučajevima kada je u eksperimentu moguće reproducirati tipičnu sliku. zarazna bolest ili neke od njegovih manifestacija. Dakle, uzročnici arbovirusne i Coxsackiejeve skupine mogu se otkriti tijekom infekcije u mozgu dojenih miševa, gripe - tijekom infekcije pilećih embrija ili intranazalnog davanja ispitivanog materijala miševima. U virološkim laboratorijima posljednjih se godina najviše koristi metoda kulture stanica i tkiva, što omogućuje izolaciju adenovirusa, herpes virusa, respiratornog sincicijskog virusa, miksovirusa i drugih, te provođenje etiološke dijagnoze bolesti već u prvim fazama istraživanja. Razlog tome su dobro proučene citološke značajke interakcije većine virusa i stanica. Dakle, zaraza HeLa, Hep-2 stanica materijalom koji sadrži adenovirus tipa 2 već treći dan dovodi do promjene u načinu rasta staničnog jednosloja i do pojave tipičnih stanica u obliku grozdova itd., Dobro definiranih u uobičajenom svjetlosni mikroskop pri malom uvećanju.
Za etiološku dijagnozu zarazne bolesti od iznimne je važnosti standardizacija izolacije virusa iz ispitivanog materijala, koja u ovoj fazi rada uključuje upotrebu genetski čistih linearnih životinja, uzimajući u obzir njihove fenotipske (prvenstveno dobne) osobine. To je prvenstveno zbog činjenice da su pokusne životinje različitih genetskih linija i dobi u različitog stupnja osjetljiv na viruse. Tako se tijekom intracerebralne infekcije miševa neurotropnim sojem WSN virusa gripe kod BALB / c, A, CBA i neoplodnih životinja pokazalo da je osjetljivost najviša; isti je obrazac utvrđen u slučajevima intranazalne primjene ispitivanog materijala. Bitno za krajnji rezultati rad na izolaciji virusa ima preliminarni pregled životinja, pilećih embrija, kultura stanica i tkiva na latentne nositelje virusa. Pileći embriji, koji se široko koriste u laboratorijskoj praksi, mogu biti zaraženi virusima ptičje leukemije, ptičjeg encefalomielitisa, zaraznog sinusitisa, psitakoze, newcastleske bolesti, uzročnika nekih bakterijskih infekcija (paratifusna groznica itd.), Kao i mikoplazmom. Više više bakterijski, a posebno virusni agensi sposobni su spontano zaraziti kulturu stanica i tkiva i preživjeti u njima. Njihova prisutnost značajno utječe na procjenu materijala koji se proučava. Neke vrste mikoplazmi u kulturi stanica
mogu uzrokovati hemaglutinaciju i hemadsorpciju, pa čak i stvarati plakove ispod obloge od agara, slične onima koje tvore virusi. Zagađenje staničnih kultura jedne vrste drugima također je od velike važnosti, najčešće je povezano s HeLa stanicama i opaža se pri radu s različitim vrstama kultura u jednoj prostoriji, uz lošu obradu laboratorijskog staklenog posuđa itd. Prisutnost onečišćenja staničnih kultura ili zaraze životinja bakterijskim sredstvima, kao npr. u pravilu se očituje prilično jasno (promjene u prirodi rasta jednosloja stanica, svojstva medija za kulturu, smrt pilećih embrija ili životinja s određenim simptomima itd.) i ne predstavlja nikakve posebne poteškoće u procjeni rezultata. Komplicirano je pitanje s latentnim oblicima infekcije, gdje je potrebna uporaba seroloških i drugih metoda. Ove se upute trebaju uzeti u obzir u radu virologa, posebno kod provođenja etiološke dijagnoze nejasnih slučajeva bolesti.

Virološke metode istraživanja

metode proučavanja biologije virusa i njihova identifikacija. U virologiji su široko korištene metode molekularne biologije uz pomoć kojih je bilo moguće uspostaviti molekularnu strukturu virusnih čestica, metode njihovog prodiranja u stanicu i značajke razmnožavanja virusa, primarnu strukturu virusnih nukleinskih kiselina i proteina. Razvijaju se metode za određivanje slijeda sastavnih elemenata virusnih nukleinskih kiselina i proteinskih aminokiselina. Postaje moguće povezati funkcije nukleinskih kiselina i proteina koji ih kodiraju s nukleotidnom sekvencom i utvrditi uzroke unutarstaničnih procesa koji igraju važnu ulogu u patogenezi virusne infekcije.

Virološke metode istraživanja također se temelje na imunološkim procesima (interakcija antigena s antitijelima), biološkim svojstvima virusa (sposobnost hemaglutinacije, hemolize, enzimske aktivnosti), osobenostima interakcije virusa sa stanicom domaćina (priroda citopatskog učinka, stvaranje unutarstaničnih inkluzija itd.) ...

U dijagnozi virusnih infekcija, u uzgoju, izolaciji i identifikaciji virusa, kao i u pripremi cjepiva, široko se koristi metoda kulture tkiva i stanica. Koriste se primarne, sekundarne, stabilne transplantabilne i diploidne stanične kulture. Primarne kulture dobivaju se raspršivanjem tkiva s proteolitičkim enzimima (tripsin, kolagenaza). Izvor stanica mogu biti tkiva i organi (obično bubrezi) ljudskih i životinjskih embrija. Suspenzija stanica u hranjivom mediju stavlja se u takozvane madrace, boce ili Petrijeve zdjelice, gdje se stanice nakon pričvršćivanja na površinu posude počinju množiti. Za infekciju virusima obično se koristi stanični jednosloj. Hranjiva tekućina se odbacuje, virusna suspenzija uvodi se u određenim razrjeđenjima, a nakon kontakta sa stanicama dodaje se svježi hranjivi medij, obično bez seruma.

Stanice većine primarnih kultura mogu se supkultivirati; ta se kultura naziva sekundarnom. Daljnjim prolazom stanica stvara se populacija stanica sličnih fibroblastima, sposobna za brzu reprodukciju, većina koji čuva izvorni set kromosoma. To su takozvane diploidne stanice. Serijskim uzgojem stanica dobivaju se stabilne kontinuirane kulture stanica. Tijekom prolaza pojavljuju se brzo dijeleće homogene stanice s heteroploidnim skupom kromosoma. Stabilne stanične linije mogu biti jednoslojne i suspenzijske. Jednoslojne kulture rastu u obliku kontinuiranog sloja na staklenoj površini, suspenzijske kulture rastu u obliku suspenzija u različitim posudama pomoću uređaja za miješanje. Postoji preko 400 staničnih linija izvedenih iz 40 različiti tipovi životinje (uključujući primate, ptice, gmazove, vodozemce, ribe, insekte) i ljude.

U umjetnim hranjivim podlogama možete kultivirati dijelove pojedinih organa i tkiva (kultura organa). Ove vrste kultura čuvaju strukturu tkiva, što je posebno važno za izolaciju i prolaz virusa koji se ne razmnožavaju u nediferenciranim kulturama tkiva (na primjer, koronavirusi).

U zaraženim staničnim kulturama virusi se mogu otkriti promjenom morfologije stanica, citopatskim učinkom koji može biti specifičan, pojavom inkluzija određivanjem virusnih antigena u stanici i u tekućini za uzgoj; utvrđivanje bioloških svojstava virusnog potomstva u tekućini za uzgoj i titriranje virusa u kulturi tkiva, pilećih embrija ili kod osjetljivih životinja; otkrivanjem pojedinačnih virusnih nukleinskih kiselina u stanicama molekularnom hibridizacijom ili nakupinama nukleinskih kiselina citokemijskom metodom pomoću fluorescentne mikroskopije.

Izoliranje virusa naporan je i dugotrajan proces. Provodi se kako bi se utvrdila vrsta ili varijanta virusa koji cirkulira među populacijom (na primjer, kako bi se identificirao serovarijant virusa gripe, divlji ili cjepivi soj virusa poliomijelitisa, itd.); u slučajevima kada je to potrebno za hitne epidemiološke mjere; kada se pojave nove vrste ili inačice virusa; ako je potrebno, potvrda preliminarne dijagnoze; za označavanje virusa u objektima okoliš... Kada izolirate viruse, uzmite u obzir mogućnost njihovog postojanja u ljudskom tijelu, kao i pojavu mješovite infekcije koju uzrokuju dva ili više virusa. Genetski homogena populacija virusa dobivena od jednog viriona naziva se virusni klon, a postupak dobivanja naziva kloniranje.

Za izolaciju virusa koristi se infekcija osjetljivih laboratorijskih životinja, pilećih embrija, ali najčešće se koristi kultura tkiva. Prisutnost virusa obično se određuje specifičnom degeneracijom stanica (citopatski učinak), stvaranjem simplasta i sincicije, otkrivanjem unutarstaničnih inkluzija, kao i specifičnim antigenom otkrivenim metodama imunofluorescencije, hemadsorpcije, hemaglutinacije (kod virusa hemaglutinacije) itd. Ovi se znakovi mogu otkriti tek nakon 2-3 prolaza virusa.

Pileći embriji koriste se za izolaciju određenog broja virusa, na primjer virusa gripe, za izolaciju nekih Coxsackie virusa i niza arbovirusa - novorođenih miševa. Identificirani virusi identificiraju se pomoću seroloških testova i drugih metoda.

Pri radu s virusima određuje se njihov titar. Titracija virusa obično se provodi u kulturi tkiva, određujući najveće razrjeđenje cijepljene tekućine, pri kojoj dolazi do degeneracije tkiva, stvaranja inkluzija i antigena specifičnih za virus. Metoda plaka može se koristiti za titraciju brojnih virusa. Plakovi ili negativne kolonije virusa žarišta su uništenih virusom stanica u jednoslojnoj kulturi tkiva pod oblogom od agara. Broj kolonija dopušta kvantitativna analiza zarazna aktivnost virusa na osnovi toga da jedna zarazna čestica virusa tvori jedan plak. Plakovi se otkrivaju bojanjem kulture vitalnim bojama, obično neutralno crvenom; plakovi ne adsorbiraju boju i stoga su vidljivi kao svjetlosne mrlje na pozadini obojenih živih stanica. Titar virusa izražava se brojem jedinica koje stvaraju plak u 1 ml.

Pročišćavanje i koncentracija virusa obično se provodi diferencijalnim ultracentrifugiranjem nakon čega slijedi centrifugiranje koncentracijom ili gradijentom gustoće. Za pročišćavanje virusa koriste se imunološke metode, ionsko-izmjenjivačka kromatografija, imunosorbenti itd.

Laboratorijska dijagnostika virusnih infekcija uključuje otkrivanje patogena ili njegovih komponenata u kliničkom materijalu; izolacija virusa iz ovog materijala; serodijagnostika. Izbor laboratorijske dijagnostičke metode u svakom pojedinom slučaju ovisi o prirodi bolesti, razdoblju bolesti i mogućnostima laboratorija. Suvremena dijagnostika virusne infekcije temelje se na ekspresnim metodama koje vam omogućuju odgovor nekoliko sati nakon uzimanja kliničkog materijala rani datumi nakon bolesti, uključuju elektronsku i imunološku elektronsku mikroskopiju, kao i imunofluorescenciju, molekularnu hibridizaciju, otkrivanje IgM antitijela itd.

Elektronska mikroskopija virusa obojenih negativnim kontrastnim bojanjem omogućuje razlikovanje virusa i određivanje njihove koncentracije. Upotreba elektronske mikroskopije u dijagnozi virusnih infekcija ograničena je na one slučajeve kada je koncentracija virusnih čestica u kliničkom materijalu dovoljno visoka (10 5 u 1 mli više). Nedostatak ove metode je nemogućnost razlikovanja virusa koji pripadaju istoj taksonomskoj skupini. Ovaj nedostatak uklanja se imunološkom elektronskom mikroskopijom. Metoda se temelji na stvaranju imunoloških kompleksa kada se virusnim česticama doda određeni serum, dok istovremeno postoji koncentracija virusnih čestica, što ih omogućava identificirati. Metoda se koristi i za otkrivanje protutijela. U svrhu ekspresne dijagnostike provodi se elektronsko mikroskopsko ispitivanje ekstrakata tkiva, izmeta, tekućine iz vezikula, sekreta iz nazofarinksa. Elektronska mikroskopija široko se koristi za proučavanje morfogeneze virusa; njegove se mogućnosti proširuju upotrebom obilježenih antitijela.

Metoda molekularne hibridizacije, koja se temelji na otkrivanju virusom specifičnih nukleinskih kiselina, omogućuje otkrivanje pojedinačnih kopija gena i nema jednak stupanj osjetljivosti. Reakcija se temelji na hibridizaciji komplementarnih lanaca DNA ili RNA (sonde) i stvaranju dvolančanih struktura. Najjeftinija sonda je klonirana rekombinantna DNA. Sonda je označena radioaktivnim prekursorima (obično radioaktivnim fosforom). Primjena kolorimetrijskih reakcija obećava. Postoji nekoliko mogućnosti molekularne hibridizacije: točkovna, blot hibridizacija, sendvič hibridizacija, in situ hibridizacija itd.

Protutijela klase lgM pojavljuju se ranije od antitijela klase G (na 3-5. Dan bolesti) i nestaju nakon nekoliko tjedana, pa njihovo otkrivanje ukazuje na netom prenijetu infekciju. Protutijela IgM otkrivaju se imunofluorescentnim ili enzimski povezanim imunosorbentom pomoću anti-μ-antisera (serumi teškog lanca protiv IgM).

Serološke metode u virologiji temelje se na klasičnim imunološkim reakcijama (vidi Imunološke metode istraživanja) : reakcije vezivanja komplementa, inhibicija hemaglutinacije, biološka neutralizacija, imunodifuzija, neizravna hemaglutinacija, radijalna hemoliza, imunofluorescencija, enzimski imunološki test, radioimunološki test. Razvijene su mikrometode za mnoge reakcije, a njihova se tehnika neprestano poboljšava. Ove se metode koriste za identificiranje virusa pomoću skupa poznatih seruma i za serodijagnostiku kako bi se utvrdio porast protutijela u drugom serumu u odnosu na prvi (prvi se serum uzima u prvim danima nakon bolesti, drugi - nakon 2-3 tjedna). Dijagnostička vrijednost je ne manje od četverostrukog povećanja protutijela u drugom serumu. Ako otkrivanje IgM antitijela ukazuje na nedavnu infekciju, tada IgC antitijela traju nekoliko godina, a ponekad i cijeli život.

Da bi se identificirali pojedinačni antigeni virusa i antitijela na njih u složenim smjesama bez prethodnog pročišćavanja proteina, koristi se imunobloting. Metoda kombinira frakcioniranje proteina elektroforezom u poliakrilamidnom gelu s naknadnom imunoindikacijom proteina enzimskim imunološkim testom. Odvajanje proteina smanjuje zahtjeve za kemijskom čistoćom antigena i omogućuje otkrivanje pojedinačnih parova antigen-antitijelo. Ovaj je zadatak relevantan, na primjer, u serodijagnozi HIV infekcije, gdje su lažno pozitivne reakcije enzimskog imunološkog ispitivanja posljedica prisutnosti antitijela na stanične antigene, koja su prisutna kao rezultat nedovoljnog pročišćavanja virusnih proteina. Identifikacija antitijela u serumima bolesnika na unutarnje i vanjske virusne antigene omogućuje određivanje stadija bolesti, a u analizi populacija varijabilnost virusnih proteina. Imunobloting za HIV infekciju koristi se kao potvrdni test za otkrivanje pojedinačnih virusnih antigena i antitijela na njih. Pri analizi populacija, metoda se koristi za određivanje varijabilnosti virusnih proteina. Velika vrijednost metode leži u mogućnosti analize antigena sintetiziranih tehnologijom rekombinantne DNA, određivanja njihove veličine i prisutnosti antigenih determinanti.

Virološke studije su studije namijenjene izolaciji virusa i proučavanju njihovih svojstava, kao i utvrđivanju etiološkog odnosa virusa s određenim bolestima.

Materijal za istraživanje uzima se ovisno o mjestu dominantnih virusa u tijelu pacijenta i o načinima njihovog puštanja u vanjsko okruženje. Materijal se sakuplja u sterilnu posudu, dostavlja u laboratorij što je brže moguće i čuva se smrznut ili na ledu do studije. Prije upotrebe, materijal za izolaciju virusa obrađuje se radi suzbijanja strane mikroflore i izlaže uklanjanju velikih čestica.

Izolacija virusa provodi se zarazi cijepljenim materijalom laboratorijskih životinja, pilećih embrija i kulture tkiva. Izbor metode izolacije ovisi o navodnom uzročniku bolesti. Dakle, kulture tkiva (vidi) koriste se u radu s virusima koji nisu patogeni za laboratorijske životinje ili kada su otkriveni u kulturi tkiva ranije nego kad su životinje zaražene. Pileći embriji zaraženi su kako bi se izolirali patogeni, zarazni zaušnjaci (u amnionskoj i alantoičnoj šupljini), (u žumanjčanoj vrećici), velike boginje (na horionalantoičnoj membrani).

Od laboratorijskih životinja za izolaciju virusa najčešće se koriste bijeli miševi, zatim kunići, štakori, zamorci, majmuni. Za arboviruse je najučinkovitije uvođenje cijepljenog materijala u glavu ili, za pneumotropne viruse, u sluznicu dišni put, za viruse malih boginja, na skarificiranoj rožnici.

Izolacija virusa je najučinkovitija u akutnom razdoblju bolesti. Bitna točka u utvrđivanju virusne prirode bolesti su rezultati seroloških ispitivanja seruma uzetih od istog pacijenta na početku bolesti i tijekom razdoblja rekonvalescencije. Otkrivanje protutijela na izolirane viruse u drugom serumu u titru 4 ili više puta većem nego u prvom ukazuje na etiološku povezanost virusa s ovom bolešću.

Rano i brza metoda otkrivanje virusnih antigena metoda je fluorescentnih antitijela, koja se temelji na specifičnoj fiksaciji antitijela obilježenih fluorokromom na površini antigena. Antigen se lako otkriva fluorescentnom mikroskopijom (vidi) zbog svijetle fluorescencije antitijela adsorbiranih na antigenu. Metoda fluorescentnih antitijela ispituje mrlje uzete pacijentima, histološke rezove zahvaćenih tkiva, preparate za kulturu tkiva. Za otkrivanje elementarnih tijela (virioni) također se koriste (vidi). Među ostalim morfološkim metodama koriste se one koje otkrivaju unutarstanične virusne inkluzije u dijelovima zahvaćenih organa i tkiva. Otkrivanje inkluzija ukazuje na infekciju i u nekim slučajevima pridonosi dijagnozi virusne bolesti. Razni se koriste za otkrivanje virusnih antitijela u krvi pacijenata i za proučavanje antigene strukture virusa. Reakcija neutralizacije koristi se kod gotovo svih virusnih infekcija. Temelji se na sposobnosti imunoloških antitijela da neutraliziraju zarazna svojstva virusa kada se smjesa unese u tijelo osjetljivih životinja ili u kulturu tkiva. Da bi se odredio indeks neutralizacije, konstantna doza seruma miješa se s raznim razrjeđenjima virusa, a za određivanje titra antitijela, razna razrjeđenja seruma s konstantnom dozom virusa. Suzbijanje je zaraza životinja (ili kultura tkiva) mješavinom virusa s normalnim serumom ili s fiziološka otopina... Reakcija neutralizacije provodi se ne samo za otkrivanje protutijela, već i za određivanje vrste i vrste virusa.

Test vezanja komplementa [na primjer, Bordet-Zhanguova reakcija (vidi)] koristi se za otkrivanje i virusnih antigena i antitijela. U prvom slučaju, poznati imunološki serum i materijal u kojem bi prisutnost antigena trebala reagirati u reakciji: serum krvi, ispiranje nazofarinksa, ekstrakti tkiva zaraženog organizma. U drugom slučaju, poznati antigen (diagnostik) i serum pacijenta ili rekonvalescenta.

RSC se koristi za dijagnozu bolesti uzrokovanih virusima gripe, malim boginjama, adenovirusima i arbovirusima.

U laboratorijska dijagnostika virusne infekcije postoje tri glavna pristupa

1) izravno ispitivanje materijala na prisutnost virusnog antigena ili nukleinskih kiselina;

2) izolacija i identifikacija virusa iz kliničkog materijala;

Izravne metode za dijagnozu kliničkog materijala

Izravne metode su metode koje omogućuju otkrivanje virusa, virusnog antigena ili virusne nukleinske kiseline (NK) izravno u kliničkom materijalu, odnosno najbrže su (2-24 sata).

Elektronska mikroskopija (EM). Pomoću ove metode možete otkriti stvarni virus.

imunska elektronska mikroskopija (IEM), koja koristi specifična antitijela na viruse. Kao rezultat interakcije antitijela s virusima nastaju kompleksi koje je nakon negativnog kontrastiranja lakše otkriti.

Reakcija imunofluorescencije (RIF). Metoda se temelji na uporabi antitijela vezanih za boju

Metoda RIF široko se koristi za brzo dešifriranje etiologije akutnih respiratornih virusnih infekcija u analizi otisaka iz sluznice gornjih dišnih putova.

Enzimski vezani imunosorbentni test (ELISA). Metode enzimskog imunološkog ispitivanja za određivanje virusnih antigena u principu su slične RIF-u, ali se temelje na obilježavanju antitijela enzimima, a ne bojama.

Radioimunološki test (RIA). Metoda se temelji na obilježavanju antitijela radioizotopima, što je osiguralo visoku osjetljivost u određivanju virusnog antigena.

Molekularne metode. U početku se klasična metoda za otkrivanje virusnog genoma smatrala visoko specifičnom metodom NK hibridizacije, ali danas se izolacija virusnih genoma pomoću polimeraze lančana reakcija (PCR).

Molekularna hibridizacija nukleinskih kiselina. Metoda se temelji na hibridizaciji komplementarnih DNA ili RNA lanaca s formiranjem dvolančanih struktura i na njihovoj identifikaciji

PCR se temelji na principu prirodne replikacije DNA. Suština metode leži u ponovljenom ponavljanju ciklusa sinteze (amplifikacije) sekvence DNA specifične za virus pomoću termostabilne Taq DNA polimeraze i dva specifična početnika - takozvani početnici.

Citološke metode trenutno imaju ograničenu dijagnostičku vrijednost, ali se i dalje trebaju koristiti za brojne infekcije. Ispituju se materijali za obdukciju, biopsiju, razmaze koji se nakon odgovarajuće obrade boje i analiziraju pod mikroskopom.

Za uspješnu izolaciju virusa klinički materijal treba uzimati u skladu s patogenezom navodne bolesti i što je prije moguće.

U pravilu se uzima:

- kod respiratornih infekcija - ispiranje nazofarinksa;

- za infekcije enterovirusima - ispiranje i izmet (reo-, enterovirusi);

- s lezijama kože i sluznice - struganje, sadržaj vezikula (herpes, vodene kozice);

- s egzantemskim infekcijama - ispiranja (ospice, rubeola);

- za infekcije arbovirusima - krv, cerebrospinalna tekućina.

Za izolaciju virusa koriste se stanične kulture, laboratorijske životinje i pileći embriji. Proces je dug, ponekad zahtijeva nekoliko prolaza prije nego što se virus otkrije i identificira pomoću jedne ili nekoliko metoda - u reakciji neutralizacije (RN), RIF, ELISA ili PCR.

Serodijagnostika

Serološka dijagnostika koja se temelji na reakciji antigen-antitijelo može se koristiti za određivanje i onih i drugih, a igra ulogu u određivanju etiologije virusne infekcije čak i kod negativni rezultati izolacija virusa.

CSC je jedan od tradicionalnih seroloških testova i koristi se za dijagnosticiranje mnogih virusnih infekcija. U reakciji sudjeluju dva sustava: antitijela seruma pacijenta + standardni virus i ovčji eritrociti + antitijela na njih, kao i titrirani komplement. Kada se antitijela i virus podudaraju, ovaj kompleks veže komplement i ne dolazi do lize ovčjih eritrocita (pozitivna reakcija). S negativnim CSC-om, komplement potiče lizu eritrocita. Nedostatak ove metode je nedovoljno visoka osjetljivost i poteškoće u standardizaciji reagensa, a IF metoda, poput ELISA, koristi se za određivanje antitijela u serumu.

Istraživanje za dijagnozu virusnih bolesti. To je neophodno za identifikaciju virusa, proučavanje njegove biologije i sposobnosti utjecaja na životinjske i ljudske stanice. Dakle, postaje moguće razumjeti patogenezu virusne bolesti i, u skladu s tim, odabrati pravu metodu liječenja.

Koja je dijagnoza?

U živim stanicama. Da bi se to istražilo, potrebno je uzgajati na razini eksperimentalnog organizma, ili se za to provode virološke metode istraživanja u medicinskoj praksi i mikrobiologiji općenito, koje imaju sljedeće glavne pristupe:

• ravno;
• neizravno;
• serološki.

Materijal se može izravno ispitati na prisutnost nukleinskih kiselina, virusnog antigena ili, na primjer, virus se može izolirati i identificirati iz kliničkog materijala.

Uz sposobnost utvrđivanja etiologije bolesti, praćenja terapijskog učinka, virološke metode istraživanja igraju važnu ulogu u protuepidemijskim mjerama. Pileći embriji, laboratorijske životinje ili stanične kulture koriste se za izolaciju i upotrebu.

Kako se istražuje?

Najbrža je izravna metoda. Omogućuje otkrivanje virusa, antigena ili NK (nukleinske kiseline) u samom kliničkom materijalu. Potrebno je vrijeme od dva sata do dana.

1. EM - elektronska mikroskopija. Otkriva virus izravno.
2. IEM - imunološka elektronska mikroskopija. Koristi specifična antitijela na viruse.
3. RIF - reakcija imunofluorescencije. Koristi antitijela vezana na boju. Takve se virološke metode istraživanja široko koriste kao brzo dekodiranje etiologije ARVI (akutne respiratorne virusne infekcije), kada se uzimaju razmazi iz sluznice gornjih dišnih putova.
4. ELISA - enzimski imunološki test - određivanje virusnih antigena, sličnih RIF-u, ali na temelju obilježavanja antitijela enzimima.
5. RIA - radioimunološki test. Koristi radioizotopsko obilježavanje antitijela kako bi pružio visoku osjetljivost u otkrivanju virusnog antigena.
6. Molekularna - hibridizacija NK ili izolacija virusnih genoma pomoću PCR-a (lančana reakcija polimeraze).
7. Citologija se rijetko koristi, ali za određene infekcije ove su virološke metode istraživanja vrlo učinkovite. Biopsije, obdukcije i razmazi ispituju se radi bojenja i mikroskopske analize.

Koja je svrha istraživanja?

Za uspješnu izolaciju virusa uzima se klinički materijal u skladu s patogenezom i što je ranije moguće. Ovaj postupak često zahtijeva nekoliko odlomaka prije primjene određenih viroloških metoda istraživanja.

Mikrobiologija proučava mikroskopska bića. A njezino područje nije samo lijek. To je temeljna znanost za poljoprivreda, veterina, svemirska i tehnička industrija, geologija.

Ali, naravno, sve je stvoreno za čovjeka i njegov razvoj na ovom prekrasnom planetu. Stoga je vrlo važno na vrijeme otkriti opasnost i neutralizirati je. Virusi se razlikuju od bakterija. To su strukture koje ulaze u tijelo i uzrokuju stvaranje nove generacije. Izgledaju poput kristala i usmjereni su na kontrolu procesa njihovog razmnožavanja, iako se oni sami ne hrane, ne rastu i ne izlučuju metaboličke produkte.

Virus je sposoban izazvati ozbiljne bolesti u bilo kojem živom organizmu u koji je pao. Osim toga, može se razvijati. Zbog toga treba razvijati i poboljšavati virološke metode istraživanja u mikrobiologiji, budući da je ljudska civilizacija u cjelini možda ugrožena.

Materijali

Za otkrivanje i identifikaciju virusa u medicini, u pravilu se poduzimaju:

• ispiranje nazofarinksa (respiratorne infekcije);
• ispiranje i izmet ( enterovirusne infekcije);
• struganje, sadržaj vezikula (lezije kože, sluznica, poput herpesa, vodenih kozica);
• crvenila (egzantemske infekcije poput ospica, rubeole);
• krv, likvor (arbovirusne infekcije).

Faze

Sve faze metode virusološkog istraživanja uključuju:

• unos materijala;
• odabir, primitak ispitnog sustava, utvrđivanje njegove održivosti;
• infekcija testnog sustava;
• indikacija virusa;
• određivanje vrste virusa.

U osnovi se patogeni virusi razlikuju po prisutnosti tkiva i specifičnosti tipa. Uzmimo na primjer poliovirus koji se razmnožava samo kod primata (u njihovim stanicama). U skladu s tim, specifična kultura tkiva koristi se za izolaciju određenog virusa. Ako govorimo o nepoznatom patogenu, tada bi bilo uputno istovremeno zaraziti tri, a po mogućnosti četiri stanične kulture.

Stoga će možda netko od njih biti osjetljiv. Da bi utvrdili prisutnost virusa u zaraženim kulturama, oni promatraju razvoj specifične stanične degeneracije, unutarstaničnih inkluzija, otkrivanje specifičnog antigena, pozitivne reakcije hemaglutinacije i hemadsorpcije.

Sve virološke metode istraživanja (izravne i neizravne, serološke) trebaju biti odabrane kao najprikladnije za specifični slučaj navodne infekcije.

Neizravne metode temelje se na izolaciji i identifikaciji virusa. Zahtjevni su za rad, dugotrajni, ali precizni.

Serodijagnostika

Takva dijagnoza znači metodu koja se temelji na reakciji antigen-antitijelo. Najčešće se koriste upareni serumi krvi, uzimani u intervalima od nekoliko tjedana. Ako je porast titra antitijela 4 ili više puta, reakcija se smatra pozitivnom. Da bi se utvrdila vrsta-specifičnost virusa, koristi se reakcija neutralizacije virusa. Da biste odredili specifičnost skupine, morate dobiti reakciju vezanja komplementa.

Široko upotrebljavan razne opcije enzimski imunološki test, reakcija inhibicije hemaglutinacije, pasivna hemaglutinacija, reverzna pasivna hemaglutinacija, RIF. Čak je i u genetskom inženjerstvu razvijena metoda za proizvodnju monoklonskih antitijela. Uska specifičnost monoklona može se prevladati upotrebom višestrukih monoklonskih antitijela na različite virusne odrednice. Dakle, povećana je specifičnost i osjetljivost studije s određivanjem antigena.

Neke značajke

Danas su stvoreni mnogi različiti testni sustavi za imunološku dijagnozu infekcija nastalih prodorom virusa u živi organizam.

Dakle, virološke metode istraživanja načini su izoliranja virusa, proučavanja njihovih svojstava i uspostavljanja njihove etiološke povezanosti s određenim bolestima.