Русское название
Трипсин + ХимотрипсинЛатинское название веществ Трипсин + Химотрипсин
Trypsinum + Chymotrypsinum (род. Trypsini + Chymotrypsini)Фармакологическая группа веществ Трипсин + Химотрипсин
Типовая клинико-фармакологическая статья 1
Фармдействие. Протеолитическое комбинированное средство белковой природы. Получают из поджелудочной железы крупного рогатого скота. При местном и наружном применении расщепляет некротизированные ткани и фибринозные образования; разжижает вязкий секрет, экссудат, сгустки крови. Гидролизует белки и пептоны с образованием низкомолекулярных пептидов, расщепляет связи образованные остатками ароматических аминокислот (тирозин, троптофан, фенилаланин, метионин).
Показания. Нагноительные бронхолегочные заболевания (бронхоэктатическая болезнь, абсцесс легкого, ателектаз, экссудативный плеврит). Заболевания ЛОР-органов: гнойный синусит, гнойный отит (острый, подострый, хронический), евстахеит с вязким экссудатом, после трахеостомии для облегчения удаления густого вязкого экссудата, хронический ринит. Ожоги, пролежни, трофические язвы, гнойные раны. В офтальмологии: заболевания роговицы (язва, герпетический кератит); ожог слизистой оболочки глаза, непроходимость слезовыводящих протоков, вялое заживление ран кожи век.
Противопоказания. Гиперчувствительность, злокачественные новообразования, деструктивные формы туберкулеза легких, ХСН II-III ст., эмфизема легких с дыхательной недостаточностью. Нельзя вводить в кровоточащие полости, наносить на изъязвленные поверхности злокачественных опухолей.
С осторожностью. Эмпиема плевры туберкулезной этиологии (рассасывание экссудата может способствовать развитию бронхоплевральной фистулы).
Дозирование. Местно, наружно.
Для лечения гнойных ран и пролежней стерильные салфетки, смоченные раствором: 25-50 мг препарата в 10-50 мл 0,25% раствора прокаина, накладывают сроком от 2 до 24 ч (в зависимости от толщины гнойно-некротических масс) на раневую поверхность. Повязки меняются через каждые 3-5 дней.
При термических ожогах III ст. на струп наносится тонкий слой препарата из расчета 1 г на 100 кв.см раневой поверхности, покрывают повязкой, смоченной 0,9% раствором NaCl или 0,25% раствором прокаина; накладывают влагонепроницаемую повязку. Смену повязки производят через сутки. Во время каждой смены повязки удаляют легко отделяемые участки некротической ткани. При ранах, покрытых толстым струпом, перед наложением повязки его разрезают.
При нагноительных бронхолегочных заболеваниях применяют ингаляции 25-30 мг препарата, разведенного в 5 мл дистиллированной воды, 1-3 раза в день. Раствор также можно вводить через бронхоскоп, эндотрахеальный зонд, трахеостому. В раствор можно добавлять антибиотики, бронходилатирующие ЛС .
Для лечения язв, ожогов роговицы и кератитов применяют в виде глазных ванночек в растворе 1:500 ежедневно, в течение 2-3 дней или закапывают по 2 кап 0,25% раствора, 4 раза в день, в течение 1-2 дней. Непроходимость слезовыводящих протоков и раны кожи век: промывают слезовыводящие протоки или орошают раны 1% раствором. Растворы готовятся ex tempore.
При хронических ринитах закапывают или орошают раствором (5 мг в 5 мл 0,9% раствора NaCl) препарата полость носа 2-3 раза в день.
При хронических гнойных отитах, осложненных холестеатомой, после промывания полости 0,9% раствора NaCl закапывают 0,5% раствор препарата (разведенный на 0.9% растворе NaCl), 2-3 раза в день на 20-30 мин.
Побочное действие. Аллергические реакции, повышение температуры тела до субфебрильной, тахикардия.
После ингаляционного введения: раздражение слизистой оболочки верхних дыхательных путей, охриплость голоса.
В офтальмологии: раздражение и отечность конъюнктивы (в этом случае рекомендуется уменьшить концентрацию применяемого раствора).
Особые указания. В ближайшие часы после ингаляции больной должен тщательно откашливать мокроту или ее следует удалять отсосом.
ом участвует в протеолизе белков пищи в тонкой кишке Химотрипсин преимущественно расщепляет связи, образованные СООН-группами аминокислот, имеющими гидрофобные боковые цепи, и характеризуется более широкой специфичностью действия, чем . В отличие трипсина Х. створаживает молоко.
Химотрипсин вырабатывается экзокринными клетками поджелудочной железы (Поджелудочная железа) в виде неактивного профермента - химотрипсиногена, который секретируется в двенадцатиперстную кишку, где под влиянием трипсина превращается в химотрипсин. У человека и большинства млекопитающих обнаружены два вида химотрипсиногена - А и В, различающиеся по своим физико-химическим свойствам. В процессе активации химотрипсиногена А образуется несколько активных форм химотрипсина, различных по растворимости, форме кристаллов и величины ферментативной активности. Основной формой химотрипсина является химотрипсин А - белок с молекулярной массой около 25 000. максимально устойчив в слабокислой среде; в нейтральной и слабощелочной средах подвергается аутолизу. Оптимум действия Х. находится при рН 7,5-8,2.
Для определения активности Х. предложен ряд методов, основанных на расщеплении белков и синтетических субстратов. Широко используется контролируемый спектрофотометрически эфиров М-замещенного тирозина.
Активность Х. угнетается рядом синтетических и природных ингибиторов. В плазме крови и тканях присутствуют белковые ингибиторы Х., предохраняющие от разрушения этим ферментом. Многие из них поливалентны к угнетают также других протеаз (например, α 2 -макроглобулин, некоторые ингибиторы трипсина); специфическим ингибитором Х. в плазме крови является α 1 -антихимотрипсин.
Химотрипсин используется в качестве лекарственного средства, способного избирательно расщеплять белки некротизированных тканей, фиброзных образований, разжижать вязкие экссудаты, гнойные массы. Он оказывает противовоспалительное, противоотечное действие и способствует заживлению ран. Лекарственные препараты Х. получают из химотрипсиногена А, который выделяют из поджелудочной железы крупного рогатого скота и после перекристаллизации активируют трипсином. В медицинской практике применяют химотрипсин А, выпускаемый под названием «химотрипсин кристаллический». Это белого цвета, хорошо растворимый в воде и в изотоническом растворе натрия хлорида.
Показания к применению, способы применения, дозы, и возможные осложнения такие же, как у трипсина кристаллического. Кроме того, X. применяют при интракапсулярной экстракции катаракты. Вместе с трипсином Х. входит в состав химопсина, панкреатина и некоторых других препаратов, используемых при недостаточности функции поджелудочной железы.
Форма выпуска: герметически укупоренные флаконы или ампулы, содержащие по 0,005 г (5 мг ) и 0,01 г (10 мг ) кристаллического химотрипсина. Хранение в защищенном от света месте при температуре не выше +10°.
II Химотрипси́нфермент секрета поджелудочной железы, относящийся к классу гидролаз (КФ 3.4.21.1), катализирующий гидролитическое расщепление белков, пептидов, амидов и сложных эфиров аминокислот при переваривании пищи в кишечнике.
1. Малая медицинская энциклопедия. - М.: Медицинская энциклопедия. 1991-96 гг. 2. Первая медицинская помощь. - М.: Большая Российская Энциклопедия. 1994 г. 3. Энциклопедический словарь медицинских терминов. - М.: Советская энциклопедия. - 1982-1984 гг .
Синонимы :Смотреть что такое "Химотрипсин" в других словарях:
Химотрипсин … Орфографический словарь-справочник
ХИМОТРИПСИН, вещество, вырабатываемое в организме, которое способствует перевариванию пищи. Химотрипсин представляет собою энзим, который расщепляет белки. Он вырабатывается в тонком КИШЕЧНИКЕ путем сложных химических реакций из химотрипсиногена … Научно-технический энциклопедический словарь
Пищеварительный фермент сока поджелудочной железы; участвует в расщеплении белков в кишечнике. Вырабатывается в виде неактивного химотрипсиногена … Большой Энциклопедический словарь
Протеолитич. фермент большинства позвоночных, участвующий вместе с трипсином и др. пептидазами в расщеплении белков в тонком кишечнике; синтезируется клетками поджелудочной железы в форме неактивного предшественника химотрипсиногена и… … Биологический энциклопедический словарь
Сущ., кол во синонимов: 1 фермент (253) Словарь синонимов ASIS. В.Н. Тришин. 2013 … Словарь синонимов
химотрипсин - Протеолитический фермент позвоночных, синтезируется в поджелудочной железе в форме предшественника химотрипсиногена. [Арефьев В.А., Лисовенко Л.А. Англо русский толковый словарь генетических терминов 1995 407с.] Тематики генетика EN chymotripsin … Справочник технического переводчика
Пищеварительный фермент сока поджелудочной железы; участвует в расщеплении белков в кишечнике. Вырабатывается в виде неактивного химотрипсиногена. * * * ХИМОТРИПСИН ХИМОТРИПСИН, пищеварительный фермент сока поджелудочной железы; участвует в… … Энциклопедический словарь
- (гр.chymoscok + трипсин) фермент, расщепляющий белки пищи; вырабатывается клетками поджелудочной железы. Новый словарь иностранных слов. by EdwART, 2009. химотрипсин а, мн. нет, м. (… Словарь иностранных слов русского языка
Chymotripsin химотрипсин [КФ 3.4.21.1 2]. Протеолитический фермент позвоночных, синтезируется в поджелудочной железе в форме предшественника химотрипсиногена. (
Химотрипсин - протеолитический фермент; катализирует расщепление белков и пептидов. Относится к пептид-гидролазам. Вместе с трипсином участвует в протеолизе белков пищи в тонкой кишке Химотрипсин преимущественно расщепляет связи, образованные СООН-группами аминокислот, имеющими гидрофобные боковые цепи, и характеризуется более широкой специфичностью действия, чем трипсин. В отличие от трипсина Х. створаживает молоко.
Химотрипсин вырабатывается экзокринными клетками поджелудочной железы в виде неактивного профермента - химотрипсиногена, который секретируется в двенадцатиперстную кишку, где под влиянием трипсина превращается в химотрипсин. У человека и большинства млекопитающих обнаружены два вида химотрипсиногена - А и В, различающиеся по своим физико-химическим свойствам. В процессе активации химотрипсиногена А образуется несколько активных форм химотрипсина, различных по растворимости, форме кристаллов и величины ферментативной активности. Основной формой химотрипсина является химотрипсин А - белок с молекулярной массой около 25 000. Фермент максимально устойчив в слабокислой среде; в нейтральной и слабощелочной средах подвергается аутолизу. Оптимум действия Х. находится при рН 7,5-8,2.
Для определения активности Х. предложен ряд методов,
основанных на расщеплении белков и синтетических субстратов. Широко используется контролируемый спектрофотометрически гидролиз эфиров М-замещенного тирозина.Активность Х. угнетается рядом синтетических и природных ингибиторов. В плазме крови и тканях присутствуют белковые ингибиторы Х., предохраняющие белки от разрушения этим ферментом. Многие из них поливалентны к угнетают также активность других протеаз (например, a 2 -макроглобулин, некоторые ингибиторы трипсина); специфическим ингибитором Х. в плазме крови является a 1 -антихимотрипсин.
Химотрипсин используется в качестве лекарственного средства, способного избирательно расщеплять белки некротизированных тканей, ных образований, разжижать вязкие экссудаты, гнойные массы. Он оказывает противовоспалительное, противоотечное действие и способствует заживлению ран. Лекарственные препараты Х. получают из химотрипсиногена А, который выделяют из поджелудочной железы крупного рогатого скота и после перекристаллизации активируют трипсином. В медицинской практике применяют химотрипсин А, выпускаемый под названием «химотрипсин кристаллический». Это порошок белого цвета, хорошо растворимый в воде и в изотоническом растворе натрия хлорида.
Показания к применению,
способы применения, дозы, противопоказания и возможные осложнения такие же, как у трипсина кристаллического. Кроме того, X. применяют при интракапсулярной экстракции катаракты. Вместе с трипсином Х. входит в состав химопсина, панкреатина и некоторых других препаратов, используемых при недостаточности функции поджелудочной железы.Форма выпуска: герметически укупоренные флаконы или ампулы, содержащие по 0,005 г (5 мг ) и 0,01 г (10 мг ) кристаллического химотрипсина. Хранение в защищенном от света месте при температуре не выше +10°.
Химотрипсин (Chymotrypsinum) фермент
Химотрипсин (Chymotrypsinum)
Фармакологическое действие:
При местном применении расщепляет некротизированные (омертвевшие) ткани и фибринозные образования (тромбы /сгустки кропи/); разжижает вязкие секреты (отделяемое специальных желез, например, мокроту), экссудаты (выделяемую из мелких сосудов ткани богатую белком жидкость), сгустки крови.Состав:
Химотрипсин является протеолитическим ферментом, образующимся в поджелудочной железе млекопитающих. Для медицинского применения его получают из поджелудочной железы крупного рогатого скота. В соке поджелудочной железы содержится в неактивном состоянии в виде химотрепсиногена (химотрипсиноген А и В), который активируется под влиянием трипсина, причем из химотрипсиногена А образуется ряд форм: a, b, g, s и p - химотрипсины, а из химотрипсиногена В - химотрипсин В. Все формы химотрипсина близки по ферментативным свойствам, но отличаются активностью. Практическое значение в качестве лекарственного средства в настоящее время имеет a -химотрипсин, который выпускается под названием "химотрипсин кристаллический".a -Химотрипсин является белком с относительной молекулярной массой 21 600 - 27 000. Относится к группе протеолитических ферментов. Подобно трипсину гидролизует белки и пептоны с образованием относительно низкомолекулярных пептидов. От трипсина отличается тем, что расщепляет преимущественно связи, образованные остатками ароматических аминокислот (тирозин, триптофан, фенилаланин, метионин). В некоторых случаях химотрипсин производит более глубокий гидролиз белка, чем трипсин. Отличается от трипсина также тем, что вызывает свертывание молока. Более стоек, чем трипсин, и медленнее инактивируется.
Химотрипсин кристаллический представляет собой блестящие чешуйки или порошок белого цвета. Растворим в воде и в изотоническом растворе натрия хлорида; рН 0,2 % водного раствора 4,5 - 6,5. В сухом вид стоек; водные растворы быстро инактивируются, особенно при высокой температуре.
Показания к применению:
Тромбофлебиты (воспаление стенки вен с их закупоркой), воспалительно-дистрофические формы пародонтоза (заболевания зубов), остеомиелит (воспаление костного мозга и прилегающей костной ткани), гайморит (воспаление верхнечелюстной пазухи), отит (воспаление полости уха), ирит (воспаление радужной оболочки глаза), иридоциклит (заболевание глаз); трахеиты (воспаление трахеи), бронхиты (воспаление бронхов), экстракция катаракты (удаление помутневшего хрусталика глаза).Способ применения:
Внутримышечно взрослым по 0,0025 г 1 раз в день. Для инъекции растворяют непосредственно перед применением 0,005 г химотрипсина кристаллического в 1 -2 мл изотонического раствора натрия хлорида или 0,5-2% раствора новокаина. Раствор вводят глубоко в верхний наружный квадрант ягодичной мышцы. Курс -6-15 инъекций.Побочные действия:
Аллергические реакции, жжение на месте применения. Кровотечение из гранулирующих (заживающих) участков. При введении в полости возможно высвобождение веществ с гистаминоподобным действием.Противопоказания:
Кровоточащие раны и распадающиеся злокачественные опухоли. Индивидуальная непереносимость. Препарат не пригоден для внутривенного введения.Форма выпуска:
Порошок в герметически закупоренных флаконах по 0,005 г и 0,01 г.Внимание!
Перед использованием препарата Химотрипсин вы должны проконсультироваться с врачом. Данная инструкция по применению приведена в свободном переводе и предназначена исключительно для ознакомления. Для получения более полной информации просим обращаться к аннотации производителя.
Сериновые протеиназы.
Механизм действия химотрипсина и карбоксипептидазы.
Ранее уже упоминалось, что поджелудочная железа ответственна за продукцию целой группы протеолитических ферментов, гидролизующих пептидные связи, образованные разными аминокислотами. Ферменты, участвующие в переваривании белков, и их специфичность в отношении пептидных связей, образуемых разными аминокислотами, приведены в табл. 3.1. Наиболее важным и полно изученным представителем интестинальных протеиназ, относящихся к семейству сериновых протеиназ , является химотрипсин. Химотрипсин представляет собой пищеварительный фермент, синтезируемый в виде зимогена ацинарными клетками поджелудочной железы.
Таблица 3.1
Субстратная специфичность протеиназ желудочно-кишечного тракта
Активный фермент |
Зимоген |
Активатор |
Расщепляемая |
|
пептидная связь |
||||
Карбоксипротеиназы |
Автоактивация, |
|||
Пепсин А |
Пепсиноген А |
активный пепсин |
||
Сериновые |
||||
протеиназы |
||||
Трипсин |
Трипсиноген |
Энтерокиназа, |
||
Трипсин |
||||
Химотрипсин |
Химотрипсиноген |
Трипсин |
Tyr, Phe, Trp, Met |
|
Эластаза |
Проэластаза |
Трипсин |
||
пептидазы |
||||
Карбоксипептидаза А |
Прокарбоксипепти- |
Val, Leu, Ile, Ala с |
||
Карбоксипептидаза В |
Прокарбоксипепти- |
|||
Аминопептидаза |
Проаминопепти- |
Отщепление N- |
||
концевых |
||||
остатков (за |
||||
исключением Pro) |
||||
Внутри ацинарных клеток новосинтезированные молекулы белка транспортируются из эндоплазматического ретикулума в аппарат Гольджи, где они окружаются белково-липидной мембраной – так образуются зимогеновые гранулы, которые в электронном микроскопе выглядят как очень плотные тельца (рис. 3.3).
Рис. 3.3 Электронная микрофотография зимогеновых гранул в ацинарных клетках поджелудочной железы (по рисунку G. Palade из Страйер Л ., Биохимия
«Мир», М., т. 2, 1985).
Зимогеновые гранулы, содержащие химотрипсиноген, накапливаются в верхушке ацинарных клеток и затем под действием гормонального или нейронального сигнала выбрасываются в проток, ведущий в двенадцатиперстную кишку.
Химотрипсиноген представлен одной полипептидной цепью из 245 аминокислот. Цепь стабилизирована пятью дисульфидными мостиками. Активация химотрипсиногена осуществляется под действием трипсина, расщепляющего пептидную связь между аргинином-15 и изолейцином-16.
Образующийся при этом активный π -химотрипсин действует на другие молекулы химотрипсиногена (рис. 3.4).
Рис. 3.4 Схема, иллюстрирующая последовательность стадий активации химотрипсина
Далее π -химотрипсин подвергается дополнительному протеолитическому действию химотрипсина с выщеплением двух дипептидов Ser14 -Arg15 и Thr147 -Asn148 и образованием стабильной формы фермента – α - химотрипсина.
Поскольку химотрипсин является одним из наиболее полно изученных ферментов, целесообразно рассмотреть его структуру и механизм действия более детально. Молекула α -химотрипсина состоит из трех полипептидных цепей, соединенных двумя межцепочечными дисульфидными связями (рис. 3.5).
Рис. 3.5 Молекула α -химотрипсина имеет два межцепочечных дисульфидных мостика и три внутрицепочечные дисульфидные связи.
Молекулярная масса α -химотрипсина составляет около 25.000 Да. Молекула имеет компактную эллипсоидную форму размером 51× 40× 40 Å. Все заряженные группы, за исключением трех, необходимых для катализа, находятся на поверхности молекулы.
Равновесие реакции гидролиза сдвинуто практически полностью в сторону расщепления пептидных связей. Однако химотрипсин способен гидролизовать с высокой скоростью далеко не каждую пептидную связь. Он действует избирательно на связи, образованные карбоксильными группами ароматических кислот и аминокислот с гидрофобными радикалами большого размера, например метионина .
Характерной особенностью химотрипсина является его способность гидролизовать эфирные связи . По существу, значительная часть сведений о механизме действия химотрипсина была получена при изучении гидролиза
сложных эфиров.
Как было показано, химотрипсин катализирует гидролиз пептидных и эфирных связей в два отдельных этапа. Впервые это было обнаружено при изучении кинетики гидролиза сложноэфирной связи n -нитрофенилацетата.
Анализ реакции показал, что высвобождение в ходе гидролиза одного из продуктов – n -нитрофенола происходит в две стадии: сначала n - нитрофенол высвобождается взрывообразно , а затем он образуется уже с
меньшей стационарной скоростью.
В общих чертах процесс гидролиза n -нитрофенилацетата сводится к образованию фермент-субстратного комплекса, затем эфирная связь в субстрате расщепляется и n -нитрофенол высвобождается, при этом ацетильная группа субстрата остается ковалентно связанной в активном центре фермента. Далее вода атакует ацетил-ферментный комплекс с образованием ацетат-иона и регенерированного фермента (рис. 3.6)
Рис. 3.6 Ацилирование: образование комплекса ацетил-фермент в качестве промежуточного продукта. Деацилирование: гидролиз промежуточного комплекса ацетил-фермент.
Быстрая начальная фаза высвобождения n -нитрофенола связана с образованием ацил-ферментного комплекса, показанного на рис. 3.6 значком
(*). Этот этап называют ацилированием . Второй этап, называемый деацилированием , соответствует стационарной стадии реакции, являющейся одновременно лимитирующей . Ацил-ферментный комплекс оказался настолько стабильным, что в определенных условиях, его удается выделить. После того, как при pH 3 был выделен в чистом виде этот промежуточный ацил-ферментный комплекс, удалось охарактеризовать место, по которому происходит присоединение ацильной группы к ферменту. Оказалось, что ацильная группа связана с атомом кислорода специфического остатка серина
– серина-195 (Ser-195). Именно по этой причине химотрипсин относят к группе сериновых протеиназ . Этот остаток серина проявляет необычайно высокую реакционную способность. Его можно специфически пометить
органическим фторфосфатом – диизопропилфторфосфатом (рис. 3.7).
Рис. 3.7 Диизопропилфосфат (ДПФФ) инактивирует химотрипсин путем образования диизопропилфосфорильного производного серина-195.
О повышенной реакционной способности серина-195 говорит тот факт, что остальные 27 остатков серина в химотрипсине абсолютно не взаимодействуют с диизопропилфторфосфатом (ДПФФ). Кстати, химотрипсин не единственный фермент, который ингибируется ДПФФ. Многие другие протеолитические ферменты такие, как трипсин, эластаза,
тромбин, бактериальный субтилизин также специфически реагируют с ДПФФ, полностью теряя при этом активность. Как и в случае химотрипсина, данные протеиназы взаимодействуют с ДПФФ за счет одного единственного остатка серина. Таким образом, уместно говорить о существовании целого семейства сериновых протеиназ.
В каталитических актах химотрипсина, однако, принимает участие не только боковой радикал Ser-195. Было показано, что в активном центре фермента важную роль играет также остаток гистидина – His-57. Доказать его участие в катализе удалось с помощью так называемой аффинной метки , которая связывается с химотрипсином подобно субстрату с одной стороны и образует ковалентную связь с определенной группой в активном центре, с другой стороны.
Такой меткой для химотрипсина является соединение тозил-L- фенилаланинхлорметилкетон , строение которого приведено на рис. 3.8.
Рис. 3.8 Структура тозил-L-фенилаланинхлорметилкетона, используемого в качестве аффинной метки химотрипсина (R – тозильная группа).
Наличие в молекуле метки боковой цепи, представленной фенилаланином, обеспечивает ее специфическое взаимодействие с ферментом. Реакционноспособная группа метки – хлорметилкетон взаимодействует только с остатком His-57 и алкилирует один из атомов азота гистидинового кольца. Взаимодействие такой аффинной метки с химотрипсином полностью лишает его ферментативной активности. Существует несколько доказательств высокой специфичности взаимодействия метки с химотрипсином:
− во-первых, аффинная метка высоко стереоспецифична. D-изомер метки с химотрипсином не взаимодействует;
− во-вторых, конкурентный ингибитор химртрипсина – β -фенилпропионат тормозит процесс взаимодействия метки с белком;
− в-третьих, скорость инактивации химотрипсина при добавлении метки находится в такой же зависимости от pH, как скорость катализа.
Схема взаимодействия тозил-L-фенилаланинхлорметилкетона с His-57 приведена на рис. 3.9.
Рис. 3.9 Алкилирование гистидина-57 в химотрипсине при взаимодействии с тозил-L-фенилаланинхлорметилкетоном.
Таким образом, для проявления каталитической активности химотрипсина принципиальным является присутствие в активном центре фермента остатков Ser-195 и His-57. Как было показано позже, рядом с этими остатками в молекуле химотрипсина находится также остаток аспарагиновой кислоты - Asp-102. Рентгеноструктурный анализ показал, что все три остатка находятся рядом друг с другом и создают так называемую систему переноса заряда за счет того, что Asp-102 образует водородную связь с His-57, который в свою очередь соединен водородной связью с Ser195 (рис. 3.10).
Рис. 3.10 Система переноса заряда в активном центре химотрипсина в отсутствие субстрата (Blow D.M., Steitz T.A., X-ray diffraction studies of enzymes, Ann. Rev. Biochem., 1976, 39 , 86-95).
Карбоксилат-ион Asp-102 поляризует имидазольную группу His-57, что повышает его способность осуществлять челночное связывание протона, и при взаимодействии субстрата с молекулой химотрипсина Asp-102 и His-57 акцептируют протон гидроксильной группы Ser-195.
Рис. 3.11 Система переноса заряда в активном центре химотрипсина в присутствии субстрата. При добавлении субстрата происходит промежуточное связывание протона аспартатом-102 и гистидином-57 (Blow D.M., Steitz T.A., X-ray diffraction studies of enzymes, Ann. Rev. Biochem., 1976, 39 , 86-95).
Локализация сайтов специфического связывания субстрата и вероятная ориентация гидролизуемой пептидной связи были установлены в результате выполнения рентгеноструктурного анализа комплексов химотрипсина с аналогами субстрата. В частности было показано на примере изучения комплексов химотрипсина с негидролизуемым аналогом субстрата – формил-L-триптофаном существование в ферменте глубокого гидрофобного
кармана вблизи серина-195, который по размеру соответствует боковым радикалам ароматических аминокислот (рис. 3. 12).
Рис. 3.12 Схематическое изображение связывания формил-L-триптофана химотрипсином.
Именно наличием этого глубокого кармана объясняется специфичность химотрипсина в отношении аминокислот с ароматической или иной гидрофобной боковой цепью большого размера. При рентгеноструктурном анализе комплексов химотрипсина с аналогами полипептидных субстратов обнаружено большое число водородных связей между основными цепями фермента и субстрата, которые располагаются также, как в антипараллельных β -складчатых слоях.
Механизм каталитического действия химотрипсина
Интенсивные и всеобъемлющие рентгеноструктурные и биохимические исследования химотрипсина позволили прийти к определенному выводу относительно механизма его каталитического действия. Как уже упоминалось, His-57 и Ser-195 принимают непосредственное участие в расщеплении пептидной связи субстрата. Гидролиз этой связи начинается с того, что кислородный атом OH-группы Ser-195 атакует атом углерода карбонильной группы
гидролизуемой пептидной связи субстрата. В результате связь между атомами C и O в карбонильной группе становится одинарной и атом O приобретает отрицательный заряд. При этом четыре разных атома, связанные с углеродом карбонильной группы располагаются в виде тетраэдра. Образование такого тетраэдрического промежуточного соединения оказывается возможным благодаря возникновению водородных связей между отрицательно заряженным атомом кислорода (называемым оксианионом ) и двумя NH-группами основной цепи фермента (рис. 3.13).
Рис. 3.13 Тетраэдрическое промежуточное соединение в реакциях ацилирования и деацилирования химотрипсина. Стабильность промежуточного соединения обеспечивают водородные связи, образованные NHгруппами основной цепи фермента.
Этот участок химотрипсина называется полостью оксианиона . В механизме образования упомянутого промежуточного соединения важнейшую роль играет перенос протона от Ser-195 на His-57.
Рис. 3.14 Первый этап гидролиза пептидов химотрипсином – ацилирование. Образуется тетраэдрическое промежуточное соединение. Затем аминный компонент субстрата быстро отделяется от фермента, а сам фермент превращается в промежуточный продукт – ацил-фермент.
Перенос протона значительно облегчается благодаря присутствию системы переноса заряда. Остаток Asp-102 строго ориентирует положение имидазола гистидина-57 и частично нейтрализует заряд появляющийся на этом кольце. Протон, связанный парой His-Asp переходит затем к атому азота гидролизуемой пептидной связи, которая в результате разрывается. На этой стадии аминный компонент субстрата соединяется водородной связью с His-57, а кислотный компонент – эфирной (ковалентной) связью с Ser-195, завершая тем самым этап ацилирования . Таким образом, при ацилировании химотрипсина образуется промежуточное тетраэдрическое соединение (1) и, в последствии, аминный компонент субстрата (2) быстро отделяется от фермента. Сам фермент превращается в промежуточный продукт катализа – ацил-фермент (3) (рис. 3.14).
Рис. 3.15 Второй этап гидролиза пептидов химотрипсином – деацилирование. Ацил-фермент гидролизуется водой. Деацилирование по существу представляет собой реакцию, обратную ацилированию, но место аминного компонента субстрата занимает вода.
На следующей стадии – деацилирования аминный компонент диффундирует от фермента, а его место в активном центре занимает вода.
По сути дела деацилирование представляет собой процесс обратный ацилированию. Сначала система переноса заряда отрывает протон от воды.
