Šiuolaikiniai ŽIV infekcijos diagnozavimo metodai. Combibest testo naudojimas diagnozuojant ŽIV Ko tikėtis iš ŽIV rezultatų

ELISA (su fermentais susijęs imunosorbento tyrimas, ELISA - anglų k.) Į praktinės medicinos gyvenimą įžengė praėjusio amžiaus 60-aisiais. Pradinė jo užduotis buvo histologiniai tyrimai mokslo tikslais, kurie susiveda į gyvo organizmo ląstelių antigeninės struktūros paiešką ir nustatymą.

ELISA metodas pagrįstas specifinių (AT) ir susijusių antigenų (AG) sąveika su "antigeno - antikūno" komplekso susidarymu, kuris nustatomas naudojant fermentą. Šis faktas paskatino mokslininkus manyti, kad metodas gali būti naudojamas diagnostikos tikslais nustatant įvairių klasių specifinius imunoglobulinus, susijusius su imuniniu atsaku į tam tikrą infekciją. Ir tai buvo klinikinės laboratorinės diagnostikos proveržis!

Metodas pradėtas aktyviai naudoti tik 80-ųjų pradžioje, o vėliau, daugiausia, specializuotose įstaigose. Pirmieji imunofermentiniai fermentų analizatoriai buvo aprūpinti kraujo perpylimo centrais ir stotimis, infekcinėmis ir venerinėmis ligoninėmis, nes Afrikos žemyne ​​gimęs vyras, pasirodęs mūsų horizonte ir iškart prisijungęs prie „senų“ infekcijų, turinčių didžiulę AIDS, reikalavo neatidėliotinų diagnostikos priemonių ir jį veikiančių vaistų paieška.

ELISA metodo taikymo sritis

Fermentinio imunologinio tyrimo galimybės yra tikrai plačios. Dabar sunku įsivaizduoti, kaip galima apsieiti be tokių tyrimų, kurie pažodžiui naudojami visose medicinos šakose. Atrodo, ką ELISA gali padaryti onkologijoje? Pasirodo, kad gali. Ir daug. Analizės gebėjimas rasti žymenis, būdingus kai kuriems piktybinių navikų tipams, yra ankstyvas naviko nustatymas, kai jis dar nėra nustatytas kitu metodu dėl jo mažo dydžio.

Šiuolaikinė klinikinė laboratorinė diagnostika (CDL), be naviko žymenų, turi nemažą ELISA skydų arsenalą ir naudoja juos įvairioms patologinėms būklėms (infekciniams procesams, hormoniniams sutrikimams) diagnozuoti ir farmaciniams preparatams stebėti, kad būtų galima nustatyti jų poveikį pacientui. kūnas ir, beje, daro ne tik žmogus. Šiuo metu imunofermentas fermentais yra plačiai naudojamas veterinarijos tarnyboje, nes „mūsų mažesnieji broliai“ taip pat yra jautrūs daugeliui ligų, nuo kurių kartais jie labai kenčia.

Taigi, ELISA dėl savo jautrumo ir specifiškumo, remdamasi iš venos paimtu kraujo mėginiu, gali nustatyti:

• Hormoninė būklė (skydliaukės ir antinksčių hormonai, lytiniai hormonai);
• Virusinės ir bakterinės infekcijos buvimas (ŽIV, B ir C, chlamidijos, sifilis ir, taip pat daugelis kitų ligų, kurias sukelia patogeniniai mikroorganizmai);
• Mikroorganizmų, inicijavusių infekcinį procesą, gyvybinės veiklos pėdsakai, kurie baigėsi laimingai ir perėjo į imuninio atsako į šį patogeną susidarymo stadiją. Tokie pėdsakai, tai yra antikūnai, daugeliu atvejų lieka kraujyje cirkuliuoti visą gyvenimą, o tai apsaugo žmogų nuo pakartotinės infekcijos.

Kokia yra ELISA esmė?

Fermento imuninė analizė leidžia nustatyti ne tik paties patogeno buvimą (kokybinė analizė), bet ir jo kiekybinį kiekį paciento kraujo serume.

Virusinė ar bakterinė dozė reikšmingai paveikia infekcinio proceso eigą ir jo rezultatus, todėl kiekybinė analizė vaidina svarbų vaidmenį diagnozuojant ir gydant įvairios formos ir stadijos ligas.

Tačiau žinodami fermentų imuninę analizę kaip ELISA metodą, net nesusimąstome, kaip ji sugeba aprėpti tokį platų mūsų planetoje gyvenančių mikroorganizmų spektrą, kurių daugelis kelia tiesioginę grėsmę žmonių ir gyvūnų sveikatai ir gyvybei. Faktas yra tas, kad ELISA turi daugybę variantų (nekonkurencinių ir konkurencinių - tiesioginių ir netiesioginių), kurių kiekvienas išsprendžia savo problemą ir taip leidžia atlikti tikslingą paiešką.

Vienos ar kitos klasės imunoglobulinams identifikuoti naudojama tradicinė 96 duobučių polistireno plokštė (plokštė), kurios duobutėse sutelkti rekombinantiniai baltymai sutelkti kietojoje fazėje. Antikūnai arba antigenai, įstrigę šulinyje su kraujo serumu, randa „pažįstamą“ objektą ir su juo sudaro kompleksą (AG - AT), kuris, užsitvirtinęs fermento konjugatu, skaitydamas rezultatus, pasireikš pokyčiu. šulinio spalva.

Fermentinis imuninis tyrimas atliekamas su tam tikro specifiškumo bandymų sistemomis, pagamintomis specialiose laboratorijose ir aprūpintomis visais reikalingais reaktyviais komponentais. Tyrimai gali būti atliekami naudojant poveržles („poveržles“) ir spektrofotometrus, kurie dažniausiai atliekami rankiniu būdu. Žinoma, greičiau ir patogiau dirbti su pilnomis automatinėmis mašinomis, kurios atleidžia laborantą nuo monotoniškos laidojimo, skalbimo ir kitų įprastų užduočių, tačiau ne visos laboratorijos gali sau leisti šią prabangą ir toliau dirbti senamadiškai - pusiau automatiniu būdu. įrenginiai.

ELISA rezultatų aiškinimas priklauso laboratorinio diagnostiko kompetencijai, tuo tarpu būtinai atsižvelgiama į beveik visoms imunocheminėms reakcijoms būdingą savybę pateikti klaidingai teigiamą ar klaidingą neigiamą atsakymą.

Vaizdo įrašas: šiuolaikinis fermentų imunologinis tyrimas

ELISA rezultatas yra sifilio pavyzdys

Fermento imuninė analizė tinka visų formų nustatymui ir, be to, naudojamas atrankos tyrimuose. Analizei naudojamas paciento veninis kraujas, paimtas tuščiu skrandžiu. Darbe naudojamos tam tikro specifiškumo plokštelės (AT A, M, G klasės) arba bendras antikūnų kiekis.

Atsižvelgiant į tai, kad sifilio antikūnai gaminami tam tikra seka, ELISA gali lengvai atsakyti į klausimą, kada įvyko infekcija ir kuriame etape yra procesas, o gautus rezultatus galima interpretuoti tokia forma:

• IgM rodo infekcinio proceso trukmę (gali pasireikšti paūmėjus lėtinėms uždegiminėms ligoms);
• IgA teigia, kad infekcija įvyko daugiau nei prieš mėnesį;
• IgG rodo, kad infekcija yra pačiame įkarštyje arba apie neseniai atliktą gydymą, kurį lengva išsiaiškinti naudojant anamnezę.

Tiriant dėl ​​sifilio, duobutės, turinčios neigiamą atsaką (ir neigiamą kontrolę), išliks bespalvės, o teigiamas rezultatas (kaip ir teigiama kontrolė) suteiks ryškiai geltoną spalvą dėl tyrimo metu pridėto chromogeno spalvos pasikeitimo. Tačiau spalvų intensyvumas ne visada sutampa su valdikliu, tai yra, jis gali būti šiek tiek blyškesnis arba šiek tiek gelsvas. Tai yra abejotini rezultatai, kuriuos, kaip taisyklę, reikia iš naujo išnagrinėti, privalant atsižvelgti į spektrofotometre gautus kiekybinius rodiklius, tačiau apskritai spalva yra tiesiogiai proporcinga imuninių kompleksų (susijusių tarpusavyje) skaičiui. AG ir AT).

Patys įdomiausi su fermentais susiję imunosorbentiniai tyrimai - ŽIV ELISA

Galbūt labiau nei kitų analizė yra įdomi plačiam gyventojų ratui, nes vis dar neįmanoma tiksliai pasakyti, kad išnyko daug socialinių problemų (prostitucija, narkomanija ir kt.). Deja, ŽIV paveikia ne tik šiuos žmonių visuomenės sluoksnius, bet ir gali užsikrėsti įvairiomis aplinkybėmis, kurios nėra susijusios su seksualiniu palaidumu ar narkotikų vartojimu. Bet kadangi atsirado ŽIV tyrimo poreikis, nereikėtų bijoti, kad visi aplinkiniai sužinos apie apsilankymą tokioje laboratorijoje. Dabar ŽIV užsikrėtusius žmones saugo įstatymai, o abejojantys gali kreiptis į anoniminius biurus, kur jie gali išspręsti problemą, nebijodami viešumo ir pasmerkimo.

Su fermentais susijęs imunosorbento tyrimas, naudojamas diagnozuoti ŽIV infekciją, priklauso pirminiams standartiniams tyrimams, kuriems vis dėlto reikia specialių sąlygų, nes tema yra labai subtili.

ELISA ŽIV tikslinga atlikti po lytinių santykių, kraujo perpylimo, kitų medicininių manipuliacijų, kurios rodo infekciją, ir pasibaigus inkubaciniam laikotarpiui („seronegatyvus langas“), tačiau reikia nepamiršti, kad šis laikotarpis nėra pastovus. Jis gali baigtis per 14-30 dienų, o gali trukti iki šešių mėnesių, todėl laikoma, kad vidutinė vertė yra intervalas nuo 45 iki 90 dienų. ŽIV atveju kraujas paimamas taip pat, kaip ir kitoms infekcijoms - iš tuščio skrandžio venos. Rezultatai bus paruošti atsižvelgiant į medžiagos kaupimąsi laboratorijoje ir jos darbo krūvį (nuo 2 iki 10 dienų), nors dažniausiai laboratorijos atsakymą pateikia tą pačią ar kitą dieną.

Ko galite tikėtis iš ŽIV rezultatų?

ELISA ŽIV infekcijai nustato antikūnus prieš du viruso tipus: ŽIV-1 (dažniau Rusijoje ir kitose Europos bei Azijos šalyse) ir ŽIV-2 (dažniau Vakarų Afrikoje).

ŽIV ELISA užduotis yra ieškoti G klasės antikūnų, kurie aptinkami visose tyrimo sistemose, tačiau vėliau, ir A bei M klasės antikūnų, aptiktų naujos kartos rekombinantinių tyrimų rinkiniuose, kurie leidžia rasti antikūnus ankstyviausi etapai (inkubacinis laikotarpis - „Seronegatyvus langas“). Iš IFA galima tikėtis šių atsakymų variantų:

1. Pirminis teigiamas rezultatas: kraujas turi būti patikrintas to paties tipo tyrimo sistemoje, tačiau, jei įmanoma, kita partija ir kitas asmuo (laboratorijos padėjėjas);
2. Pakartotinis (+) prisiima naują paciento kraujo mėginį, kurio tyrimas yra panašus į pirminę analizę;
3. Kitas teigiamas rezultatas atliekamas atlikus pamatinę analizę, kurioje naudojami labai specifiniai bandymų rinkiniai (2–3 vnt.);
4. Teigiamas rezultatas abiejose (arba trijose) sistemose siunčiamas atlikti imunoblotą (tas pats ELISA, bet atliekamas atskirai su ypač didelio specifiškumo bandymų rinkiniais).

Išvada apie ŽIV infekciją daroma tik remiantis imunoblotingu. Pokalbis su užkrėstu asmeniu vyksta visiškai konfidencialiai. Už medicininių paslapčių atskleidimą Rusijoje, kaip ir kitose šalyse, gresia baudžiamoji bausmė.

Chlamidijos ir citomegaloviruso analizės, atliekant imuninę fermentinę analizę, taip pat ypač išpopuliarėjo dėl to, kad jomis galima nustatyti infekcijos laiką, ligos stadiją ir terapinių priemonių efektyvumą.

Įvedus taip pat galima pastebėti įvairių klasių antikūnų atsiradimą. skirtingose ​​infekcinio agento sukeltos patologinės būklės fazėse:

• IgM galima aptikti jau praėjus septynioms dienoms po infekcijos;
• IgA rodo, kad infekcija organizme gyvena daugiau nei mėnesį;
• IgG patvirtina chlamidijų diagnozę, padeda stebėti gydymą ir nustatyti jo veiksmingumą. Pažymėtina, kad G klasės antikūnai organizme išlieka ir cirkuliuoja nepriklausomai nuo ligos amžiaus, todėl norint teisingai interpretuoti analizę, būtina atsižvelgti į pamatines vertes (normas), kurios, beje, kiekvienam CDL yra skirtingi: atsižvelgiant į bandymo sistemos prekės ženklą ir į rinkinį įtrauktų reagentų specifiškumą. Normos vertės įvedamos į formą šalia ELISA rezultato.

Kalbant apie tai, čia yra šiek tiek kitoks: M klasės antikūnai atsiranda maždaug per pusantro mėnesio, tai yra, teigiamas rezultatas (IgM +) tampa pirminės infekcijos fazėje arba reaktyvavus latentinę infekciją ir toks išlieka nuo 4 mėnesių iki šešių mėnesių.

G klasės antikūnų buvimas būdingas pirminės ūminės infekcijos ar reinfekcijos atsiradimui. Analizėje teigiama, kad virusas egzistuoja, tačiau nepateikia informacijos apie infekcinio proceso stadiją. Tuo tarpu nustatant IgG titro normą taip pat kyla sunkumų, nes tai visiškai priklauso nuo konkretaus asmens imuninės būklės, kuri vis dėlto nustatoma nustatant G klasės imunoglobulinus. Atsižvelgiant į tokį antikūnų elgesį, diagnozuojant CMVI, įvertinti G klasės antikūnų gebėjimą sąveikauti su CMV, siekiant vėliau jį „neutralizuoti“ (AT avidumas). Pradiniame ligos etape IgG labai blogai jungiasi su viruso antigenais (mažas avidumas) ir tik tada jie pradeda rodyti aktyvumą, todėl galime kalbėti apie antikūnų avidiškumo padidėjimą.

Galima daug kalbėti apie imunofermentinio fermento pranašumus, nes šiuo metodu pavyko išspręsti daugelį diagnostinių problemų naudojant tik veninį kraują. Nereikia ilgai laukti, rūpintis ir rinkti medžiagą tyrimams. Be to, ELISA testavimo sistemos ir toliau tobulinamos, o diena nėra toli, kai testas suteiks 100% rezultato patikimumą.

Vaizdo įrašas: mokomasis Maskvos valstybinio medicinos universiteto filmas. Sečenovas apie ELISA pagrindus

Patento RU 2283497 turėtojai:

Išradimas yra susijęs su biotechnologijų ir medicinos sritimi. Su fermentais susieta imunosorbuojanti sistema, skirta identifikuoti pirmojo ir antrojo tipo antikūnų prieš žmogaus imunodeficito virusą (ŽIV) spektrą, pirmojo tipo O grupė ir aptikti pirmojo tipo žmogaus imunodeficito viruso p24 antigeną, apima: imunosorbentas, pagrįstas žmogaus imunodeficito viruso antigenais, kurie yra gp41 (env ŽIV-1 ir ŽIV-2 O grupė), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), gp36 (ŽIV-2 env), antikūnai prieš ŽIV 1 antigeną p24 ir aptikimo reagentai, minėtiems ŽIV antigenams ir ŽIV antikūnams sorbuojant skirtingose ​​plokštelių duobutėse su fermentu susietam imunosorbuojančiam tyrimui, o sorbcijai naudojamos 96 duobučių sulankstomos arba nesubyrėjusios polistireno plokštelės. POVEIKIS: padidėjęs rezultatų jautrumas, supaprastinimas, subjektyvumo neįtraukimas. 1 vnt f-kristalai, 10 tablečių, 1 dwg

Išradimas yra susijęs su biotechnologijų ir medicinos sritimi. Naudojimas: diferencinis visų specifinių antikūnų prieš žmogaus imunodeficito 1 ir 2 viruso baltymus, ŽIV 1 grupės O ir p24 antigeną ŽIV 1 baltymų nustatymas.

Esmė: gauti su fermentais susietą imunosorbento tyrimo sistemą, skirtą nustatyti visų klasių antikūnų spektrą atskiriems baltymams ir ŽIV 1 ir 2, ŽIV 1 grupės O ir ŽIV 1 p24 antigenams kraujo serume (plazmoje), imunoglobulinuose ir žmogaus kraujo preparatuose. siekiant nustatyti antikūnų prieš ŽIV 1 ir 2, ŽIV 1 grupės O spektrą, nustatyti ŽIV 1 p24 antigeną ir patvirtinti teigiamus ar abejotinus antikūnų prieš ŽIV 1 ir 2, ŽIV 1 grupės O ir ŽIV 1 p24 antigenus patikros rezultatus.

Išradimo aprašymas

Laboratorinė ŽIV infekcijos diagnostika remiasi trimis sritimis: a) ŽIV ir jo komponentų indikacija; b) antikūnų prieš ŽIV nustatymas; c) imuninės sistemos pokyčių nustatymas. Tarp esamų laboratorinės diagnostikos metodų labiausiai paplitę serologiniai metodai yra antikūnų prieš viruso antigenus nustatymas.

ŽIV infekcijos antikūnams aptikti daugiausia naudojamas su fermentais susijęs imunosorbento tyrimas (ELISA) ir imunoblotingas (IB). ELISA yra pagrįsta virusinių antigenų imobilizavimu ant plokštelių, prie kurių jungiasi paciento antikūnai, o antigenų ir antikūnų kompleksas nustatomas naudojant krienų peroksidazės konjuguotus monokloninius pelės antikūnus žmogaus imunoglobulinams G ir M. Metodas yra gana specifinis ir jautrus ir leidžia nustatyti virusams specifinius antikūnus 95% pacientų. Likę 5% atvejų atsiranda ankstyvoje infekcijos stadijoje, kai kraujo serume vis dar yra nedaug antikūnų, arba galutinėse ligos fazėse, kai organizmas nebegali sintetinti antikūnų dėl staigaus imuninė sistema. Taip pat galimi klaidingai teigiami ELISA rezultatai, daugiausia pacientams, sergantiems autoimuninėmis ir onkologinėmis ligomis, taip pat infekcija, kurią sukelia Estein-Barr virusas. Šiuo atveju antikūnų kryžminė reakcija į reumatoidinį faktorių, Epstein-Barr virusą ar antigeninius determinantus, panašius į pagrindinio 1 ir 2 histokompatibilumo komplekso baltymų baltymus (HLA-4 ir DQW3) ir galinčius prisijungti prie ŽIV. atsiranda antigenų. Klaidingai teigiami rezultatai dažnai pastebimi nėščioms moterims ir pagyvenusiems žmonėms. Hemolizė, lipemija, bakterijų užteršimas serumu taip pat gali sukelti netikslius rezultatus.

Šiuo atžvilgiu antikūnų aptikimo rezultatų specifiškumui patikrinti buvo pasiūlyta ir panaudota keletas metodų. Iš šių metodų dažniausiai naudojama Western Blot modifikacija imuninėje blot reakcijoje. Metodo esmė yra tokia: pirmajame etape ŽIV baltymai atskiriami pagal molekulinę masę, naudojant poliakrilamido gelio elektroforezę. Tada elektroforezinis pernešimas iš poliakrilamido gelio į nitroceliuliozės membranos paviršių. Tokiu būdu perkelti antigenai nustatomi ant membranos naudojant netiesioginę analizę: membrana inkubuojama su tiriamąja medžiaga; esantys antikūnai jungiasi su ŽIV antigenais, perkeltais į nitroceliuliozės membraną, tada membranos juostelės inkubuojamos su konjugatu; kai susidaro antigeno-antikūno kompleksas, prie jo prijungiamas konjugatas, po plovimo iš konjugato ir inkubavimo su substratu atsiranda tų nitroceliuliozės vietų dažymas, kur susidaro antigeno-antikūno-konjugato kompleksas. Brėžinyje pateikiami teigiamų, silpnai teigiamų ir neigiamų imunobloto rezultatų pavyzdžiai.

Asmenų, užsikrėtusių ŽIV-1 ir ŽIV-2, serume nustatomi šių baltymų (p) ir glikoproteinų (gp) antikūnai: A lentelė.

B lentelėje pateikiami imuninio blotingo rezultatų vertinimo kriterijai, kuriuos rekomenduoja PSO ir Rusijos AIDS prevencijos ir kontrolės centras.

Remiantis PSO kriterijais, serumai laikomi teigiamais, jei IB metodu nustatomi antikūnai prieš bet kuriuos du ŽIV-1 apvalkalo baltymus. Jei vyksta reakcija tik su vienu iš gaubiamųjų baltymų (gp160, gp120, gp41) kartu su reakcija su kitais baltymais ar be jų, rezultatas laikomas abejotinu. Pasak Rusijos Federacijos Sveikatos apsaugos ministerijos federalinio mokslo ir metodikos centro, skirto AIDS prevencijai ir kontrolei, serumus galima interpretuoti kaip teigiamus ir esant antikūnams tik vienam apvalkalo baltymui.

Antikūnų prieš p24 antigeną nustatymas gali rodyti serokonversijos pradžios laikotarpį, nes antikūnai prieš šį konkretų baltymą atsiranda pirmiausia. Teigiamos reakcijos su gag ir pol baltymais be reakcijos su env baltymais gali atspindėti ankstyvą serokonversijos stadiją, taip pat nurodyti ŽIV-2 infekcijos buvimą ar nespecifinę reakciją.

Imunoblotting reakcijų naudojimas ŽIV diagnostikoje kaip eksperto metodas turi daug reikšmingų trūkumų:

1. Neįmanoma patvirtinti ŽIV 1 p24 antigeno aptikimo, jei naudojami testai, kurie tuo pačiu metu nustato antigeną ir antikūnus prieš ŽIV, todėl netikslinga (beprasmiška) naudoti kaip atrankinius testus vienu metu aptikti antigeną ir antikūnus į ŽIV (2001 07 30 Rusijos Federacijos Sveikatos apsaugos ministerijos įsakymas Nr. 292: „donorams tirti kraujo perpylimo stotyse būtina naudoti tyrimo sistemas, kurios vienu metu aptinka antigeną ir antikūnus ŽIV“).

2. Tik IgG klasės antikūnų nustatymas. Neįmanoma visiškai patvirtinti teigiamų rezultatų, gautų naudojant 3 ir 4 kartos testus (nustatant IgG ir IgM antikūnus).

3. Tiriamojo balo aiškinimo subjektyvumas, ypač „abejotinų“ ir „neaiškių“ rezultatų atvejais ir pradinėse serokonversijos stadijose (aptinkamos juostelės ant nitroceliuliozės membranų šiais atvejais yra neaiškios, vos matomos plika akimi ir kai vertinant skirtingų asmenų, dažnai pastebimi nesutarimai).

4. Automatinio kiekybinio analizės rezultatų vertinimo neįmanoma.

5. Mažesnis jautrumas, palyginti su ELISA.

6. Sandėliavimo trapumas (laikant nitroceliuliozės membranos juostelės išnyksta ir negali būti objektyvus ŽIV nustatymo ar neaptikimo patvirtinimas ginčytinais atvejais).

7. Sunkumai nustatant reakciją ir laikymą (nitroceliuliozės membranos juostelės yra labai trapios ir dažnai lūžta).

8. Didelės informacijos saugumo rinkinių kainos.

Žinomas reagentas, kuris yra antigenų ir antikūnų prieš tą patį patogeną, įskaitant ŽIV, nustatymo rinkinys (DE 4236189 F1, 1994 04 28). Tačiau neatskleidžiama bandymų sistema, leidžianti diagnozuoti ŽIV infekciją įvairiais etapais.

Šio išradimo tikslas yra pateikti bandymų sistemą, kuria būtų galima patvirtinti teigiamus ar abejotinus antikūnų prieš ŽIV 1 ir 2, ŽIV 1 grupės O ir ŽIV 1 p24 antigenus atrankos tyrimų rezultatus, naudojant bandymus tuo pačiu metu. nustatyti antigenus ir antikūnus.

Siūlomas techninis sprendimas pasiekiamas naudojant su fermentais susietą imunosorbuojančią sistemą, skirtą identifikuoti pirmojo ir antrojo tipo antikūnų prieš žmogaus imunodeficito virusą (ŽIV) spektrą, pirmojo tipo O grupę ir aptikti p24 antigeną. pirmojo tipo žmogaus imunodeficito virusas p24, pasižymintis tuo, kad jis apima imunosorbentą, pagrįstą antigenų žmogaus imunodeficito virusu, kuris yra gp41 (env ŽIV-1 ir ŽIV-2 O grupės), gp120 (env), p24 (gag ), p31 (pol), gp36 (env ŽIV-2), antikūnai prieš ŽIV antigeną 1 p24 ir aptikimo reagentai, kur aukščiau nurodyti ŽIV antigenai ir ŽIV antikūnai yra sorbuojami skirtinguose ELISA plokštelių šuliniuose.

Be to, sorbcijai naudojamos 96 duobučių polistirolo sulankstomos arba nesulankstomos plokštelės, skirtos su fermentais susijusiam imunosorbento tyrimui.

Pagal šį išradimą pasiektas techninis rezultatas yra galimybė patvirtinti teigiamus antikūnų prieš ŽIV 1 ir 2, ŽIV 1 grupės O ir ŽIV 1 p24 antigenus rezultatus, didelis jautrumas, galimybė automatizuotai interpretuoti rezultatus, o tai neįtraukia subjektyvumo. įvertinimo, testą atlikti yra lengviau, nei naudojant esamus informacijos saugumo sąnaudų rinkinius.

Šis techninis sprendimas skiriasi nuo žinomų:

1. Naudojant plokštelę imunologinėms reakcijoms kaip kietosios fazės nešiklį.

2. Vienu metu naudojant antikūnus prieš p 24 ŽIV ir ŽIV antigenų rinkinį kaip sorbentą.

Išradimą iliustruoja šis pavyzdys.

Dabartinis sukurtos bandymų sistemos „DS-ELISA-ANTI-ŽIV 1,2-SPECTRUM + AG p24 ŽIV 1“ principas yra:

Imunosorbentas - rekombinantiniai antigenai, panašūs į struktūrinius ŽIV-1 baltymus: gp41 (env ŽIV-1 ir ŽIV 1 O grupė), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), ŽIV-2: gp36 (env) ir monokloniniai pelės antikūnai prieš ŽIV 1 antigeną (p24), atskirai sorbuoti ant sulankstomos polistirolo plokštelės juostelių.

Paruošiant imunosorbentą:

1. ŽIV-1 gp41 yra baltymas, kurį gamina E. coli padermė # AHIV 103.

2. ŽIV-1 gp120 yra baltymas, kurį gamina E. Coli padermė Nr. AHIV 109.

3. ŽIV-1 p24 - baltymas, kurį gamina E. Coli padermė Nr. AHIV 105.

4. ŽIV-1 p31 yra baltymas, kurį gamina E. Coli padermė Nr. AHIV 108.

5. ŽIV-2 p36 yra baltymas, kurį gamina E. Coli padermė Nr. AHIV 106.

1 konjugatas, liofilizuotas arba skystas, yra pelės monokloninis antikūnas prieš ŽIV1 p24 antigeną, konjuguotą su biotinu.

1. Liofilizuotas arba skystas 2 konjugatas yra rekombinantinių antigenų, panašių į struktūrinius ŽIV-1 baltymus, mišinys: gp41 (env ŽIV-1 ir ŽIV 1 grupė O), gp120 (env), p24 (gag), p31 ( po1); ŽIV-2: gp36 (env), konjuguotas su biotinu;

2. 3, 4 konjugatai - liofilizuoti arba skysti - streptavidinas, pažymėtas krienų peroksidaze;

Atliekant išankstinius tyrimus, buvo pasirinktas testavimo sistemos dizainas, parengta jo komponentų paruošimo technologija, optimizuotos fermento imuninės analizės sąlygos.

Nustatant ELISA testo sistemoje „DS - ELISA - ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM + Ag p24 HIV 1“, į plokštelės duobutes su adsorbuotais antikūnais prieš p24 įpilama 25 μl konjugato-1 ir duobutės su adsorbuotais antigenais - 25 μl konjugato-2. Reakcijos nustatymas parodytas žemiau. Po to į kiekvieną duobutę įpilama 25 μl bandinio. Tuo pačiu metu šuliniuose su antigenais spalva keičiasi nuo oranžinės iki rausvos, o šulinyje su antikūnais - nuo žalios iki pilkos. Mišinys inkubuojamas 45 minutes 37 ° C temperatūroje purtyklėje (arba 1 valandą 37 ° C temperatūroje termostate). Tada, neplaunant, į plokštelės duobutes pridedama 50 μl konjugato-3, kad būtų galima nustatyti p24 antigeną, ir 50 μl konjugato-4 pridedama prie duobučių antikūnams nustatyti. Po inkubavimo 20 minučių 37 ° C temperatūroje purtyklėje (arba 30 min. 37 ° C temperatūroje termostate), plokštelė nuplaunama ir sukuriama su substrato mišiniu. Bendra reakcijos trukmė yra 1 val. 25 min. (Arba 1 val. 50 min.). Tiriamame mėginyje esantis p24 antigenas prisijungia prie monokloninių antikūnų prieš p24, o specifiniai antikūnai sudaro kompleksą su plokštelėje esančiais rekombinantiniais antigenais. Gautas imuninis kompleksas anti-p24 su p24 nustatomas konjugatais anti-p24-biotinu, tada streptavidino-peroksidaze, o Ag-ŽIV imuniniais kompleksais su Ab-ŽIV - konjugatu Ar-biotinu, tada streptavidino-peroksidaze.

Reakcijos nustatymo schema.

Į rezultatus atsižvelgiama spektrofotometriškai esant dviem bangos ilgiams: 450 / 620-680 nm, prietaisui nustatant „oru“. Atsižvelkime į vieno bangos ilgio 450 nm rezultatus.

Į analizės rezultatus atsižvelgiama, jei vidutinis optinis tankis (OD) duobutėse su K- yra ne didesnis kaip 0,2, duobutėse su K + - ne mažesnis kaip 1,0. OP krit. apskaičiuojamas pagal formulę:

OP krit. gp41 = plg. prasmė OP K- (gp41) +0,15

OP krit. gp120 = plg. prasmė OP K- (gp120) +0,15

OP krit. p24 = plg. prasmė OP K- (p24) +0,15

OP krit. p31 = plg. prasmė OP K- (p31) +0,15

OP krit. gp36 = plg. prasmė OP K- (gp36) +0,15

OP krit. Ag p24 = plg. prasmė OP k- (Ag p24) +0,04

kur 0,15 ir 0,04 yra koeficientai, nustatyti taikant gamintojo statistinio apdorojimo metodą. Kuriant bandymų sistemas, buvo naudojami:

1. Sveikų donorų kraujo serumo mėginiai (n = 610).

2. Kraujo serumo mėginiai iš pacientų, sergančių įvairiomis infekcinėmis ligomis, nesusijusiomis su ŽIV (ūminės kvėpavimo takų infekcijos, pneumonija, tonzilitas, herpetinės ir citomegalovirusinės infekcijos, sifilis, chlamidijos, virusiniai hepatitai A, B ir C (n = 224)).

3. Kraujo serumo mėginiai iš pacientų, sergančių įvairiomis neinfekcinėmis ligomis - traumomis, širdies ir kraujagyslių sistemos ligomis, onkologija (n = 35).

4. Nėščių moterų kraujo serumo mėginiai (n = 40).

5. Kraujo serumo mėginiai, seropozityvūs ELISA metodu ir patvirtinti imunoblotu (n = 428).

6. Serumo mėginiai, turintys teigiamą rezultatą, gauti su fermentais susietose imunosorbuojančių tyrimų sistemose, skirtose vienu metu nustatyti ŽIV 1,2 antikūnus ir p24 antigeną, ir neapibrėžtas rezultatas - imunoblotu (n = 123).

7. Vidinis serumų skydelis, kuriame yra antikūnų prieš ŽIV 1,2 ir kurių nėra, ištirta naudojant su fermentais susijusius imunosorbentinius tyrimus ir imunoblotą, įregistruotą Rusijos Federacijos Sveikatos apsaugos ministerijoje (n = 21).

8. Standartinis „ŽIV 1 ANTIGENO STANDARTAS“, „BIO RAD“, Prancūzija, kat. Nr. 72217, kuris yra antigenas, gautas iš viruso lizato.

9. Įmonės vidinis standartas. Mėginys, kuriame yra p 24 antigeno, kurio koncentracija 200 pg / ml, gautas iš viruso lizato ir titruojamas pagal „ŽIV 1 ANTIGENO STANDARTO“ įmonę „BIO RAD“, Prancūzija, kat. Nr. 72217.

10. Standartinė serumų grupė, turinti antikūnų prieš 1 tipo žmogaus imunodeficito virusą (ŽIV 1) - OSO 42-28-212-93-02P, Medico-Biological Union, Novosibirskas.

11. Standartinė serumų grupė, turinti antikūnų prieš II tipo žmogaus imunodeficito virusą (ŽIV 2) - OSO-42-28-216-02P, "Medici-Biological Union", Novosibirskas.

12. Standartinė serumų grupė, kurioje nėra antikūnų prieš 1 ir 2 tipo žmogaus imunodeficito virusą (ŽIV 1, 2) - OSO-42-28-214-94-02P, "Medici-Biological Union", Novosibirskas.

Tyrimo sistemos jautrumas p24 antigenui nustatyti buvo įvertintas naudojant vidinį įmonės standartą „ŽIV I ANTIGENO STANDARTAS“, „BIO RAD“. Naudojant vidinį standartą, buvo paruošti 4 nuoseklūs 2 kartų praskiedimai nuo 40 pg / ml iki 5 pg / ml, naudojant skiediklį normalios donoro plazmos be antikūnų prieš ŽIV 1, 2. Jautrumo kriterijumi buvo laikomas mažiausias aptikto antigeno kiekis. Gauti duomenys pateikti 1 lentelėje.

Norėdami įvertinti testavimo sistemos jautrumą nustatant specifinius antikūnus, mes panaudojome standartines mėginių plokštes, kuriose buvo antikūnų prieš žmogaus imunodeficito virusą (ŽIV 1, 2) (OSO 42-28-212-93-02P p.012, OSO 42 -28-216- 02P (ŽIV 2) p. 003).

Gauti duomenys pateikti 3, 4 lentelėse.

Buvo atliktas bandymų sistemos „DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM + AHr24 HIV 1“ diagnostinio efektyvumo palyginimas su tyrimo sistemomis „Jenscrin-HIV-Ag / Ab“ (Bio-Rad) “. DIA-ŽIV 1/2 "(Diaprof-Med)," Vironostika HIV Uni-forma II Ag / Ab "(Biomerioux)," Rekombinantinis-ŽIV1,2 DSM "(MBS)," Amercard Anti-ŽIV-1,2 K "(Amercard)," ŽIV-1, ŽIV-2-ELISA-Avicena "(Avicenna). Tam buvo atlikti vidinio skydo serumo mėginiai. 5 lentelėje pateikti rezultatai rodo didelį „DS-ELISA-ANTI-ŽIV 1,2-SPECTRUM + AGr24 ŽIV 1“ diagnostinį efektyvumą.

Tyrimų sistemos „DS-ELISA-ANTI-ŽIV 1,2-SPECTRUM + AGr24 ŽIV 1“ jautrumo tyrimai taip pat buvo atlikti su pacientų kraujo serumu, patvirtintu imunoblote kaip ŽIV teigiamais. Iš viso buvo ištirti 428 tokių serumų mėginiai. Gauti keli antikūnų prieš skirtingus ŽIV baltymus ir p24 antigeną nustatymo variantai. Rezultatai pateikti 6 lentelėje.

Tiriant ŽIV 1 teigiamus mėginius, 3% serumų buvo teigiami gp36 (ŽIV 2 env). OP / OPcrit. šių mėginių neviršijo 2,0. Mūsų duomenys apie ŽIV 1 (gp41) ir ŽIV 2 (gp36) išorinio apvalkalo baltymų kryžminį reaktyvumą sutampa su literatūros duomenimis.

Rezultatų aiškinimas

ŽIV teigiamų serumų ir standartinių bei vidinių skydų mėginių analizė „DS-ELISA-ANTI-ŽIV 1,2-SPECTRUM + AGr24 ŽIV 1“ leido sukurti šio testo rezultatų aiškinimo kriterijus. Rekomenduojami kriterijai pateikti 7 lentelėje.

Remiantis šiais kriterijais, visi ŽIV teigiamų serumų mėginiai (n = 428) buvo apibrėžti kaip teigiami "DS-ELISA-ANTI-ŽIV 1,2-SPECTRUM + AGr24 ŽIV1". Iš 16 standartinės grupės mėginių, kuriuose yra antikūnų prieš ŽIV, 1, 14 yra teigiami, o 2 - neapibrėžti. Nustatyta, kad visi 8 standartinės grupės mėginiai, turintys antikūnų prieš ŽIV 2, buvo teigiami. Iš 10 vidinio skydo mėginių, kuriuose yra antikūnų prieš ŽIV, 1 buvo nustatytas kaip teigiamas, o 3 - kaip neapibrėžtas.

Tyrimų sistemos „DS-ELISA-ANTI-ŽIV 1,2-SPECTRUM + AGr24 ŽIV 1“ jautrumo tyrimai taip pat buvo atlikti su pacientų kraujo serumais, kurių teigiamas rezultatas buvo su fermentais susietų imunosorbentinių tyrimų sistemose, kurios vienu metu aptinka antikūnai ir p24 antigenas, ir neapibrėžti imunoblote ... Iš viso buvo ištirti 123 tokie mėginiai. Duomenys pateikti 8 lentelėje.

Tiriant imunobloto (n = 123) serumus su nenustatytu rezultatu "DS-ELISA-ANTI-ŽIV 1,2-SPECTRUM + AGr24 ŽIV 1" 72 mėginiuose (58,5%) buvo teigiamas rezultatas. Iš jų 26 serumai (21,1%) yra teigiami tik p24, 20 (16,3%) - tik antikūnams, 16 (13%) - p24 su antikūnais vienam iš baltymų, 10 (8,1%) - p24 su antikūnais į du ar daugiau baltymų. Taigi, tiriant tik antikūnus (neaptikus p24), 30 mėginių (24,4%) būtų buvę galima nustatyti kaip teigiamus. Tyrime aptikus p24 antigeną, papildomus 42 mėginius (34,1%) galima nustatyti kaip teigiamus.

Testo sistemos specifiškumui įvertinti buvo naudojama standartinė serumų grupė, neturinti antikūnų prieš ŽIV 1, 2 (n = 20); kraujo serumo mėginiai iš sveikų donorų (n = 610), pacientų, sergančių įvairiomis infekcinėmis ligomis (n = 224), kraujo serumo mėginiai, nesusiję su ŽIV; kraujo serumo mėginiai iš pacientų, sergančių įvairiomis neinfekcinėmis ligomis - traumomis, širdies ir kraujagyslių sistemos ligomis, onkologija (n = 35); nėščių moterų kraujo serumo mėginiai (n = 40). Iš viso buvo ištirti 929 mėginiai. Vienas sveikų donorų kraujo serumo mėginys parodė klaidingai teigiamą rezultatą - buvo aptikti antikūnai prieš gp41 ir p24. 7 kraujo serumo mėginiai iš sveikų donorų ir 2 kraujo serumo mėginiai iš pacientų, sergančių infekcinėmis ligomis, nesusijusiomis su ŽIV, parodė klaidingai teigiamą p24 rezultatą.

Norint įvertinti bandymo sistemos specifiškumą, buvo naudojama standartinė neigiamų mėginių grupė (OSO 42-28-214-94-02p, p. 009). Specifiškumas buvo 100%.

Taigi tyrimai parodė, kad tiriant kraujo serumo mėginius iš normalių donorų ir pacientų, sergančių įvairiomis infekcinėmis ir somatinės ligos.

Gauti duomenys rodo aukštą sukurtos bandymų sistemos „DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM + AGr24 HIV 1“ diagnostinį efektyvumą. Tyrimo sistema gali būti naudojama antikūnams aptikti atskiriems ŽIV 1 ir 2 tipų baltymams ir ŽIV1 p24 antigenui, siekiant patvirtinti teigiamą atrankos rezultatą testavimo sistemomis, nustatančiomis antikūnus, arba bandymo sistemomis, kurios vienu metu aptinka antikūnus ir ŽIV1 p24 antigeną. Tyrimo sistema gali būti naudojama kaip alternatyva imunoblot testui teigiamiems rezultatams patvirtinti, taip pat tirti antikūnų prieš ŽIV ir p24 antigeną dinamiką skirtingose ​​infekcijos stadijose.

BANDYMO PRIVALUMAI

1. Patvirtinamasis fermentų imunosorbento tyrimas tablečių formatu

2. Patvirtinimo testas, derinant ŽIV 1, 2 antikūnų ir ŽIV 1 p24 antigeno spektro nustatymą.

3. Visų Ig klasių antikūnų nustatymas

4. Jautrumas nustatant p24 yra ne mažesnis kaip 5 pg / ml

5. Leidžia sumažinti neapibrėžtų rezultatų skaičių, palyginti su imunoblotu

6. Analizės laikas - 1 val. 25 min. (Imunoblotas - nuo 3 iki 20 val.)

7. Vizualus visų komponentų ir mėginių panaudojimo įvertinimas.

1. Su fermentais susijusi imunosorbuojanti sistema, skirta identifikuoti pirmojo ir antrojo tipo antikūnų prieš žmogaus imunodeficito virusą (ŽIV) spektrą, pirmojo tipo O grupę ir aptikti pirmojo tipo žmogaus imunodeficito viruso p24 antigeną p24 , b e s i s k i r i a n t i tuo, kad jis apima imunosorbentą, pagrįstą žmogaus imunodeficito viruso antigenais, kurie yra gp41 (ŽIV-1 ir ŽIV-2 env O grupės, gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), gp36 ( ŽIV-2 env), antikūnai prieš ŽIV 1 antigeną p24 ir aptikimo reagentai, o pirmiau minėti ŽIV antigenai ir ŽIV antikūnai yra sorbuojami skirtinguose lėkščių šuliniuose, kad būtų galima atlikti su fermentu susietą imunosorbento analizę.

2. Su fermentais susietos imunosorbento tyrimo sistema pagal 1 punktą, b e s i s k i r i a n t i tuo, kad sorbcijai naudojamos 96 duobučių sulankstomos arba nesulankstomos polistireno plokštelės fermento imunologiniam tyrimui.

Laiku diagnozuota ŽIV infekcija tampa itin svarbia priemone, nes ankstyvas gydymo pradžia iš esmės gali nulemti tolesnę ligos raidą ir pailginti paciento gyvenimą. Pastaraisiais metais padaryta didelė pažanga nustatant šią baisią ligą: senos bandymų sistemos keičiamos pažangesnėmis, tyrimo metodai tampa vis prieinamesni ir jų tikslumas žymiai didėja.

Šiame straipsnyje kalbėsime apie šiuolaikinius ŽIV infekcijos diagnozavimo metodus, kuriuos naudinga žinoti laiku gydant šią problemą ir palaikant normalią sergančio žmogaus gyvenimo kokybę.

ŽIV diagnostikos metodai

Rusijoje diagnozuojant ŽIV infekciją atliekama standartinė procedūra, apimanti du lygius:

• ELISA testų sistema (atrankinė analizė);
• imuninis baltymas (IB).

Be to, diagnostikai gali būti naudojami kiti metodai:

• greitieji testai.

ELISA testų sistemos

Pirmajame diagnostikos etape ŽIV infekcijai nustatyti naudojamas atrankos testas (ELISA), kurio pagrindas yra ŽIV baltymai, sukurti laboratorijose, kurie užfiksuoja specifinius antikūnus, gaminamus organizme reaguojant į infekciją. Po jų sąveikos su bandymo sistemos reagentais (fermentais) indikatoriaus spalva pasikeičia. Be to, šie spalvų pokyčiai apdorojami specialia įranga, kuri lemia atliktos analizės rezultatą.

Tokie ELISA testai gali parodyti rezultatus per kelias savaites po ŽIV infekcijos įvedimo. Ši analizė nenustato viruso buvimo, tačiau nustato antikūnų prieš jį gamybą. Kartais žmogaus organizme antikūnai prieš ŽIV prasideda po 2 savaičių po užsikrėtimo, tačiau daugumai žmonių jie atsiranda vėliau, po 3-6 savaičių.

Yra keturios skirtingo jautrumo ELISA testų kartos. Pastaraisiais metais dažniau naudojamos III ir IV kartos bandymo sistemos, sukurtos sintetinių peptidų ar rekombinantinių baltymų pagrindu ir pasižyminčios didesniu specifiškumu ir tikslumu. Jie gali būti naudojami diagnozuojant ŽIV infekciją, stebint ŽIV paplitimą ir užtikrinant saugumą tikrinant paaukotą kraują. III ir IV kartos ELISA testų sistemų tikslumas yra 93–99% (jautresnių testų, kurie gaminami Vakarų Europoje, yra 99%).

ELISA testui atlikti iš paciento venos paimama 5 ml kraujo. Tarp paskutinio valgymo ir analizės turėtų praeiti mažiausiai 8 valandos (paprastai tai atliekama ryte nevalgius). Tokį testą rekomenduojama atlikti ne anksčiau kaip po 3 savaičių nuo tariamos infekcijos (pavyzdžiui, po neapsaugoto lytinio akto su nauju lytiniu partneriu).

ELISA testo rezultatai gaunami per 2-10 dienų:

• neigiamas rezultatas: rodo, kad nėra ŽIV infekcijos, ir nereikia apsilankyti pas specialistą;
• klaidingai neigiamas rezultatas: jis gali būti pastebėtas ankstyvosiose infekcijos stadijose (iki 3 savaičių), vėlyvosiose AIDS stadijose, ryškiai slopinant imunitetą ir netinkamai ruošiant kraują;
• klaidingai teigiamas rezultatas: jį galima pastebėti sergant kai kuriomis ligomis ir netinkamai atlikus kraujo paruošimą;
• teigiamas rezultatas: rodo infekciją ŽIV infekcija, reikia IB ir paciento siuntimo pas AIDS centro specialistą.

Kodėl ELISA testas gali suteikti klaidingai teigiamų rezultatų?

Klaidingai teigiami ELISA testo ŽIV rezultatai gali būti pastebėti netinkamai apdorojant kraują arba pacientams, sergantiems šiomis ligomis ir ligomis:

• išsėtinė mieloma;
• infekcinės ligos, kurias išprovokavo Epstein-Barr virusas;
• būklė po;
• autoimuninės ligos;
• nėštumo fone;
• būklė po vakcinacijos.

Dėl aukščiau aprašytų priežasčių kraujyje gali būti nespecifinių kryžmiškai reaguojančių antikūnų, kurių gamyba nebuvo sukelta ŽIV infekcijos.

Pastaraisiais metais klaidingai teigiamų rezultatų dažnis žymiai sumažėjo dėl III ir IV kartos bandymų sistemų, kuriose yra jautresnių peptidų ir rekombinantinių baltymų, naudojimo (jie sintezuojami naudojant genų inžineriją in vitro). Pradėjus naudoti tokius ELISA testus, klaidingai teigiamų rezultatų dažnis žymiai sumažėjo ir yra apie 0,02–0,5%.

Klaidingai teigiamo rezultato nustatymas nereiškia, kad žmogus yra užsikrėtęs ŽIV. Tokiais atvejais PSO rekomenduoja atlikti kitą ELISA testą (privaloma IV karta).

Paciento kraujas siunčiamas į etaloninę ar arbitražo laboratoriją su užrašu „pakartoti“ ir analizuojamas naudojant IV kartos ELISA tyrimo sistemą. Jei naujos analizės rezultatas yra neigiamas, pirmasis rezultatas pripažįstamas klaidingu (klaidingai teigiamas) ir IB neatliekamas. Jei per antrąjį tyrimą gaunamas teigiamas ar abejotinas rezultatas, po 4-6 savaičių pacientui turi būti paskirtas IB, kad patvirtintų ar paneigtų ŽIV infekciją.

Imuninis blotavimas

Galutinę ŽIV infekcijos diagnozę galima nustatyti tik gavus teigiamą imuninio blotingo (IB) rezultatą. Jam įgyvendinti naudojama nitroceliuliozės juosta, ant kurios uždedami virusiniai baltymai.

Kraujo mėginiai IB paimami iš venos. Tada jis yra specialiai apdorojamas, o jo serume esantys baltymai atskiriami specialiu geliu pagal jų krūvį ir molekulinę masę (manipuliavimas atliekamas specialia įranga veikiant elektriniam laukui). Ant kraujo serumo gelio uždedama nitroceliuliozės juosta, o blotavimas atliekamas specialioje kameroje. Juostelė yra apdorojama ir jei naudojamose medžiagose yra antikūnų prieš ŽIV, jie prisijungia prie antigeninių juostų IB ir atrodo kaip linijos.

IB laikomas teigiamu, jei:

• pagal Amerikos CDC kriterijus - juostelėje yra dvi ar trys gp41, p24, gp120 / gp160 eilutės;
• pagal Amerikos FDA kriterijus - juostelėje yra dvi eilutės p24, p31 ir linija gp41 arba gp120 / gp160.

99,9% atvejų teigiamas IB rezultatas rodo ŽIV infekciją.

Jei nėra linijų - IB yra neigiamas.

Identifikuojant linijas su gp160, gp120 ir gp41-IB abejotina. Tokį rezultatą galima nustatyti, kai:

• onkologinės ligos;
• nėštumas;
• dažnas kraujo perpylimas.

Tokiais atvejais rekomenduojama atlikti pakartotinį tyrimą naudojant kitos įmonės rinkinį. Jei po papildomo IB rezultatas lieka abejotinas, stebėjimas yra būtinas šešis mėnesius (IB atliekamas kas 3 mėnesius).

Polimerazės grandininė reakcija

PGR testas gali aptikti viruso RNR. Jo jautrumas yra gana didelis ir jis leidžia jums nustatyti ŽIV infekciją jau 10 dienų po užsikrėtimo. Kai kuriais atvejais PGR gali duoti klaidingai teigiamų rezultatų, nes didelis jautrumas taip pat gali reaguoti į antikūnus prieš kitas infekcijas.

Ši diagnostikos technika yra brangi ir reikalauja specialios įrangos bei aukštos kvalifikacijos specialistų. Šios priežastys neleidžia to atlikti atliekant masinius gyventojų bandymus.

PGR naudojamas tokiais atvejais:

• nustatyti ŽIV naujagimiuose, kurie gimė ŽIV infekuotomis motinomis;
• nustatyti ŽIV „lango periodu“ arba abejotino IB atveju;
• kontroliuoti ŽIV koncentraciją kraujyje;
• donorų kraujo tyrimui.

Tik atlikus PGR testą, ŽIV nėra diagnozuojamas, tačiau jis atliekamas kaip papildomas diagnostikos metodas, skirtas išspręsti ginčytinas situacijas.

Express metodai

Viena iš ŽIV diagnostikos naujovių tapo greitieji testai, kurių rezultatus galima įvertinti per 10–15 minučių. Veiksmingiausi ir tiksliausi rezultatai gaunami naudojant imunochromatografinius tyrimus, pagrįstus kapiliarų srauto principu. Tai yra specialios juostelės, ant kurių tepamas kraujas ar kiti tiriami skysčiai (seilės, šlapimas). Esant antikūnams prieš ŽIV, po 10–15 minučių ant bandymo atsiranda spalvota ir kontrolinė juosta - teigiamas rezultatas. Jei rezultatas yra neigiamas, pasirodo tik kontrolinė juosta.

Kaip ir po ELISA testų, greitųjų tyrimų rezultatai turi būti patvirtinti atliekant IB analizę. Tik tada galima nustatyti ŽIV infekcijos diagnozę.

Yra skubių rinkinių, skirtų išbandyti namuose. „OraSure Technologies1“ testas (JAV) yra FDA patvirtintas, parduodamas be recepto ir gali būti naudojamas ŽIV nustatyti. Po tyrimo, jei rezultatas yra teigiamas, pacientui rekomenduojama atlikti tyrimą specializuotame centre, kad būtų patvirtinta diagnozė.

Kiti bandymai, skirti naudoti namuose, dar nėra patvirtinti FDA ir gali būti labai abejotini.

Nepaisant to, kad greitieji testai tikslumu prastesni už IV kartos ELISA testus, jie plačiai naudojami atliekant papildomus populiacijos tyrimus.

Galite atlikti testus ŽIV infekcijai nustatyti bet kurioje klinikoje, centrinėje rajono ligoninėje ar specializuotuose AIDS centruose. Rusijos teritorijoje jie laikomi visiškai konfidencialiai arba anonimiškai. Kiekvienas pacientas gali tikėtis gauti medicininę ar psichologinę konsultaciją prieš arba po tyrimo. Už ŽIV tyrimus teks mokėti tik komercinėse ligoninėse, o valstybinėse poliklinikose ir ligoninėse jie atliekami nemokamai.

Skaitykite apie būdus, kuriais galite užsikrėsti ŽIV ir kokie mitai apie galimybes užsikrėsti

Šiandien pasaulyje labiausiai paplitusi AIDS - virusas, kilęs iš retrovirusų pogrupio, jie dar vadinami lentivirusais arba „lėtaisiais“. Iš tiesų, žmogaus organizme jie pradeda rodyti aktyvumą po gana ilgo laiko, maždaug po 10 metų.

Yra 1 ir 2 tipo imunodeficitas. Bet mes galime drąsiai kalbėti apie pirmojo tipo viruso išplitimą. Patekęs į kraują ir prisijungęs prie ląstelės, atsakingos už imunitetą, virusas pradeda greitai daugintis. Nors CD4 molekulė, atsakinga už jos atpažinimą, nustato klastingą priešą, ji sugeba užkrėsti visą kūną. Todėl kuo anksčiau jis diagnozuojamas, tuo didesnė tikimybė, kad pacientas laiku gydysis ir gyvens ilgiau.

Jei asmuo turi pagrindą išbandyti save dėl AIDS, tai turėtų būti padaryta nedelsiant. Dažniausiai tokios diagnozės pagrindas yra antikūnų prieš imunodeficito nustatymas kraujyje - baltymai, atsirandantys kaip reakcija į viruso buvimą, ir jie pradeda formuotis nuo 1,5 iki 6 mėnesių nuo ligos. galima infekcija. Atitinkamai tikslingiau po šio laikotarpio atlikti diagnostiką.

Antikūnų kiekis nustatomas naudojant tyrimą, vadinamą imunofermentiniu fermentu (ELISA). Šis metodas yra patikimas, jis yra gana tikslus ir labai jautrus, šie skaičiai viršija 99,5%. Farmacijos rinka siūlo daugybę ELISA diagnostinių testų rinkinių: „CombiBest HIV“, „Anti-HIV 1 2“, „CombiBest anti-HIV“, „CombiBest anti-HIV 1 2“, „CombiBest“ anti-HIV 1 2 d 0172. Šios bandymų sistemos priklauso trečiajai karta. Šių reagentų trūkumas: jie ne visada nustato ligą ankstyvosiose stadijose. Žmogus jau yra viruso nešiotojas, jis yra potencialiai pavojingas partneriams, tačiau antikūnų kraujyje dar nėra.

Rinkiniuose daugiausia yra daugybė 12 * 8 arba 192 anti-ŽIV testų testų. Nerekomenduojama jų naudoti savarankiškai. Vaistų aprašymas rodo, kad jų pagrindinis tikslas yra nustatyti abiejų tipų antikūnų prieš AIDS kiekį. Taip pat nustatyti visų klasių antikūnus prieš AIDS. Jei nėra antikūnų, liga nebuvo diagnozuota.

Ketvirtosios kartos tyrimai „mato“, be antikūnų ir AIDS antigenų, jie gali aptikti infekciją anksčiau nei trečioji karta. Palyginimui: ŽIV antigeno yra kraujyje, pradedant nuo 5 dienos, o pirmieji antikūnai atsiranda ne anksčiau kaip po mėnesio. „CombiBest HIV 1, 2 AG / AT“ (1 rinkinys) ir „CombiBest HIV 1, 2 AG / AT“ (2 rinkinys) priklauso ketvirtosios kartos testai. Naudojant šių reagentų rinkinį, tiriant žmogaus kraujo serumą ar plazmą nustatomi antikūnai prieš 1, 2 ir p24 tipo antigenus. Daugelyje šalių naudojami 4 kartų ELISA testai, kurie dar vadinami Antigen / Antikūnai, sutrumpintai - AGAT.

Testavimas atliekamas anonimiškai.

apibūdinimas

Mokymai

Indikacijos

Rezultatų aiškinimas

apibūdinimas

Nustatymo metodas Su fermentais susijęs imunosorbento tyrimas (ELISA).

Studijų medžiaga Kraujo serumas

Galimas apsilankymas namuose

Kombinuotas antikūnų prieš 1 ir 2 ŽIV tipus ir ŽIV p24 antigeną nustatymas, kokybinis tyrimas.

Dėmesio. Teigiamų ir abejotinų reakcijų atveju terminas rezultato išdavimui gali būti pratęstas iki 10 darbo dienų. ŽIV (žmogaus imunodeficito virusas), sukeliantis AIDS (įgytą imunodeficito sindromą), priklauso retrovirusų šeimai. Perduodama asmeniui asmeniui naudojant užterštas adatas ir švirkštus, leidžiant į veną narkotikus ar terapines procedūras, lytinių santykių metu, tiek heteroseksualius, tiek homoseksualius. Virusas gali būti perduodamas perpilant užkrėstą kraują ir jo produktus, paaukojus organus ar spermą, o sveikatos priežiūros darbuotojams - sužeistas užkrėstomis adatomis ar instrumentais. Užsikrėsti ŽIV galima perduodant infekciją iš motinos vaikui (vertikaliu keliu), nors šiuolaikiniai prevencijos metodai, naudojant antiretrovirusinį gydymą, jei laikomasi visų rekomendacijų, gali sumažinti šią riziką iki minimumo.

Viruso sąveikos su ląstele procesas apima keletą etapų: viruso prisijungimas prie ląstelės, jos išlaisvinimas iš apvalkalo, įsiskverbimas į citoplazmą, DNR sintezė iš virusinės RNR ir virusinės DNR įterpimas į ląstelės genomą. priimančiosios ląstelės. Po to prasideda latentinė infekcijos stadija. Esant tokiai būklei, proviruojanti DNR gali egzistuoti kurį laiką, neparodydama aktyvumo ir neturėdama įtakos gyvybinei ląstelės-šeimininkės veiklai. Kol nėra viruso baltymų ekspresijos, nėra imuninio atsako į virusą. Antikūnai prieš ŽIV, apibūdinantys organizmo imuninį atsaką, atsiranda suaktyvėjus viruso DNR ir virusui pradėjus aktyviai daugintis. Latentinio laikotarpio trukmė priklauso nuo daugelio veiksnių, įskaitant individualias organizmo genetines savybes.

Antikūnai prieš ŽIV gali pasirodyti jau antrą savaitę po užsikrėtimo; jų kiekis padidėja per 2–4 savaites ir išlieka daugelį metų. 90–95% užsikrėtusių žmonių jie atsiranda per pirmuosius tris mėnesius po užsikrėtimo, 5–9% - laikotarpiu nuo trijų iki šešių mėnesių, 0,5–1% - vėliau.

Pirmosiomis infekcijos savaitėmis, dar prieš atsirandant antikūnams prieš virusą (t. Y. Prieš serokonversiją), serumo ar plazmos mėginiuose galima nustatyti ŽIV antigenų, įskaitant jo p24 kapsidės baltymą, buvimą. Vėliau, po serokonversijos, jos paprastai nebebūna galima aptikti.

Kombinuotos 4-os kartos tyrimų sistemos, įskaitant ŽIV Ag / Ab Combo testą (Architektas, Abbottas), nustato antikūnus prieš 1 ir 2 ŽIV tipus ir ŽIV p24 antigeną, kuris leidžia anksti nustatyti infekciją. Ypatingos patikros tyrimo, naudojamo laboratorijoje „INVITRO“ ŽIV infekcijai nustatyti, ypatybės yra didelis tyrimo specifiškumas (> 99,5%); 100% tyrimo jautrumas antikūnams, būdingiems serokonversijos laikotarpiui, ir tyrimo jautrumas p24 antigenui yra apie 18 pg / ml.

Laboratorinių ŽIV tyrimų tvarka yra griežtai reglamentuota Rusijos Federacijos Sveikatos apsaugos ministerijos įsakymais ir apima ŽIV antikūnų buvimo atrankinio (atrankinio) tyrimo etapą naudojant su fermentais susietą imunosorbento tyrimo (ELISA) metodus. patvirtinta naudoti, ir patikrinimo (patvirtinančio) išsamesnių tyrimų etapas miesto AIDS centro laboratorijoje. Reikėtų pažymėti, kad net geriausios ELISA patikros sistemos neužtikrina 100% specifiškumo, tai yra tam tikra tikimybė gauti nespecifinius, klaidingai teigiamus rezultatus, susijusius su paciento kraujo serumo charakteristikomis. Todėl teigiamas ELISA atrankos testo rezultatas gali būti nepatvirtintas atliekant patvirtinamuosius tyrimus, po kurių pacientui bus suteiktas neigiamas arba neapibrėžtas rezultatas. Jei patvirtinamojo tyrimo rezultatas nėra aiškus, bandymą reikia pakartoti laikui bėgant per 2–3 savaites.

Laboratorinė ŽIV infekcijos diagnostika vaikams, gimusiems ŽIV infekuotoms motinoms, turi savo ypatumus. Motinos antikūnai prieš ŽIV (IgG klasė) gali cirkuliuoti jų kraujyje iki 18 mėnesių nuo gimimo datos. Antikūnų prieš ŽIV nebuvimas naujagimiams nereiškia, kad virusas neprasiskverbė per placentos barjerą. ŽIV infekuotų motinų vaikams atliekamas laboratorinis diagnostinis tyrimas per 36 mėnesius po gimimo.

Mokymai

Specialių mokymų nereikia. Kraujo rekomenduojama imti ne anksčiau kaip praėjus 4 valandoms po paskutinio valgymo. Galima rasti bendras pasirengimo tyrimams gaires. Tyrimą, skirtą nustatyti antigeną ir antikūnus ŽIV, patartina atlikti ne anksčiau kaip po dviejų savaičių po galimos infekcijos, o neigiamų rezultatų atveju pakartoti po trijų ir šešių savaičių. Prašymų atlikti tyrimus registravimas „INVITRO LLC“ atliekamas pagal pasą arba jį pakeičiantį dokumentą (migracijos kortelė, laikina registracija gyvenamojoje vietoje, kario pažymėjimas, paso tarnybos pažyma paso pametimo atveju, registracijos kortelė nuo viešbutis). Pateiktame dokumente turi būti informacija apie laikiną ar nuolatinę registraciją Rusijos Federacijos teritorijoje ir nuotrauka. Jei nėra paso (jį pakeičiančio dokumento), pacientas turi teisę pateikti anoniminę paraišką dėl biomedžiagos pristatymo. Atlikus anoniminį tyrimą, paraiškai ir iš kliento gautam biomedžiagos mėginiui priskiriamas numeris, žinomas tik pacientui ir užsakymą padariusiam medicinos personalui. ! Anonimiškai atliktų tyrimų rezultatai negali būti teikiami hospitalizacijai, profesiniams tyrimams ir nėra registruojami ORUIB.

Paskyrimo indikacijos

• Patinę limfmazgiai daugiau nei dviejose srityse.
• Leukopenija su limfopenija.
• Naktinis prakaitavimas.
• Dramatiškas neaiškios priežasties svorio kritimas.
• Viduriavimas dėl daugiau nei trijų savaičių neaiškios priežasties.
• Karščiavimas dėl nežinomos priežasties.
• Nėštumo planavimas.
• Pasirengimas prieš operaciją, hospitalizavimas.
• Šių infekcijų ar jų derinių nustatymas: tuberkuliozė, akivaizdi toksoplazmozė, dažnai pasikartojanti herpeso viruso infekcija, vidaus organų kandidozė, pakartotinė herpes zoster neuralgija, kurią sukelia mikoplazmos, pneumocistai ar legionelių pneumonija.
• Kaposi sarkoma jaunystėje.
• Atsitiktinis seksas.

Rezultatų aiškinimas

Tyrimo rezultatų aiškinimas pateikia informaciją gydančiam gydytojui ir nėra diagnozė. Šiame skyriuje pateikta informacija negali būti naudojama savidiagnostikai ir savigydai. Tikslią diagnozę nustato gydytojas, naudodamas tiek šio tyrimo rezultatus, tiek reikalingą informaciją iš kitų šaltinių: anamnezę, kitų tyrimų rezultatus ir kt.

Nepriklausomos laboratorijos INVITRO matavimo vienetai: aukštos kokybės bandymas. Rezultatų pateikimo forma: jei nėra antikūnų prieš ŽIV 1 ir 2 bei antigeną p24, atsakymas yra neigiamas. Aptikus antikūnus ŽIV ar antigeną atliekant atrankinį imuninio tyrimo testą, serumo mėginys patvirtinamuoju imunobloto metodu siunčiamas tyrimams į miesto AIDS centrą, kuris patikrina teigiamus ir neaiškius rezultatus.

Teigiamas rezultatas:

1. ŽIV infekcija;
2. klaidingai teigiamas rezultatas, reikalaujantis pakartotinių ar papildomų tyrimų *);
3. tyrimas nėra informatyvus vaikams iki 18 mėnesių amžiaus, gimusiems ŽIV infekuotoms motinoms.

* Remiantis reagento gamintojo pateiktais vertinimais, ŽIV 1 ir 2 antikūnų bei ŽIV 1 ir 2 antigenų (ŽIV Ag / Ab Combo, Abbott) atrankos testo sistemos specifiškumas yra apie 99,6%. pacientų, kuriems galimi trukdžiai (HBV, HCV, raudonukės, HAV, EBV, HNLV-I, HTLV-II, E. coli, Chl. trach. ir kt., autoimuninės patologijos (įskaitant reumatoidinį artritą, antinuklearinių antikūnų buvimą) ), nėštumas, padidėjęs IgG, IgM kiekis, monokloninės gammopatijos, hemodializė, daugybinis kraujo perpylimas).