Imunoblotting (antikūnų identifikavimas serume serume į tam tikrus sukėlėjingų agentų antigenus). Kaip atliekamas AIDS diagnozė ImunoBlot už ŽIV III yra atliekamas. Nitroceliuliozės membranoje imunocheminiai baltymų imunocheminiai dažai

Kas tai - Imunoblot? Tai yra bendras žmogaus virusinių infekcijų laboratorinės diagnostikos metodas. Manoma, viena iš tiksliausių ir patikimų būdų, kaip nustatyti ŽIV. Savo patikimumu jis viršija net imunoBlot rezultatus laikomi nepagrįstu ir galutiniu.

Bendra informacija

ImmunoBlot - kas tai? Siekiant atpažinti ŽIV infekciją žmonėms, būtina atlikti kraujo serumo laboratorinių bandymų metodą prie antikūnų buvimo. Imunoblotting metodas taip pat vadinamas Vakarų dėmėju (Vakarų dėmė). Jis naudojamas aptikti žmogaus virusines infekcijas kaip papildomą ekspertų kelią. Būtina patvirtinti IFA - laboratorijos tyrimą, kuris leidžia nustatyti ŽIV antikūnų buvimą kraujyje. Imunoblotting yra tikrinamas teigiama ELISA analizė. Jis laikomas jautriausiu, sudėtingiausiu ir brangiu.

Tikslas. \\ T

Kas tai - Imunoblot? Tai yra kraujo serumo laboratorinių bandymų antikūnų buvimas virusui. Tyrimo metu specialistas preliminariai dalijasi viruso baltymais gelio ir perduoda juos į nitroceliuliozės membraną. Imunoblotavimo procedūra skirta nustatyti ŽIV skirtingais etapais. Pirmajame etape išgrynintas virusas iš komponentų dalių yra veikiamos elektroforezės, o antigenai, įtraukti į jo sudėtį, yra atskirti molekuliniu mastu.

Dauginama gyvenamojoje narve, įterpdamas savo genetinę informaciją į jį. Šiame etape asmuo tampa ŽIV viruso vežėju, jei užkrėsta. Ligos specifika yra ta, kad ji nebegali būti vykdoma ilgą laiką. Virusas sunaikina limfocitus, todėl žmogaus imunitetas mažėja, o kūnas negali atsispirti infekcijoms. Jei ŽIV kompetentingai ir laiku gydyti, pacientas gyvens iki gilaus amžiaus. Gydymo nebuvimas neišvengiamai lemia mirtiną rezultatą. Nuo infekcijos, bet be gydymo, maksimalus gyvenimas yra ne daugiau kaip dešimtmetį.

funkcijos

"ImunoBlot" analizė yra patikimas metodas, leidžiantis nustatyti antikūnų buvimą į ŽIV antigenus pirmojo ir antrojo tipo. Jei asmuo yra užkrėstas, antikūnai, kuriuos galima aptikti ir vėliau atsiranda per dvi savaites. ŽIV bruožas yra tai, kad antikūnų kiekis sparčiai didėja ir yra išsaugotas paciento kraujyje. Net jei jie yra, liga negali pasireikšti per du ar daugiau metų. ELISA metodas ne visada tiksliai nustato ligos buvimą, todėl rezultatų patvirtinimas imunoblotavimu ir PCR, jei imunologinė analizė parodė teigiamą rezultatą.

Nurodymas paskyrimui

Kas yra "Imunoblot" jau sužinojo, bet kas nustato šį tyrimą? Priežastis perduoti bandymus dėl imunobloteravimo metodo tampa teigiamu ELISA rezultatais. Būtina eiti per imunoferacijos analizę pacientams, kurie bus valdomi. Be to, būtina atlikti nėštumo planavimo moterų analizę, taip pat visiems, kurie veda nepatogią sekso gyvenimą. ŽIV imunoblotting sergantiems pacientams, jei IFA rezultatai sukelia abejones. Šie nerimą keliantys simptomai gali tapti priežastimi kreiptis į gydytoją:

aštrių svorio netekimas;
silpnumas, našumo praradimas;
žarnyno sutrikimas (viduriavimas), tęsiantis tris savaites;
kūno dehidratacija;
karščiavimas;
padidėjęs limfmazgių ant kūno;
kandidozės, tuberkuliozės, pneumonijos, toksoplazmozės, herpeso paūmėjimo plėtra.

Pacientas nereikia būti pasirengęs prieš perduodant venų kraują. 8-10 valandų iki tyrimo negali būti valgoma. Jis nerekomenduojamas prieš dieną, kol kraujas būtų skiriamas naudoti alkoholinius ir kavos gėrimus, įsitraukti į didelį pratimą, garbinant jaudulį.

Kur atlikti analizę?

Kur galiu perduoti ŽIV? "ELISA", "ImunoBlot" tyrimai atliekami miesto privačiose klinikose, rezultatai išduodami per dieną. Galima skubiai diagnostika. Valstybinėse medicinos įstaigose, IFA bandymai ir imunoblotavimas atliekamas nemokamai, atsižvelgiant į Rusijos Federacijos teisės aktus. Privaloma, nėščios moterys yra tikrinamos infekcinių ligų, taip pat pacientams, kuriems yra hospitalizavimo ar veikimo intervencija.

Kaip tyrimas?

Kaip IFA analizė? Imunoblot teigiamas / neigiamas patvirtina arba paneigia imunologinės analizės rezultatus. Studijų procedūra yra gana paprasta. Specialistas atlieka venų kraujo tvorą, laiko užtrunka ne ilgiau kaip penkias minutes. Pavyzdžiui, injekcijos vieta turi būti dezinfekuojama ir įstrigo su tinku. Tvora atliekama ant tuščio skrandžio, todėl po procedūros ji nebus pakenkta valgyti plytelių kartaus šokolado arba gerti saldų karšto gėrimo.

Norint gauti nuorodą į nemokamą analizę valstybinėje medicinos įstaigoje, turite apsilankyti pas gydytoją. Apskritai, imunoblotas nesiskiria nuo kitų kraujo tyrimų pagal tvoros metodą. Studijų metodas yra paprastas. Jei virusas yra asmens kraujyje, jo sunaikinimo organizmas pradeda gaminti antikūnus. Kiekvienam virusui yra antigenų baltymų rinkinys. Šių antikūnų identifikavimas yra imunoblotavimo technikos pagrindas.

Kaina

Kiek yra analizė? Immunoblot apie ŽIV netaikomas pigiems tyrimams. Vidutiniškai patikrinkite, ar imunoferacijos metodai kainuoja nuo 500 iki 900 rublių. Imunoblotting yra tikrinimo tyrimas, kurio kaina svyruoja nuo trijų iki penkių tūkstančių rublių. Sudėtingesni metodai yra daug brangesni. Pavyzdžiui, reikės mokėti apie 12 000 rublių.

Rezultato aiškinimas

Dažniausi ŽIV infekcijos diagnozavimo būdai yra imunologinė analizė ir imunoblotas. Jie naudojami norint nustatyti antikūnus į imunodeficito virusą. Infekcijos buvimą paprastai patvirtina du bandymai: patikrinimas ir patvirtinimas. Tyrimo rezultatų aiškinimą turėtų atlikti gydytojas, jis taip pat pateikia diagnozę ir nustato gydymą. Jei imunoblotas yra teigiamas, tai reiškia, kad virusas yra žmogaus organizme.

Teigiamas rezultatas neturėtų būti savarankiško gydymo priežastis, nes kiekvienas pacientas gali turėti savo ligos vaizdą. Kokybinė analizė apima atranką ir užsitikrina. Jei pacientas nenustato viruso, tada kaip rezultatas rodo "neigiamai". Aptikta atrankos metodas, atliekamas papildomas imperatyvo tyrimas. ImmunoBlot yra analizė, patvirtinanti arba paneigia ekrano užsklandą. Jei tamsūs atsiranda bandymų juostele (baltymų lokalizavimo vietose), jie diagnozuojami ŽIV. Jei rezultatai sukelia abejones, analizės atliekamos per tris mėnesius.

Nefekcija su imunodeficito virusu gali būti užkrėsta tam tikromis taisyklėmis: išvengti atsitiktinių seksualinių santykių, naudokite prezervatyvą kontaktų metu, nevartokite narkotikų. Jei liga randama nėščiojoje moteriai, svarbu aiškiai atitikti gydytojo rekomendacijas, nepamirškite atlikti apklausų dėl viruso buvimo.

Kraujas paimtas iš Vienos. Tyrimas praeina pagal instrukcijas:

pavyzdys yra dedamas į gelio elektroforetinį atskyrimą, todėl yra gaunami konkretūs baltymai, kurie yra jautrūs virusui;
nitroceliuliozinis popierius yra sujungtas ant perdirbto gelio;
paruoštas mėginys dedamas į blotavimo bloką.

Norėdami nustatyti konkrečius fermentus, būtina tinkamai parengti popierių laboratoriniams tyrimams. Dėl to, antikūnai ir paženklintas radioaktyviųjų konjugatas yra taikomas. Tyrimo rezultatas vertinamas vizualiai, ištirti pastatytas fermentų grandines.

Dekodavimo rezultatai

Po to, kai lieka popieriaus manipuliavimas, juospa išlieka. Jie yra ten, kur įvyko konjugacija, tai yra, taikomojo vaisto įvesta į reakciją su viruso baltymu. Tokiu būdu galima aptikti baltymų dalis:

nuo ŽIV-1 - P17, P24, P55;
ŽIV-2 - P16, P26, P56 patogenas.

Imunoblotavimo rezultatai yra teigiami, jei buvo rasta 2 iš 3 ŽIV-1 baltymų arba ŽIV-2. Kadangi dažnai Vakarų dėmė (antrasis tyrimo pavadinimas) naudojamas patvirtinti teigiamą ELISA, reakcija yra išbandyta konkrečiais baltymais: GP120 / 160, GP41 arba P24. Jie yra trijų pagrindinių AIDS genų - Gag, Pol ir Env. Pirminėje diagnostikoje bandymas atliekamas tik apie P25 baltymus, GP110 / 120 ir GP160, jei jis davė teigiamą rezultatą, tada bandymas atliekamas P24. Ši baltymo dalis leidžia aptikti virusą ankstyvame etape.

Teigiamas rezultatas yra priežastis kreiptis dėl sudėtingesnės diagnozės. Tai yra klaidinga tik 3 atvejais:

pacientams, sergantiems dideliu bilirubinu;
patekus su virusiniu antigenais;
jungiamojo audinio patologijose.

Jei pacientas neturi linijų, atitinkančių AIDS baltymus, rezultatas vertinamas kaip neigiamas. Tai reiškia, kad asmuo nėra užkrėstas ŽIV arba jis yra "lango laikotarpiu". Pastarasis reiškia, kad virusas gali patekti į kūną, bet dar nebūtų tobulinamas. Siekiant pagerinti diagnostinį tikslumą, naudojamos bandymo sistemos:

Recombinat ŽIV;
Antigeną;
Peptozinas.

Po jų patikrinimo rezultatas skaičiuojamas neigiamam, jei mėginiai nerado GP120, GP160, SP4 baltymų.

Yra dar vienas aiškinimo variantas - neutralus arba abejotinas rezultatas. Jis susitinka su tais, kurie prisiėmė seksualinį kontaktą su ŽIV užsikrėtusiais partneriais. Savo kraujyje yra antikūnai yra rasti baltymų gp120 ir gp160. Be to, abejotinas atsakymas į blotavimą skiriamas tada, kai infekcija vyksta besimptoniškai, tai yra miega.

Abejotinas rezultatas yra svarbus išsamiai patikrinti. Norėdami tai padaryti, naudokite kraujo serumo bandymą dinamikoje, ty reguliariai bandymus imunoblotting ir IFA metodų šešis mėnesius. Taip pat skiriami papildomi tyrimai, nes buvimas autoantiboders ir imuninių kompleksų kraujyje gali būti:

užkrečiamos ligos;
vėžinių navikų buvimas;
alergijos.

Imuninis blotavimas (ImmunoBlot, Western Blot, Western Blot) - sujungia imuninio-fermentų analizę (ELISA) su preliminariu elektroforetiniu perdavimu į virusų antigenų nitroceliuliozės juostos juostelę (juostelę).

Šiame gražiame mokslininko pavadinimą "blot" verčia greičiausiai kaip "blotai", ir "Vakarų" - kaip "Vakarų" atspindi šio "blotų" plitimo ant popieriaus iš kairės į dešinę kryptimi, tai yra, geografiniame žemėlapyje , tai atitinka Vakarų į rytus kryptį. " "Imuninės dėmelių" metodo esmė yra ta, kad imuninė imuniminė reakcija atliekama ne su antigenų mišiniu, bet su ŽIV antigenais, iš anksto paskirstyta imunoforezė naudojant frakcijas, esančias pagal molekulinį svorį virš nitroceliuliozės paviršiaus membrana. Kaip rezultatas, pagrindiniai ŽIV baltymai, antigeninių veiksnių vežėjai pasiskirsto ant paviršiaus atskirų juostų pavidalu, kuris pasireiškia atliekant imunoferacijos reakciją.

ImmunoBlot apima keletą etapų:

Strip paruošimas. Iš anksto išgrynintas ir sunaikintas į sudėtinius komponentus, imunodeficitas (ŽIV) yra veikiamos elektroforezės, o ŽIV priskirti antigenai yra atskirti molekuliniu mastu. Tada užblokuojant (ekstruzijos analogas ant "šlapio" rašalo) perduodama į nitroceliuliozės juostelę, kuri nuo dabar yra nematoma spektro antigeninių grupių, būdingų ŽIV.

Mėginio tyrimas. Bandomosios medžiagos (serumo, pacientų kraujo plazmos ir kt) yra taikomas nitroceliuliozinės juostos), ir jei mėginyje yra specifinių antikūnų, jie yra susiję su griežtai atitinkančiais joms (nemokamas) antigenines juosteles. Dėl vėlesnių manipuliacijų šios sąveikos rezultatas yra vizualizuotas - tai daroma matoma.

Rezultato aiškinimas. Gangsų buvimas tam tikrose nitrocellulozinės plokštės srityse patvirtina buvimą antikūnų serumuose, kad būtų griežtai apibrėžti ŽIV antigenai.

Strip a - teigiama kontrolė

Strip in - silpnai lovos kontrolė

Strip C - Neigiama kontrolė

"Strip D" yra teigiamas pavyzdys (aptiktas antikūnų buvimas į ŽIV-1)

Šiuo metu imuninis blotavimas (imunoBlot) yra pagrindinis metodas patvirtinti virusų specifinių antikūnų buvimą bandymo serume. Kai kuriais atvejais ŽIV infekcija prieš serokonversiją kūrimą, specifiniai antikūnai yra efektyviau aptikti imuninės dėmės metodas nei ELISA. Tyrime dėl imuninės dėmės metodo buvo nustatyta, kad antikūnai į GP 41 yra aptinkami serumuose serumuose, o P24 aptikimas apklaustų su profilaktiniu tikslu reikalauja papildomų tyrimų dėl jų ŽIV infekcijos. Imuninės blotavimo bandymo sistema, pagrįsta genų inžinerijos gautais rekombinantiniais baltymais pasirodė esantys konkretesni nei įprastinės sistemos, pagrįstos išgrynintu virusiniu lizutu. Naudojant rekombinantinį antigeną, o ne difuzinis, bet aiškiai ryškus siauras antigenų juosta, lengvai prieinama apskaitos ir vertinimo.

ŽIV-1 užsikrėtusių asmenų serumai nustatomi pagal šiuos pagrindinius baltymus ir glikoproteinus - struktūrinius korpuso baltymus (ENV) - GP160, GP120, GP41; Branduoliai (Gag) - P17, P24, P55, taip pat virusų fermentai (POL) - P31, P51, P66. ŽIV-2 tipiški antikūnai į Env - GP140, GP105, GP36; Gag - P16, P25, P56; POL - P68.

Tarp laboratorinių metodų, reikalingų reakcijos specifiškumui nustatyti, didžiausias pripažinimas turi antikūnų aptikimą su ŽIV-1-GP41 baltymo baltymų, GP120, GP160 ir ŽIV-2 - GP36, GP105, GP140.

Kas laiko teigiamus serumus, kuriuose antikūnai į bet kurį du ŽIV glikoproteinus yra imuninės blotavimo metodas. Remiantis šiomis rekomendacijomis, atsižvelgiant į reakciją tik su vienu iš apvalkalo baltymų (GP 160, GP 120, GP 41), kartu arba be reakcijos su kitais baltymais, rezultatas yra abejotinas ir rekomenduojamas pakartotinis tyrimas kitos serijos ar kitos įmonės rinkinys. Jei, po to, rezultatas yra abejotinas, stebėjimas rekomenduojamas 6 mėnesius (studijas po 3 mėnesių).

Iš teigiamos reakcijos su P24 antigenu buvimas gali nurodyti serokauro laikotarpiui, nes antikūnai kartais atrodo šio baltymo. Tokiu atveju rekomenduojama, priklausomai nuo klinikinių ir epidemiologinių duomenų, pakartokite tyrimą su serumo mėginiu, paimta bent per 2 savaites, ir taip yra, kai su ŽIV infekcija būtina studijuoti porų serumus.

Teigiamos reakcijos su GAG ir POL baltymais be reakcijos su EVV baltymais gali atspindėti ankstyvo serokonversijos etapą ir taip pat gali nurodyti ŽIV-2 infekciją arba nespecifinį atsaką. Asmenys su tokiais rezultatais po bandymų ŽIV-2 yra iš naujo nagrinėjami po 3 mėnesių (per 6 mėnesius).

ImmunoBlot apima keletą etapų:

Rezultato aiškinimas. Gangsų buvimas tam tikrose nitrocellulozinės plokštės srityse patvirtina buvimą antikūnų serumuose, kad būtų griežtai apibrėžti ŽIV antigenai.

Strip a - teigiama kontrolė

Strip in - silpnai lovos kontrolė

Strip C - Neigiama kontrolė

"Strip D" yra teigiamas pavyzdys (aptiktas antikūnų buvimas į ŽIV-1)

Imunoblotting -(Iš anglų kalbos. "Blot" yra dėmė) - antigenų (arba antikūnų) nustatymo metodą su žinomais serumais (arba antigenais). Tai yra gelio elektroforezės derinys iš ELISA. Iš pradžių bakterijų ląstelės arba virionai sunaikinami ultragarsu, o elektroforezės metodas yra atskirti visus virusų ar bakterijų ląstelių antigenus ir gauti komercinį reagentą specialioje nitroceliuliozės plėvelėje. Vykdydami imunoblotavimą ant filmo su žinomais antigenais, taikoma tiriamas paciento serumas. Po inkubacijos ir nesusijusių antikūnų, jis pradedamas į Elisa - antiserumas taikomas imunoglobulino asmens, pažymėtas fermento, ir chromogeninio substrato, keičiant tapybą sąveikaujant su fermentu. Esant kompleksams antigeno antikūnų ir anti-svelope į imunoglobulino fermentą ant vežėjo, dažytos dėmės pasirodo. Imunoblotting metodas leidžia atskirai aptikti antikūnus įvairiems patogenų antigenams (pvz., ŽIV infekcija, imunoblotavimas atskleidžia antikūnus į GP120, GP24 ir kitus virusų antigenus).

Radioimuninė analizė (RIA)

Šis metodas yra pagrįstas antigeno antikūnų reakcija, naudojant antigeno žymėjimą arba antikūnų radionuklidą. Kaip etiketė naudoja 125i, 14C, 3H, 51cr ir kitus radionuklidus. Gauti imuniniai kompleksai yra izoliuoti nuo sistemos ir nustatyti jų radioaktyvumą ant skaitiklių (β-spinduliuotės). Radiacinės intensyvumas yra tiesiogiai proporcingas prijungto antigeno ir antikūnų molekulių skaičiui.

Kieta fazinė RIA versija naudojant paženklintus antikūnus ar antigenus, sorbed į polistireno plokštes, yra plačiai paplitusi.

RIA naudojamas norint nustatyti mikrobus, virusus, įvairius hormonus, fermentus, vaistines medžiagas, imunoglobulinus, taip pat kitas medžiagas, esančias medžiagoje mažose koncentracijose 10-12-10-15 g / l.

Kontroliuoti klausimus

Imuninės bakterilizavimo reakcija: kas yra ši reakcija; Kas yra antigenas, kad - antikūnai, reakcijos mechanizmas, formavimo metodai, praktinis taikymas. Imuninės hemolizės reakcija: būtini ingredientai, formavimo metodai; Kontrolė, praktinis taikymas. Vietinio hemolizės reakcija gelio (JERNE reakcija): reakcijos principas, formavimo metodai, praktinis taikymas. Papildykite privalomą reakciją: reakcijos principas; kuri yra suformuota imuninės serumų sąveika su konkrečiu antigenu; Kas atsitinka su papildymu, jei jis yra tuo pačiu metu? Koks yra papildomo likimo atveju, jei nėra specialaus afiniteto tarp antigeno ir antikūnų? Naudodamiesi reakcija gali būti nustatyta, kas nutiko su papildymu; Kodėl ši reakcija naudojama; Koks yra matomas teigiamas RSK rezultatas? Kodėl? Koks yra papildomas turtas pirmajame RSK etape? Antrajame etape? Jei Ultimate RSK yra hemolizė, ką tai reiškia - teigiamas ar neigiamas rezultatas? Paaiškinkite rezultatus: RSK + + + +, RSK + + +, RSK + +, RSK +. Pavadinkite pirmojo RSK sistemos ingredientus ir antrosios RSK sistemos ingredientus. Kodėl bandymo serumas turėtų būti inaktyvuotas? Kaip titruoti papildymą? Hemolizinis serumas: Ką jame yra, kaip jie gauna, kas yra titras ir kaip jį nustatyti? Kokie gyvūnai naudojami RSK komponentams gauti? RSK metodika šalta. Nustatant, iš kurių iš išvardytų reakcijų yra būtina dalyvauti papildyme: nuosėdos, flokuliacija, agliutinacija, aptikti neišsamių antikūnų, imuninės bakterilizacijos, imuninės hemolizės, Yerne, RSK? Imunofluorescencijos reakcija (rifas) - nurodykite įvykių seką su tiesiogine kuns reakcija; Reikalingi ingredientai. Kas yra antigenas, kad - antikūnai nei pažymėti antikūnai, kaip reakcijos rezultatas yra atsižvelgiama, ką daro teigiamas rezultatas? Praktinis taikymas - ką galima nustatyti šioje reakcijoje? Netiesioginė imunofluorescencijos reakcija - nurodykite įvykių seką su šia reakcija, būtinais ingredientais, kurie yra antigenai, kurie taikomi imuniniai serumai; praktinis naudojimas; Netiesioginio rifo pranašumas, palyginti su tiesiogine reakcija. Imunoenimen analizė (IFA) - reakcijos principas; būtini ingredientai; Nurodykite įvykių seką, kai reakcijos formuluotė, siekiant aptikti antigeną medžiagoje pagal tyrimą; būtini ingredientai; Kas atsitinka su teigiamu rezultatu, ką jis atrodo? Nurodykite veiksmų seką atliekant ELISA, kad nustatytumėte bandomojo serumo antikūnus; būtini ingredientai; Kas atsitinka su teigiamu rezultatu? Imunoblotting yra reakcijos principas; pagrindiniai žingsniai; būtini ingredientai; Atsižvelgiama į rezultatus; Reakcijos privalumai. Radioimuninė analizė (RIA) - iš kurių pagrindiniai etapai reakcija yra reakcija; Kas yra pažymėtas antikūnais ar antigenais, kaip atsižvelgiama į rezultatus? Imunoelektroninis mikroskopinis metodo principas; pagrindiniai žingsniai; būtini ingredientai; nei pažymėti antikūnai; Atsižvelgiant į reakcijos rezultatus. Imobilizavimo reakcijos - metodo, techniko kūrinių, komponentų, apskaitos rezultatų principas.

Užduotys atlikti savęs paruošimo procesą.

Užpildykite "imuniteto reakcijos" lentelę, susijusią su reakcijomis, kurios yra išardytos pagal šią temą.

Imuniteto reakcijos

Studentai dirba praktinėje pamokoje

Darbas Pradėkite iš karto nuo 1 fazės RSK nustatymo, bet vėliau įrašykite nešiojamąjį kompiuterį (žr. Toliau).

1. Imuninės hemolizės reakcija. Peržiūrėkite imuninės hemolizės demonstravimo reakciją, schemos eskizą, paaiškinkite patyrusių ir kontrolinių vamzdžių rezultatus.

2. Papildykite privalomą atsakymą

a) išardykite RSK ant stalo;

b) piešti nešiojamąjį kompiuterį schemos nustatymas RSK lentelės forma;

c) įdėti antrąjį RSK etapą (pirmoji fazė pateikiama klasės pradžioje);

d) RSK reikalingos diagnostikos preparatai;

e) Atsižvelgia į rezultatus. Suformuluokite išvadą apie konkrečių antikūnų buvimą bandymo serume.

3. Imunofluorescencijos reakcija. Naršykite lentelę, atlikite nešiojamojo kompiuterio reakcijos formuluotę; Pažvelkite į diagnostikos serumą; Nustatyti - kuriame yra serumo, kaip virti, už kokią reakciją (tiesioginį ar netiesioginį rifą) jis taikomas. Žiūrėkite demonstravimo rezultatus rifo luminescencinėje mikroskopoje.

4. Immuno fermentų analizė (ELISA). Be nešiojamojo kompiuterio, reakcijos formulavimo diagrama dviem versijose: aptikti antigeną medžiagoje pagal tyrimą ir aptikti serumo antikūnų. Patikrinkite ingredientų rinkinį diagnozuoti ŽIV infekcijos ir hepatito V. Nustatykite, kad jame yra kiekviena sudedamoji dalis ir kuriai jis taikomas.

5. Imunoblotting. Padarykite reakcijos schemą nešiojamojoje knygoje; Pažvelkite į demonstraciją - reakcijos rezultatus.

6. Radioimuninė analizė (RIA). Padarykite reakcijos schemą nešiojamojoje knygoje.

7. Imuninės elektronų mikroskopija (IEM). Pažvelkite į demonstraciją - reakcijos rezultatas, atlikite reakcijos schemą nešiojamojoje knygoje, nurodykite rankas antigeną (virusą) ir paženklinti antikūnus.

Imunoblotting yra labai jautrus baltymų aptikimo metodas, pagrįstas elektroforezės ir ELISA arba RIA deriniu. Imunoblotavimas naudojamas kaip diagnostinis ŽIV infekcijos metodas ir kt.

Paprastai imunoblotavimas supranta baltymų mišinio, perkeltų į kietą substrato membraną, su kuriuo jie yra susiję su kovalentinėmis obligacijomis, po to - imunodekcija.

Galite analizuoti baltymų, tiesiogiai pritaikytų prie substrato - DOT-blot analizės, mišinio - arba po jo preliminarios frakcionavimo metodais elektroforezės arba dviejų dimensijų elektroforezės metodais - Vakarų blot analizė (Vakarų blotavimas).

Patogeno antigenai yra atskirti elektroforezės poliakrilamido gelio, tada perkelti juos nuo gelio į aktyvuotą popieriaus ar nitroceliuliozės membraną ir pasireiškia patys naudojant ELISA.

Įmonės gamina tokias juosteles su "blotais" antigenų. Šias juosteles taikomas serumas. . Tada po inkubacijos jie plaunami nuo nereaguojamų pacientų ir serumo prieš žmogaus imunoglobulinų antikūnus, pažymėtas fermentu . Kompleksas (antigenas + antikūnas + antikūnas + antikūnų antigenas + antigenas + antikūnas) aptinkamas, pridedant chromogeninio substrato keičiant spalvą pagal fermento veikimą.

Tokia metodika taip pat naudojama bakterijoms pasirinkti, fagai arba virusai, išreiškiantys tikslinius klonuotus genų produktus.

Proteinų perdavimas vienai membranai atliekami pasyviai arba naudojant elektros energijos įrangą. Baltymų perdavimo į membraną efektyvumą įtakoja daug veiksnių, tokių kaip baltymų molekulinė masė, gelio poringumas, naudojamo buferio tirpalo perdavimo laikas ir sudėtis (transfer).

Priklausomai nuo eksperimento užduočių ir sąlygų, perdavimo sąlygos pasirinktos geriausių rezultatų. NITROCELLULOSIC, POLYLIDENDENDYLUORIDE (PVDF) arba teigiamai įkrautos nailono membranos paprastai naudojamos kaip substratai. Nitroceliuliozė gali susieti su 80 - 100 μg baltymų už 1 cm2.

Mažos molekulinės masės baltymai (kurių molekulinė masė yra mažesnė nei 20 kDa), gali būti prarasta dėl gebėjimo iš anksto ištirti tam tikrų genetinių lokų polimorfizmą dėl atitinkamo DNR apribojimo fragmentų ilgio.

Be to, naudojant hibridizaciją pagal Sarew, tai lengva išsiaiškinti, ar tikslinė genas turi hidrolizės tam tikrą apribojimą savo vidinėje dalyje, kuri leidžia jums pasirinkti optimalią strategiją klonuoti studijavo genomo plotą.

Panašia schema Agarozės gelio ant nitroceliuliozinio filtro, RNR molekulės gali būti perduotos. Šis metodas buvo pavadintas šiauriniu blotais (šiauriniu blotavimu), o ne pietiniame dėmėjime, nes pietinėje pietinėje kalbų pavardė reiškia "pietus".

Perkėlimas į baltymų gelio filtrus buvo atitinkamai vadinami Vakarų blotais (Vakarų blotavimas). Dideli baltymai (daugiau nei 100 kDa), denatūruotas natrio dodecilo sulfato tirpale (SDS), gali būti silpnai perduodami į membraną, jei etanolio yra tarpvalstybinio buferio. Alkoholio žymiai pagerina baltymų perdavimą su SDS poliakrilamido geliu, bet susiaurėja poras gelyje, kuris lemia didelių baltymų vėlavimą.

PVDF membrana yra optimizuota imunodekcijai ir gali išlaikyti specialiai susijusius baltymus iki 160 μg / cm2 labai žemu nespecifinio privalomo lygio.

Imunoblotting

Svarbi šios membranos nuosavybė yra galimybė pakartotinai naudoti. Zeta-zonde nylon membranai efektyviai susieja SDS baltymus, nesant alkoholio, ir šis privalomas yra atsparus tolesniems gydymams. Mažai molekulinės masės baltymai taip pat aptinkami efektyviai. Dėl didelio privalomojo talpos - apie 480 μg baltymų 1 cm2 - zeta-zonde membranos leidžia aptikti pėdsakų baltymų analizuojamuose mišiniuose.

Po to, kai antigenas pasirodo, kad būtų imobilizuotas ant membranos, likusieji privalomi centrai blokuoja želatinos tirpalus arba galvijų serumo albuminą arba nugriebtą pieną.

Tada membrana inkubuojama polikloninių arba monokloninių antikūnų tirpalu iki tyrimo anti-geno. Po skalbimo nuo nesusietos antikūnų, membrana inkubuojama antrinių antikūnų tirpalo, kuris yra šarminis fosfatazės fermento konjugatas (šarminis fosfatazės, ar) arba krienų peroksidazės (krienų peroksidazės, HRP) su anti-pažinčių antikūnais (ožkų antikūnai iki imunoglobulino triušio, pelės ar žmonių) arba baltymų (Staphylococcus aureus baltymų) arba g (baltymų streptococcus sp.), turintys didelį afinitetą imunoglobulinų fc regionui.

Išmokomų imuninių kompleksų aptikimas atliekamas su cheminiu arba chemiluminescenciniu būdu. Cheminės reakcijos substratai naudojant šarminės fosfatazės konjugates yra 5-bromo-4-chloro-3-indolilfosfatas (BCIP) arba tetrazolio mėlyna (NBT), o kai naudoja KRENA peroksidazės konjugates - 4-chloro-1-naftolio ir vandenilio peroksido.

Dėl fermentinių reakcijų į membraną rezultatas, dažytos juostos arba vietoje yra suformuota lokalizavimo vietoje antigeno antikūnų komplekso.

Naudojant HRP konjugates, šio metodo jautrumas yra 100 šiltnamio efektą sukeliančių dujų baltymų. Chemiluminescencinis imuninės kompleksų aptikimas leidžia nustatyti mažiau nei 5 pg antigeną. Šio metodo principas yra tai, kad su HRP reakcija su vandenilio peroksidu ir cikliniu diacilhidraziniluminoliu, iš šviesos bangos ilgio iš 428 NM įvyksta, kuris gali būti pritvirtintas ant šviesos jautrios plėvelės.

Imunoblotavimo reakcija (RI) yra sukurta remiantis ELISA pagrindu. Tai yra labiausiai specifinis ir jautrus imunocheminės analizės metodas. Imunoblotting (nuo anglų dėmė - švyti, dėmių) sujungia IFA su elektroforeze. Jis naudojamas nesudėtingiems antikūnams ŽIV ir antikūnų iki atskirų konstrukcinių baltymų (baltymai-P24, glikoproteino-gr120, gr 41 ir kt.). Žr. ŽIV infekcijos diagnozavimo ekspertų (pagalbines) reakcijas.

Reakcija atliekama keliais etapais:

Virusas sunaikinamas komponentais - antigenai (P24, G120, GR41 ir kt.), Kuris yra poliakrilamido gelio elektroforezė, ty antigenų atskyrimas ant molekulinių svorio frakcijų.

2. Gelis yra padengtas nitroceliuliozės membrana ir antigenų frakcijos perduodamos į jį naudojant elektroforezę. Nitroceliuliozė elgiasi kaip laistymo popierius. Membrana supjaustoma ant juostelių (juostelės). Įmonės gamina tokias juosteles su "blotais" antigenų.

Imunoblotting - papildomas netiesioginis metodas

Skirkite su ŽIV antigenais, kurie diegiami ant jo išnagrinėjo serume ir nuplaunama nuo nešališkos medžiagos.

4. Nukrypimai yra inkubuojami su antihylobulinu serumu, pažymėta peroksidazė, plaunama.

Pažymėta, kad substratas ir dažytų frakcijų skaičius (dėmės), atitinkančios AG-komplekso lokalizavimo zoną, skaičius.

Grupės buvimas tam tikrose juostos dalyse patvirtina antikūnų buvimą tiriame serume, kad būtų griežtai apibrėžti ŽIV antigenai. Imunoblotavimo rezultatas yra teigiamas, jei membrana rodo grupes, atitinkančias bet kurį iš trijų ŽIV antigenų - P24, GP41 ir GP 120 (37 pav.).

Nuotraukos. \\ T

Naudotų literatūros sąrašas

Pagrindinė literatūra

Medicinos mikrobiologija, virologija ir imunologija: vadovėlis studentams medaus. Universitetai 2-oji, universitetas. ir pridėti. - 702 p. Ed. A.A. Žvirblis. M.: Mia, 2012.

2. Mikrobiologija, Virologija ir imunologija: laboratorinių klasių vadovas: studijos. Aukos / (V.B.Subacov ir kt.); Ed. VB Subachakova, M.M. Karapatsa. - m.: Gootar Media, 2014.- 320С.: IL.

3. Medicinos mikrobiologija, imunologija ir virologija [elektroniniai ištekliai]: pamoka medaus.

universitetai - 760 p. - prieigos režimas: http://www.studmedlib.ru/book/isbn9785299004250.html Kijiyev A.I., Babichev S.A. Sankt Peterburgas: Speclit, 2010.

4. Medicininė mikrobiologija, Virologija ir imunologija [Elektroniniai ištekliai]: Tutorial: 2 t. / T. 1. - 448 p. - prieigos režimas: http://www.studmedlib.ru/book/isbn97859704142241.html Zverev V.V., Boychenko M.n.

M.: Gootar Media, 2010.

5. Medicininė mikrobiologija, Virologija ir imunologija [Elektroniniai ištekliai]: Tutorial: 2 tonos. T. 2. - 480 p. Prieigos režimas: http://www.studmedlib.ru/book/isbn97859704142242.html Zverev V.V., Boychenko M.n. M.: Gootar Media, 2010.

Papildoma literatūra

1. Imunodiagnostinės reakcijos: pamoka / kaina: G. K. Davletshina, Z.G. Gagabidullin, A. Aahtativa, M.M.Tuigunov, A.K. Bulgakovas, T.A. Savchenko, R.F.

Husnarizanova, Yu.z Gabidullin, M.M. Elsynbaev - UFA: GBOU VPO BGMU Leidykla Rusijos Sveikatos apsaugos ministerijos, 2016. - 86c.

2. kai kurių savybių, kurios lemia patogeninį potencialą enterobacter, Citrobacter, Serratia, E. coli, Proteus, Serratia, E. coli, Proteus: Mokslinis leidimas / Yu. Z. Gabidullin, Rs Sufiyarov, II dolguustizė, \\ t 2015. - 250 s.

Pagrindinis »ImmunoBlot - Kas tai yra? ImmunoBlot į infekcinių ligų diagnozę

ImmunoBlot - kas tai? ImmunoBlot į infekcinių ligų diagnozę

Kas yra imunoblot? Tai yra bendras žmogaus virusinių infekcijų laboratorinės diagnostikos metodas. Tai vienas iš tiksliausių ir patikimų būdų, kaip aptikti ŽIV.

Dėl patikimumo, tai yra dar daugiau nei fermento prijungtas tyrimas imunosorbentas (ELISA). Imunoblot rezultatai laikomi nepagrįstu ir galutiniu.

ImmunoBlot - kas tai? Siekiant atpažinti asmenį ŽIV, turite išlaikyti laboratorinio bandymo metodą kraujo serumo antikūnų.

Vakarų dėmių metodo skyriai taip pat vadinami "Western Blot" (Vakarų dėmė). Jis naudojamas nustatyti žmogaus virusines infekcijas kaip papildomą ekspertų metodą. Tai būtina patvirtinti ELISA - laboratorijos tyrimą, kuris leidžia nustatyti antikūnų buvimą ŽIV kraujyje. Imunoblot atsisako teigiamų ELISA.

Jis laikomas jautriausiu, sudėtingiausiu ir brangiu.

Tikslas. \\ T

Kas yra imunoblot? Šis laboratorinių bandymų serumo bandymų metodas antikūnų buvimui virusui.

Specialiųjų tyrimų metu bendra virusų baltymai gelio ir nitroceliuliozės membranose.

Imunoblotavimas (antikūnų nustatymas serume serume į tam tikrus patogenų antigenus)

Sukurta procedūra Vakarų-blot skyriai nustatyti ŽIV infekcijos skirtinguose etapuose. Pirmajame etape išgrynintas virusas iš komponentų dalių patiria elektroforezės ir antigenų, įtrauktų į jį padalinta į molekulinę masę.

Žmogaus imunodeficito virusų veislės gyvose ląstelėse, įgyvendinamose genetinėje informacijoje. Šiame etape asmuo tampa ŽIV viruso vežėju, jei buvo užsikrėtę.

Šios ligos ypatumai slypi tuo, kad jis nereiškia ilgai. Virusas sunaikina limfocitus, todėl žmogus mažina imunitetą ir kūnas negali susidoroti su infekcijomis.

Jei ŽIV yra teisingas ir laiku apdorotas, pacientas gyvens iki gilaus amžiaus. Gydymo trūkumas neišvengiamai sukelia mirtį. Nuo infekcijos, bet be gydymo, maksimalus laikotarpis ne ilgiau kaip dešimt metų.

funkcijos

ImmunoBlot analizė yra patikimas metodas, leidžiantis nustatyti antikūnų buvimą ŽIV antigenams pirmojo ir antrojo tipo.

Jei asmuo yra užkrėstas, po dviejų savaičių antikūnų, kuriuos galima žymiai atrasti vėliau. ŽIV bruožas yra tai, kad antikūnų kiekis sparčiai didėja ir lieka paciento kraujyje. Net jei jie yra, liga negali pasireikšti dviem ar daugiau metų. ELISA metodas ne visada tiksliai nurodoma liga, kuriai reikia patvirtinti PCR ir Vakarų Blot sekcijų rezultatus, jei imuno smegenų analizė parodė teigiamą rezultatą.

Indikacijos K.

Kokio "imunoblot" jau sužinojote, bet kurie yra įtraukti į tyrimą?

Žmogaus imunodeficito viruso (ŽIV) imunobloto patikrinimo priežastis taps teigiamu ELISA rezultatais. Būtina eiti per kietojo fazės imunologinę analizę pacientams, kurie turi turėti operaciją. Be to, turite atlikti moterų nėštumo analizę, taip pat tuos, kurie kelia nepatogią gyvenimą. Vakarų dėmių skyriai skiriami pacientams, sergantiems ŽIV infekcija, jei ELISA rezultatai yra abejotini.

Toliau nerimą keliantys simptomai gali būti priežastis gauti gydytoją: greitas svorio netekimas; silpnumas, funkcijų praradimas; žarnyno sutrikimai (viduriavimas), kuris trunka tris savaites; dehidratacija; karščiavimas; karščiavimas; kandidozės kūrimas , tuberkuliozė, pneumonija, toksoplazmozė, herpes paūmėjimas.

Prieš perduodant veninį kraują reikia paruošti pacientui.

8-10 valandų prieš bandymą nevalgykite. Nerekomenduojama per dieną prieš geriamojo alkoholio ir kavos gėrimų kraują, sunkų pratimus, atsižvelgiant jaudulį.

Kur atlikti analizę?

Kur galiu praeiti ŽIV testavimą?

"Elisa", "ImunoBlot" analizė, atlikta miesto privačiose klinikose, rezultatai pateikiami per dieną. Galima skubiai diagnostika. Viešose institucijose, ELISA medicinos tyrimai ir Vakarų dėmių skyrius nemokamai, laikantis Rusijos Federacijos teisės aktų.

Privalomas patikrinimas dėl infekcinių ligų nėščioms moterims ir pacientams, kuriems reikia hospitalizavimo ar chirurgijos. Kaip vyksta šis tyrimas?

Kaip laikyti ELISA? ImmunoBlot teigiamas / neigiamas patvirtina arba paneigia ELISA rezultatus. Procedūra yra gana paprasta. Specialistas užima venų kraujo tvorą, užtrunka mažiau nei penkias minutes.

Po mėginių ėmimo injekcijos vieta turi būti dezinfekuojama ir įstrigo su tinku. Tvora yra atliekama tuščiame skrandyje, todėl po procedūros jis nebus pakenkęs valgyti kartaus šokolado plytelės ar saldaus karšto gėrimo.

Norėdami gauti nuorodą į nemokamą analizę valstybinėje medicinos įstaigoje, jums reikia aplankyti terapeutą.

Apskritai imunoblot nesiskiria nuo kitų kraujo tyrimų tvora. Studijų metodika yra paprasta. Jei virusas yra asmens kraujyje, jo sunaikinimo organizmas pradeda gaminti antikūnus. Kiekvienam virusui yra daug baltymų antigenų. Šių antikūnų aptikimas yra Vakarų dėmių sekcijų pagrindas. Kaina

Kiek analizė? "ImunoBlot ŽIV" nurodo pigius tyrimus.

Vidutiniškai imunosay atrankos metodai yra nuo 500 iki 900 rublių. Vakarų rinkinių blotai yra ištirti patikrinimą, kurių kaina svyruoja nuo trijų iki penkių tūkstančių rublių. Sudėtingesni metodai yra daug brangesni. Pvz., Norėdami išanalizuoti polimerazės grandinės reakciją (PCR), reikės mokėti apie 12 000 rublių.

REZULTATŲ VERTINIMAS. \\ T

Dažniausi ŽIV infekcijos diagnostikos metodai yra imuno smegeniminė analizė ir imunoblot.

Jie skirti žmogaus imunodeficito viruso antikūnų nustatymui. Infekciją paprastai patvirtina du bandymai: atranka ir patvirtinimas. Rezultatų aiškinimą turėtų atlikti gydytojas, jis diagnozuoja ir nustato gydymą. Jei imunoblotas yra teigiamas, tai reiškia, kad žmogaus organizme virusas.

Teigiamas rezultatas neturėtų būti savarankiškumo priežastis, nes kiekvienas pacientas gali turėti savo ligų ligą.

Kokybinė analizė apima atranką ir sertifikavimą. Jei pacientas nenustato viruso, rezultatas rodo "neigiamai". Nustačius šį sertifikatą, atranka atliekama papildomų tyrimų. ImunoBlot analizė, patvirtinanti arba paneigia atranką. Jei bandymo juostelės rodomos tam tikrų sričių (baltymų lokalizacija), diagnozuojama ŽIV diagnozė.

Jei rezultatai yra abejotini, bandymai atliekami per tris mėnesius.

Siekiant užkirsti kelią žmogaus imunodeficito viruso infekcijai, galima laikytis tam tikrų taisyklių: išvengti atsitiktinių lytinių santykių kontaktų, susisiekdami su prezervatyais, nenaudokite narkotikų.

Jei liga yra aptikta nėščiojoje moteriai, svarbu laikytis gydytojo rekomendacijų, nepamirškite apie viruso buvimo bandymus.

Kas yra Vakarų blotavimas?

Širdies mišinių baltymų ar įvairių audinių ekstraktų identifikavimas yra viena iš labiausiai paplitusių užduočių. Naudojant tokį įrankį kaip specifinius antikūnus, galite nustatyti studijuotą baltymą su minimaliomis laikinomis ir finansinėmis išlaidomis.

Vakarų blotavimo metodas (Vakarų blotavimas) pirmame etape baltymų mišinys yra atskirtas elektroforeze, esant natrio dodecilo sulfato (DSN), tada perkeliamas į nitroceliuliozės membraną elektroblotavimo metodu.

Šio metodo esmė yra ta, kad gelis po elektroforezės dedamas ant nitroceliuliozės membranos tarp filtravimo popieriaus sluoksnių. Tokiu būdu surinkta "sumuštinis" yra dedamas į elektrinį lauką, kad baltymų-DSN kompleksai juda per plokštelę ir yra imobilizuojamos (kaip nespecifinės sorbcijos) ant nitroceliuliozės membranos paviršiaus.

Į baltymų-DSN kompleksą su nitroceliuliozės membrana, jie dalyvauja pagrindinėje jėgoje elektros pobūdžio, ir ši sąveika yra multipoint ir veda į "liejimo" baltymų ant membranos paviršiaus. Taigi, po elektros barelio, mes gauname gelio kopiją ant nitroceliuliozės su baltymais, esančiais taip pat, kaip ir poliakrilamido gel.

Atlikę DSN - elektroforezės, elektros takas ir baltymų sorbcija nuo gelio ant nitroceliuliozės membranos, baltymo tretinis konformacija yra stipriai pakeista, jei paprastai teisingai kalbama apie tretinę struktūrą baltymui po tokio standaus apdorojimo. Todėl, siekiant imunocheminio aptikimo baltymų pagal tyrimo, tik mono- arba polikloninių antikūnų, specifiškumo baltymų molekulės, paprastai naudojami.

51. Imuninimalios analizės, imunoblotavimas. Kailiniai, komponentai, naudojimas.

Antikūnai, būdingi konformaciniams epitopams (arba zonoms, įskaitant insersubuojančias kontaktus), paprastai nėra tinkami naudoti Vakarų blot metode.

Po baltymų perkėlimo, membrana yra inkubuojama nuosekliai su antikūnais, būdingi tiriamam baltymui, ir tada su antriniais antikūnais, būdingais FC fragmentais pirminių antikūnų konjuguoti su fermento (ar kitos) etiketės (Fig.

1 a). Jei etiketė yra konjuguota tiesiogiai pirminė, specifinis antikūnų antigenas, antriniai antikūnai nebūtini (1 pav. B). Imuniniai kompleksai "pasireiškia patys", suformuoti į mokytojo baltymo lokalizavimą naudojant chromogeninį pagrindą (priklausomai nuo žymos tipo).

Tyrimo metu jautrumas ir specifiškumas yra labai priklausomi nuo to, kurie antikūnai yra naudojami tyrimų metu.

Naudojami antikūnai turėtų būti būdingi unikaliam, charakteristikai tiriamam baltymui aminorūgščių sekos. Priešingu atveju sąveika (ypač šiurkščiavilnių baltymų ekstraktų) antikūnų su keliais baltymingais molekuliais yra įmanoma, o tai savo ruožtu sukels kelių spalvų juostų išvaizdą ant membranos.

Šiuo atveju tyrimo baltymų identifikavimas dažnai yra sudėtingas ar neįmanomas.

Antras svarbus veiksnys, kuris turėtų būti prisimintas renkantis antikūnus yra afinitetas. Kuo didesnis antikūnų prijungimas, ryškesnis ir aiškiau baltymų juostelės yra vertinamos, tuo didesnis metodo jautrumas. Naudojant "Dishaphief" antikūnus, galima pasiekti 1 ng jautrumą ir dar didesnį.

Vizualizuoti antigeno ir antikūnų membranos sąveikos rezultatus, naudojami antriniai antikūnai, konjuguoti su agentais, galinčiais suteikti tam tikrą signalą tam tikromis sąlygomis.

Paprastai fermentas (peroksidazė arba fosfatazė) naudojama kaip toks agentas, reakcijos produktas dažomas ir patenka į membraną kaip netirpias nuosėdas.

Taip pat šiame metode galima naudoti fluorescencines žymes.

Fig. 1. Studijų imunocheminio dažymo schema pagal tyrimą: A - naudojant antrinius antikūnus konjuguotus su fermento etikete; B - Pirminis antikūnas, tiesiogiai konjuguotas su fermento etikete.

Protokolas:

I. Gelio ir membranos ir baltymų elektrinių paruošimas

Poliakrilamido gelis po elektroforezės dedamas į buferinę vonią (25 mm tris, pH 8,3, 192 mm glicinas, 10% etanolis).

Du filtro popieriaus lakštai, supjaustyti ant kasetės, skirtos blauzdinimui ir sudrėkinimui su "Spuffer" užuolaidomis, yra ant šios kasetės dalies, kuri bus sprendžiama antodo. Tada nitroceliuliozinė membrana dedama ant filtro popieriaus, kuris seka oro burbuliukus tarp membranos ir popieriaus.

Po to gelis turi būti kruopščiai dedamas ant membranos, ypatingą dėmesį skiriant oro burbuliukų tarp gelio ir membranos. Sumuštinio susidarymas baigtas du sudrėkinto filtro popieriaus sluoksniais, kurie yra ant gelio paviršiaus (2 pav.). Gautas sumuštinis yra pritvirtintas prie kasetės ir yra tarp elektrodų, kad membrana susiduria su anode.

Fig. 2. Elektrinių baltymų schema ant membranos.

Ii. Elektra. \\ T

Elektros baltymai ant nitroceliuliozės membranos atliekami buferiu, kuriame yra 25 mm Tris, pH 8.3, 192 mm glicinas, 10% etanolio 30-50 min. Pastovi įtampa 100 V.

Elektrinis statinės laikas priklauso nuo nešiojamųjų baltymų dydžio, tuo daugiau baltymų, tuo ilgiau elektros barelį atliekamas. Apskaičiuota elektros energijos kokybė ir baltymų juostos vieta, dažykite nitroceliuliozės membraną su 0,3% ponceau s tirpalu 1% acto rūgšties. Prieš atlikdami imunocheminį dažymą, membrana turi būti praplaunama kelis kartus silpnai šarmiškai vandeniniu trasos tirpalu, kad būtų pašalintas dažai su baltymais.

III. Nitroceliuliozės membranoje imunocheminiai baltymų imunocheminiai dažai

Norėdami užblokuoti nespecifines antikūnų privalomas vietas, membrana yra inkubuojama pastoviu kambario temperatūroje 30 minučių iki PBST (geresniam užraktui, gali būti naudojamas 10% sauso nugriebto pieno).

Po blokavimo, membrana inkubuojama valandą kambario temperatūroje ir pastoviai maišant PBST, kuriame yra 1-10 μg / ml konkrečių antikūnų.

Optimali antikūnų koncentracija yra parinkta empiriškai ir priklauso nuo antikūnų sąveikos su antigenu afiniteto.

Inkubacijos pabaigoje membrana nuplauna 5 kartus Pbst ir perduoda į antrinių antikūnų tirpalą su krienų peroksidazės tirpalu. Konjugato veisimą paprastai nurodomas pakuotės gamintojas arba pasirinktas tyrėjas empiriškai. Antrinių antikūnų tirpale membrana inkubuojama 1 valandą su pastoviu maišymu.

Po kruopštaus plovimo (mažiausiai 5-6 kartus, PBST membrana perkeliama į chromogeninio pagrindo tirpalą, kuriame yra 3 mg diamalinzidino (DB) ir 10 μl 30% vandenilio peroksido 10 ml 0,1 m Tris-HCl , pH 7,6.

Inkubacija atliekama maišant 5 - 10 minučių. Membrana po inkubacijos galo su substratu reikia nuplauti PBST, sausu, švytėjimu su filtravimo popieriumi ir nedelsiant atlikti elektroninę kopiją, nuskaitymą. Jei membrana yra visiškai išdžiovinta, įbrėžti baltymų juostelės yra šviesios, o vaizdas yra mažiau ryškus ir kontrastas.

Pastaba: Dub yra toksiška medžiaga ir galimas kancerogenas. Dirbkite tik guminėms pirštinėms!