Se examinaron 45 niños de 3 a 15 años. El objetivo del estudio fue determinar la preparación de los linfocitos y neutrófilos de sangre periférica para la apoptosis mediante la determinación de los marcadores de apoptosis: CD95, CD95L, BSL2. Al evaluar la apoptosis de las células inmunocompetentes, se encontró una disminución en la preparación para la muerte celular programada de los linfocitos y un aumento en los granulocitos neutrófilos. Los cambios más pronunciados se registran en grupo de edad 7-15 años con más de 3 años de enfermedad. Los datos obtenidos pueden ser un signo de supresión de la muerte programada de linfocitos autorreactivos en el tejido pancreático, lo que contribuye a la prolongación de la respuesta inmune. Un aumento en la proporción de células leucocitarias que expresan CD95L puede potenciar los procesos de muerte celular programada en las células β de los islotes del páncreas infiltradas por células inmunocompetentes.
apoptosis de neutrófilos
apoptosis de linfocitos
diabetes mellitus tipo 1
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Introducción
La diabetes mellitus tipo 1 (T1DM) es una enfermedad poligénica multifactorial asociada con la formación de autoanticuerpos y linfocitos T autorreactivos contra las células β del páncreas.
La desregulación de la inmunidad y la muerte celular programada son los eslabones principales en la patogenia de las lesiones autoinmunes.
La apoptosis controlada se considera hoy en día como el principal mecanismo para mantener el equilibrio óptimo de las células en el foco de la inflamación, limitando la expansión de los clones activados y previniendo el desarrollo de reacciones autoinmunes. Cuando ocurre un defecto en su implementación, se activa células inmunes puede acumularse, dando lugar a la aparición de enfermedades autoinmunes.
Propósito del estudio: Estudio de los marcadores de activación de la apoptosis CD95, CD95L, Bsl2 en linfocitos y neutrófilos de sangre periférica en diabetes mellitus tipo 1 en niños.
Material y métodos de investigación
Se realizó una encuesta a 45 niños con diabetes mellitus tipo 1 a la edad de 3-15 años. El grupo I incluyó 20 niños de 3 a 6 años (preescolares), grupo II - 12 niños de 7 a 15 años (escolares) con una duración de la enfermedad de menos de 3 años, grupo III - 13 niños de 7 a 15 años (escolares) con más de 3 años de enfermedad. El grupo de control estaba formado por 30 niños sanos de 3 a 6 (15) y de 7 a 15 (15) años. El estudio se realizó sobre la base del departamento de endocrinología de la D.G. G.K. Filippsky, Stavropol.
Para evaluar la muerte celular programada, se determinó el número de linfocitos y granulocitos neutrofílicos que expresan marcadores de apoptosis. Se aislaron linfocitos en un gradiente de densidad Ficoll-Paque, neutrófilos en un gradiente de densidad doble Ficoll-Paque y ficoll-urografin (GE Healthcare, Suecia). La suspensión celular se lavó tres veces en medio RPMI-1640 (Vector-Best, Rusia). En cultivos de linfocitos y neutrófilos, se evaluó el número de células que expresan CD95, CD95L, Bsl2 mediante citometría de flujo utilizando anticuerpos monoclonales (Invitrogen, EE. UU.).
por análisis estadístico Los datos utilizaron el paquete de software "Primer of Biostat 4.0", Attestat 10.5.1 ". Para evaluar las diferencias intergrupales, se utilizó ANOVA de medidas repetidas con el cálculo de los criterios de Newman-Keuls y Dunn.
Los valores cuantitativos se caracterizaron por una distribución anormal y se presentaron como una mediana y un rango intercuantil (percentiles 25 y 75) (Me (Q1-Q)). Diferencias en p<0,05.
Resultados y su discusión
El estudio encontró una disminución en el número de linfocitos que expresan receptores Fas (CD95) en pacientes de todos los grupos en comparación con niños sanos (tabla 1). Los indicadores mínimos se observaron en niños de 7 a 15 años con más de 3 años de enfermedad (Tabla 1).
tabla 1
Índices de apoptosis de linfocitos en niños con diabetes mellitus tipo 1
|
Grupos clínicos |
||||
|
3-6 años |
CD1 (I) (n \u003d 20) |
17,7(15,9-19,43) * ** |
7,4(5,81- 8,94) * ** |
70,2(68,56-71,76) * ** |
|
Grupo de control |
28,0(26,08-30,0) |
9,2(8,04- 10,25) |
65,9(62,82-69,05) |
|
|
7-15 años |
20,5(17,94-23,02) * ** |
11,6(10,12-13,14) * ** |
70,3(65,72-74,9) * ** |
|
|
13,9(10,04-17,73) * ** |
15,6(14,26-16,87) * ** |
79,5(75,47-83,59) * ** |
||
|
Grupo de control |
26,5 (24,20-28,84) |
8,14 (6,49-9,78) |
60,3(56,97-63,66) |
*- pag<0,05 - по сравнению с контрольной группой, **- pag<0,05 - по сравнению с группой
Al evaluar el nivel de expresión de los marcadores antiapoptóticos (Bsl2), se encontró un aumento en los linfocitos de los niños de todos los grupos, más pronunciado en los escolares con una duración de la enfermedad de más de 3 años, lo que también indica una violación de la apoptosis dependiente de Fas en niños con diabetes mellitus tipo 1, lo que lleva a ralentizar los procesos de muerte celular de las formas autorreactivas de linfocitos.
Nuestros resultados pueden ser un signo indirecto de supresión de la muerte programada de los linfocitos activados en el tejido del páncreas, lo que contribuye a la prolongación de la respuesta inmune.
El nivel de preparación apoptótica de las células linfoides depende de la duración de la enfermedad y disminuye en los niños con experiencia de DM1 durante más de 3 años.
Anteriormente se demostró que en la diabetes mellitus se revela la resistencia de los linfocitos a la apoptosis, lo que puede explicar la naturaleza y duración de la respuesta autoinmune.
En el cultivo de linfocitos de niños con diabetes mellitus se encontró un aumento en el porcentaje de linfocitos que expresan CD95L (Tabla 1) en comparación con el grupo de niños sanos. Las tasas más altas se determinaron en niños de 7 a 15 años con más de 3 años de enfermedad (Tabla 1).
Se sabe que en la T1DM, los islotes del páncreas están infiltrados por células inmunes que producen una amplia gama de citocinas, lo que se acompaña de una expresión aberrante de los receptores de membrana. Bajo la influencia de una mayor concentración de glucosa y citocinas, las células β comienzan a expresar CD95 en su superficie, que está prácticamente ausente en condiciones normales.
Un aumento en la expresión de CD95L en células linfoides posiblemente cause un proceso apoptótico más pronunciado en las células β del páncreas y su posterior eliminación.
En los últimos años, se ha demostrado que los granulocitos neutrofílicos participan activamente en la formación de inflamación autoinmune. La reacción de los neutrófilos dirigida a la localización y eliminación de autoantígenos depende en gran medida de la fuerza y \u200b\u200bduración del efecto antigénico en el sistema inmunológico, así como del nivel inicial de actividad funcional de las células.
Hemos encontrado que el curso de la diabetes mellitus en niños se acompaña de un aumento en el porcentaje de neutrófilos que expresan marcadores de apoptosis (CD95), y una disminución en la proporción de células con proteínas anti-apoptóticas Bsl2 en su superficie (Tabla 2).
Tabla 2
Índices de apoptosis de neutrófilos en niños con diabetes mellitus tipo 1
|
grupos clínicos |
||||
|
3-6 años |
CD1 (I) (n \u003d 20) |
75,1(71,49-78,72) * ** |
9,5 (8,63- 10,32) * ** |
3,68 (3,46-3,90 * ** |
|
grupo de control |
59,2 (56,31- 62,01) |
7,35 (6,58- 8,12) |
||
|
7-15 años |
DM1, menos de 3 años de enfermedad (II) (n \u003d 12) |
77,6(71,15-83,99) * ** |
9,5(8,14-10,92) * ** |
3,99(2,9- 5,08) * ** |
|
DM1, más de 3 años de enfermedad (III) (n \u003d 13) |
87,9(84,24-91,63) * ** |
12,1(10,22-13,96) * ** |
2,78(2,36-3,19) * ** |
|
|
grupo de control |
58,43(54,95- 1,90) |
*- pag<0,05 - по сравнению с контрольной группой, **- pag<0,05 - по сравнению с группой III (prueba de Newman-Keuls, prueba de Dunn).
Con una característica intergrupal comparativa, los indicadores máximos CD95 (p<0,05) и минимальные Bsl2 (p<0,05) отмечены у детей 7-15 лет с длительностью заболевания более 3-х лет.
Se reveló un aumento en el porcentaje de leucocitos polimorfonucleares con CD95L en su superficie. Las tasas más altas se observaron en hijos de escolares con más de 3 años de enfermedad.
Los resultados del estudio de apoptosis de PMNL en diabetes mellitus presentados en la literatura son controvertidos. Existe evidencia de un aumento en la tasa de apoptosis de los neutrófilos de sangre periférica en T1DM y T2DM.
Sin embargo, varios estudios han establecido una disminución de la apoptosis de los granulocitos neutrofílicos en pacientes con diabetes tipo 1, especialmente en condiciones de hiperglucemia, que probablemente inicia los procesos de inflamación crónica con daño tisular, y también predispone a infecciones bacterianas prolongadas en pacientes con diabetes mellitus tipo 1.
Nuestros resultados sugieren que los pacientes con diabetes tipo 1 tienen una mayor susceptibilidad a la apoptosis de PMNL, que puede ser una manifestación de una reacción protectora dirigida a eliminar el "exceso" de neutrófilos activos, cuya formación aumenta el daño tisular.
El aumento del potencial apoptótico de los granulocitos neutrofílicos es un reflejo de la participación activa de PMNL en la inmunopatogénesis de la enfermedad.
Es probable que un aumento en la expresión de CD95L en granulocitos neutrofílicos en pacientes diabéticos contribuya a la eliminación no solo de las células pancreáticas, sino también de sus propias células leucocitarias.
Por lo tanto, al evaluar la apoptosis de células inmunocompetentes en niños con diabetes mellitus tipo 1, se encontró una disminución en la preparación para la muerte celular programada de linfocitos y un aumento en leucocitos polimorfonucleares.
Los cambios más pronunciados se registran en el grupo de edad de 7 a 15 años con más de 3 años de enfermedad. Los niños de todos los grupos mostraron un aumento en la proporción de células leucocitarias que expresan CD95L en su superficie.
Se sabe que los PMNL son un vínculo entre la inmunidad innata y adaptativa y juegan un papel dominante en la protección antibacteriana.
Un aumento de su actividad apoptótica puede convertirse en el motivo de la baja resistencia del niño a la edad, su susceptibilidad a las enfermedades infecciosas.
Una disminución en el número de células linfoides sensibles a la inducción de apoptosis es un signo indirecto de supresión de la muerte celular programada y eliminación alterada de formas activadas de linfocitos.
conclusiones
1. En los niños con diabetes mellitus tipo 1, hay una disminución en la preparación para la apoptosis de los linfocitos de sangre periférica, un aumento de los granulocitos neutrófilos, que se acompaña de un cambio en la expresión de CD95 y Bsl2 y depende de la duración de la enfermedad.
2. Un aumento en la expresión de CD95L en linfocitos y granulocitos neutrofílicos en T1DM puede potenciar los procesos de muerte celular programada en células β de los islotes del páncreas infiltradas por células inmunocompetentes.
Revisores:
Shchetinin E.V., Doctor en Ciencias Médicas, Profesor, Vicerrector de Trabajo Científico e Innovador de la Universidad Estatal de Medicina de Stavropol, Jefe del Departamento de HBO HPE "Universidad Estatal de Medicina de Stavropol" del Ministerio de Salud de la Federación de Rusia, Stavropol.
Golubeva M.V., Doctora en Ciencias Médicas, Profesora, Jefa del Departamento de Enfermedades Infecciosas Infantiles de la Organización Estatal Presupuestaria de Educación Profesional Superior "Universidad Estatal de Medicina de Stavropol" del Ministerio de Salud de la Federación de Rusia, Stavropol.
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A.A. Markova 1 E. I. Kashkina 1 Rubtsov V.S. 1 Lyakisheva R.V. 1
1 Universidad Médica Estatal de Saratov. Y EN. Razumovsky, Saratov
El análisis de la expresión de marcadores de apoptosis y proliferación en 61 pacientes con colitis ulcerosa, dependiendo de la duración, gravedad de la enfermedad, localización del proceso inflamatorio en el colon. El grupo de comparación estaba formado por 15 personas prácticamente sanas. El examen de los pacientes se llevó a cabo mediante métodos clínicos, de laboratorio, endoscópicos y morfológicos. La expresión de los marcadores inmunohistoquímicos Ki-67, P53, BAX y CEA se determinó en biopsias de la mucosa del colon. El estudio reveló una disminución estadísticamente significativa de la actividad proliferativa de la mucosa del colon en pacientes con colitis ulcerosa inespecífica en comparación con un grupo de individuos sanos, así como una disminución de los procesos de proliferación y un aumento de la expresión de marcadores de apoptosis con un aumento de la duración y agravamiento de la gravedad de las manifestaciones clínicas de la enfermedad.
colitis ulcerosa inespecífica
marcadores de apoptosis y proliferación
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La colitis ulcerosa (NUC) es una de las enfermedades más graves del tracto gastrointestinal, que conduce a la discapacidad y la muerte de los pacientes.
En las últimas décadas, en varios países del mundo, se ha observado un aumento de la incidencia de NUC, que, en gran medida, se asocia a una mejora en el diagnóstico de este proceso patológico.
Actualmente, se utiliza un enfoque integral en el diagnóstico de NUC, utilizando métodos de investigación de rayos X, endoscópicos e histológicos. Uno de los métodos prometedores para evaluar el estado de la membrana mucosa del intestino grueso es la inmunohistoquímica con la determinación de marcadores de proliferación y apoptosis.
Entre los métodos de estudios inmunohistoquímicos, los marcadores de apoptosis bcl y p53 han encontrado el uso más extendido. Se sabe que las proteínas de la familia bcl pertenecen a inductores de apoptosis (Bad, Bax, Bak, etc.) o a inhibidores de apoptosis (Bcl-2, Bcl-XL, BOO, etc.). Cabe señalar que la proteína p53 se detecta en muchas células transformadas. Sus funciones están dirigidas a prevenir la transferencia de información genética dañada de una generación de células a otra, incluso mediante el inicio de la apoptosis. Un alto contenido de p53 conduce a un aumento de la concentración de Bax en la célula y una disminución de la concentración de bcl-2, lo que contribuye a la muerte celular por apoptosis.
Se utilizan varios antígenos como marcadores de proliferación. El Antígeno Nuclear Celular Proliferante (PCNA) está involucrado no solo en la proliferación celular, sino también en la reparación del ADN después del daño, lo que hace que este antígeno sea condicionalmente específico del ciclo celular, ya que la reparación del ADN puede realizarse en la fase de reposo. Ki-67 es otro antígeno asociado significativamente con las fases del ciclo celular. La expresión de esta proteína ocurre durante la fase presintética, aumenta durante el ciclo celular y disminuye bruscamente durante la fase de mitosis. Esta proteína, a diferencia del PCNA, no participa en la reparación del ADN. La expresión de Ki-67 permite identificar células en todas las fases del ciclo celular, excepto en la fase de reposo.
El objetivo del estudio fue analizar la expresión de marcadores de apoptosis y proliferación en pacientes con colitis ulcerosa, en función de la duración, gravedad de la enfermedad, localización del proceso inflamatorio.
Materiales y métodos de investigación
El grupo principal estuvo formado por 61 pacientes con CU en la edad de 19 a 66 años (27 mujeres y 34 hombres), el grupo de comparación estuvo formado por 15 personas prácticamente sanas. El examen de los pacientes se llevó a cabo mediante métodos clínicos, de laboratorio, endoscópicos y morfológicos, así como con la ayuda del examen inmunohistoquímico de las biopsias de la mucosa del colon.
Los pacientes con CU se dividieron en grupos según la gravedad de las manifestaciones clínicas, la duración de la enfermedad y la localización del proceso inflamatorio.
La actividad proliferativa de las células se determinó mediante el indicador proliferativo Ki-67 según la fórmula:
dónde X - el número de núcleos en el campo de visión del microscopio. El recuento se realizó en al menos 10 campos de visión.
La apoptosis se evaluó mediante la expresión de las proteínas p53 y BAX en la superficie y el epitelio glandular del colon. Para evaluar los procesos regenerativos en la mucosa del colon en NUC, se determinó la expresión del antígeno embrionario del cáncer (CEA).
Resultados de la investigación y discusión
Un estudio inmunohistoquímico determinó la dependencia de la expresión de estos marcadores de la duración de la NUC, la gravedad de sus manifestaciones clínicas y la prevalencia del proceso inflamatorio en el colon.
Durante el procesamiento estadístico de los datos obtenidos luego de las pruebas de igualdad de varianzas y distribución normal, se comprobó que la muestra no corresponde a la ley de distribución normal, por lo que se utilizaron pruebas no paramétricas para comparar los grupos. Para describir las características cuantitativas se utilizaron la mediana, los cuartiles superior e inferior.
Así, en individuos sanos, PI Ki-67 fue 54 (46; 67), lo que indica una alta actividad proliferativa de las células del colon (tabla).
Índice de proliferación Ki-67 de células epiteliales de la mucosa del colon (%) en personas sanas y pacientes con colitis ulcerosa, según su duración, gravedad y localización
|
Grupos analizados |
Valores de Ki-67 |
Validez de las diferencias |
|
|
Grupo de comparación |
|||
|
Duración de la enfermedad |
p 0 ≤ 0,001 r 1 ≤ 0,02 p 0 ≤ 0,001 r 1 ≥ 0,05 |
||
|
La severidad del flujo medio-pesado |
p 0 ≤ 0,004 r 2 ≤ 0,05 p 0 ≤ 0,004 r 2 ≤ 0,02 |
||
|
Localización de la lesión distal zurdo total |
p 0 ≤ 0,002 r 3 ≥ 0,05 p 0 ≤ 0,002 r 3 ≥ 0,05 |
Notas:
- r 0 - confiabilidad de las diferencias con el grupo de control;
- r 1 - fiabilidad de las diferencias con la duración de la enfermedad inferior a 1 año;
- r 2 - fiabilidad de las diferencias con un curso leve de la enfermedad;
- r 3 - fiabilidad de las diferencias con la localización distal de la enfermedad.
La expresión de BAX en individuos sanos estuvo ausente en el 80% de los casos y en el 20% hubo una baja expresión del marcador. La expresión de CEA se observó en el 50% de los casos y también fue baja.
Todos los pacientes, dependiendo de la duración de la enfermedad, se dividieron en 3 grupos: 1º con CU de hasta 1 año, 2º con duración de 1 a 5 años y 3º con más de 5 años.
Como se desprende de la tabla, un aumento de PI Ki-67 en el grupo de pacientes con una duración de la enfermedad de 1 a 5 años en comparación con el grupo 1 ( r ≤ 0.02), puede explicarse por el aumento de la actividad proliferativa de las células, lo que refleja procesos reparadores en la membrana mucosa del colon. Un PI Ki-67 bajo en el grupo de pacientes con colitis ulcerosa que dura hasta 1 año, que asciende a 31 (25; 36), puede indicar una disminución pronunciada de los procesos proliferativos en la mucosa intestinal al inicio de la enfermedad.
Al estudiar el índice p53, dependiendo de la duración de la enfermedad, no se revelaron patrones de expresión de esta proteína, sin embargo, existe diferencia en la expresión de este marcador entre el grupo de individuos sanos y el grupo de pacientes con una duración de la enfermedad de 1 a 5 años ( r ≤ 0,05) y más de 5 años ( r ≤ 0,03).
La expresión de BAX se determinó tanto en el epitelio superficial como en el glandular del colon. Se encontró que la expresión de este marcador en el epitelio superficial y en el epitelio de las glándulas es prácticamente la misma en cada caso individual. La expresión de BAX en pacientes con NUC se detectó en el 100% de los casos, se encontraron diferencias estadísticamente significativas en la expresión del marcador entre el grupo de comparación y los pacientes con NUC ( r ≤ 0,01).
Al comparar la intensidad de la expresión de CEA, se observó un aumento significativo con un aumento en la duración de la enfermedad. En el grupo de comparación, la expresión de CEA se manifestó solo en casos aislados ( r ≤ 0,003).
Dependiendo de la gravedad de las manifestaciones clínicas de UCN, también se reveló un cambio en PI Ki-67 (ver tabla). PI Ki-67 disminuyó en pacientes con una forma moderada de la enfermedad ( r ≤ 0,05) y grave ( r ≤ 0,02) en comparación con los pacientes con evolución leve, también hubo una diferencia entre el grupo de individuos sanos y los pacientes con NUC de cualquier gravedad ( r ≤ 0,004).
El cambio en la expresión del marcador p53 dependió de la gravedad de la exacerbación (12,5% en leve; 35,7% en moderada y 50% en grave). Se obtuvieron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos de individuos sanos y pacientes con NUC de formas moderadas y graves de la enfermedad ( r ≤ 0,03).
BAX y CEA se expresaron en el 100% de los casos, sin embargo, no se reveló dependencia de la intensidad de expresión de estos marcadores de la gravedad de las manifestaciones clínicas de la CU. Se encontraron diferencias en la expresión de marcadores entre el grupo de comparación y los pacientes con CU, independientemente de la gravedad de las manifestaciones clínicas (p≤0,01).
Al analizar la dependencia de PI Ki-67 en la localización del proceso inflamatorio, se reveló un aumento significativo en la expresión del marcador en el grupo de pacientes con NUC en comparación con personas sanas ( r ≤ 0,002), sin embargo, en un análisis comparativo dentro del grupo principal, no se obtuvieron diferencias estadísticamente significativas entre la expresión del marcador y la diferente localización del proceso ( r ≥ 0,05).
La expresión de P53 no se detectó en todos los pacientes. En pacientes con colitis distal, se obtuvo un resultado positivo solo en el 20% de los casos, con el lado izquierdo en el 18% de los pacientes. En las lesiones intestinales totales, se detectó expresión de p53 en el 100% de los casos ( r ≤ 0,03 frente a colitis distal). Cabe señalar que la expresión fue más intensa en áreas con signos de metaplasia epitelial.
La intensidad de la expresión de BAX en el grupo con colitis total fue significativamente mayor que en la colitis distal ( r ≤ 0,03).
La expresión de CEA no dependió de la localización del proceso inflamatorio, pero fue significativamente mayor en pacientes con NUC en comparación con el grupo de comparación ( r ≤ 0,03).
En la colitis ulcerosa, la actividad proliferativa de las células epiteliales de la mucosa del colon es significativamente menor y los índices de apoptosis son más altos que en ausencia de cambios inflamatorios.
Un aumento en la duración de la colitis ulcerosa se acompaña de una baja actividad proliferativa del epitelio de la mucosa del colon, lo que puede dificultar su reparación.
Con la creciente gravedad de las manifestaciones clínicas de la colitis ulcerosa, no solo se observa una disminución en el grado de actividad proliferativa de las células del epitelio del colon, sino también un aumento en los índices de activación de la apoptosis.
Con la propagación del proceso inflamatorio al colon proximal, se reveló un aumento de la apoptosis.
Revisores:
Schwartz Yu.G., Doctor en Ciencias Médicas, Profesor, Jefe. Departamento de Terapia de la Facultad de la Universidad Médica Estatal de Saratov que lleva el nombre de V.I. Razumovsky "Ministerio de Salud y Desarrollo Social de Rusia, Saratov;
Fedorina T.A., Doctora en Ciencias Médicas, Profesora, Jefa. Departamento de Patología General y Clínica: Anatomía Patológica, Fisiología Patológica, Universidad Médica Estatal de Samara, Ministerio de Salud y Desarrollo Social de Rusia, Samara.
El trabajo fue recibido el 09.12.2011.
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CAD (ADNasa activada por caspasa) en fragmentos en múltiplos de 180-200 nucleótidos. Como resultado de la apoptosis, se produce la formación de cuerpos apoptóticos: vesículas de membrana que contienen orgánulos integrales y fragmentos de cromatina nuclear. Estos cuerpos son absorbidos por células vecinas o macrófagos como resultado de la fagocitosis. Dado que la matriz extracelular no se ve afectada por las enzimas celulares, incluso con un gran número de células apoptóticas, no se observa inflamación.
El proceso de apoptosis es necesario para la regulación fisiológica del número de células en el cuerpo, para la destrucción de células viejas, para la formación de linfocitos que no son reactivos a sus antígenos (autoantígenos), para la caída de las hojas de las plantas, para la acción citotóxica de los linfocitos T asesinos, para el desarrollo embrionario del organismo ( la desaparición de las membranas cutáneas entre los dedos en embriones de aves) y otros.
La alteración de la apoptosis celular normal conduce a una proliferación celular descontrolada y a la aparición de un tumor.
1. La importancia de la apoptosis
La apoptosis es una parte integral de la vida de la mayoría de los organismos multicelulares. Desempeña un papel especialmente importante en los procesos de desarrollo. Por ejemplo, las extremidades de los tetrápodos se colocan espatuladas para crecer, y la formación de dedos se produce debido a la muerte de las células entre ellos. Además, ya no se requiere que las células experimenten apoptosis, por lo que, en particular, la cola de los renacuajos se destruye durante la metamorfosis. En el tejido nervioso de los vertebrados durante el desarrollo embrionario, más de la mitad de las neuronas mueren por apoptosis inmediatamente después de su formación.
Además, la apoptosis es parte del sistema para controlar la "calidad" de las células, le permite destruir aquellas que están ubicadas incorrectamente, dañadas, disfuncionales o potencialmente peligrosas para el cuerpo. Un ejemplo son los linfocitos B, que mueren si no portan receptores específicos de antígeno útiles o son autorreactivos. Por apoptosis, la mayoría de los linfocitos también mueren durante una infección tras otra.
En organismos adultos, la regulación simultánea de la proliferación celular y la apoptosis permite mantener el tamaño de todo el individuo y sus órganos individuales. Por ejemplo, después de la implantación del fármaco fenobarbital, que estimula la proliferación de hepatocitos, aumenta el hígado en ratas. Sin embargo, inmediatamente después del cese de la acción de esta sustancia, todas las células en exceso están sujetas a apoptosis, como resultado de lo cual el tamaño del hígado vuelve a la normalidad.
La apoptosis también ocurre cuando una célula "detecta" una gran cantidad de daño interno que no puede reparar. Por ejemplo, en caso de daño en el ADN, una célula puede transformarse en una célula cancerosa, para que esto no suceda, en condiciones normales, "se suicida". Además, una gran cantidad de células infectadas con virus mueren por apoptosis.
2. Marcadores de células apoptóticas
Marcadores de apoptosis
Detección de fragmentación de ADN en células apoptóticas mediante el método TUNEL Una preparación de tejido de hígado de ratón, el núcleo de las células apoptóticas tiene un color marrón, microscopía óptica.
Detección de fragmentación de ADN en células apoptóticas mediante electroforesis en gel de agarosa. Izquierda: ADN aislado de células apoptóticas - se ve la "escalera de ADN"; medio: marcadores; caso: una muestra de ADN de control de células no tratadas. Línea celular H4IIE (hepatoma de rata), inductor de apoptosis - paraquat, visualización con bromuro de etidio.
Arriba: Detección de condensación y fragmentación de la cromatina mediante tinción con un colorante fluorescente (Hoechst 34580). Medio: detección de la translocación de fosfadidilserina en la hoja externa del plasmalema mediante tinción con anexina V. Abajo: Microfotografía de células apoptóticas en un campo brillante. Línea celular - Jurkat, inductor de apoptosis - TRAIL, confocal y microscopía óptica svitlopilna.
Las células que mueren por apoptosis pueden reconocerse por una serie de características morfológicas. Se vuelven más pequeños y más densos (picnosis), se redondean y pierden pseudópodos, el citoesqueleto se destruye en ellos, la membrana nuclear se desintegra, la cromatina se condensa y fragmenta. Aparece una gran cantidad de burbujas en la superficie de las células, si las células son lo suficientemente grandes, se desintegran en fragmentos rodeados de membranas: cuerpos apoptóticos.
En las células apoptóticas, además de las morfológicas, también se producen una gran cantidad de cambios bioquímicos. En particular, el ADN se corta con nucleasas especiales en las regiones de enlace entre los nucleosomas en fragmentos de igual longitud. Por lo tanto, al separar todo el ADN de una célula apoptótica mediante electroforesis, se puede observar una "escalera" característica. Otro método para detectar la fragmentación del ADN es marcar sus extremos libres utilizando el TUNEL ( T erminal desoxinucleotidil transferasa d U TP norte ick mi Dakota del Norte l abeling ) .
La membrana plasmática de las células apoptóticas también sufre cambios. En condiciones normales, el fosfolípido fosfatidilserina cargado negativamente está contenido sólo en su capa interna (devuelta al citosol), pero durante la apoptosis "salta" a la capa externa. Esta molécula sirve como señal de "cómeme" para los fagocitos cercanos. La captación de células apoptóticas inducida por fosfatidilserina, a diferencia de otros tipos de fagocitosis, no conduce a la liberación de mediadores inflamatorios. El cambio descrito en el plasmalema subyace a otro método para detectar células que mueren por apoptosis: la tinción con anexina V, que se une específicamente a la fosfatidilserina.
3. Caspasa: mediadores de la apoptosis
Los sistemas celulares que proporcionan el paso de la apoptosis son similares en todos los animales; la familia de proteínas de las caspasas ocupa el lugar central en ellos. Las caspasas son proteasas que tienen un residuo de cisteína en el centro activo y cortan sus sustratos en un residuo de ácido aspártico específico (de ahí el nombre: c desde cisteína y áspid desde ácido aspártico ). Las caspasas se sintetizan en la célula en forma de procaspasas inactivas, que pueden convertirse en sustratos para otras caspasas ya activadas, que las cortan en uno o dos lugares en el residuo de aspartato. Dos fragmentos formados, el más grande y el más pequeño, están conectados entre sí, formando un dímero, que está asociado con el mismo atenuador. El tetrámero formado de esta manera es una proteasa activa que puede cortar las proteínas del sustrato. Además de las regiones correspondientes a las subunidades más grandes y más pequeñas, las procaspasas a veces también contienen prodominios inhibidores, que se degradan después de la escisión.
Como resultado de la escisión y activación de unas caspasas por otras, se forma una cascada protealítica que potencia significativamente la señal y hace que la apoptosis a partir de un momento determinado sea un proceso irreversible. Las procaspasas que inician esta cascada se denominan iniciadoras y sus sustratos efectores. Después de la activación, las caspasas efectoras pueden escindir otras procaspasas efectoras o proteínas diana. Las dianas de las caspasas efectoras, que se destruyen durante la apoptosis, incluyen, en particular, las proteínas de la lámina nuclear, cuya escisión conduce a la ruptura de esta estructura. También degrada la proteína; en condiciones normales, suprime las endonucleasas CAD, como resultado de lo cual comienza la fragmentación del ADN. Las caspasas y proteínas del citoesqueleto y la adhesión intercelular se escinden, como resultado de lo cual las células apoptóticas se redondean y se desprenden de las células adyacentes y, por lo tanto, se convierten en un blanco más fácil para los fagocitos.
El conjunto de caspasas necesarias para la apoptosis depende del tipo de tejido y de la vía por la que se activa la muerte celular. Por ejemplo, en ratones, cuando se apaga el gen que codifica las caspasas-3 efectoras, la apoptosis no ocurre en el cerebro, pero normalmente ocurre en otros tejidos.
Los genes de la procaspasa están activos en las células sanas y, por lo tanto, las proteínas están constantemente presentes para la apoptosis, solo se necesita su activación para desencadenar el suicidio celular. Las procaspasas del iniciador incluyen un prodominio largo que contiene CARD ( dominio de reclutamiento caspase , Dominio de atracción de caspasas). CARD permite que las procaspasas iniciadoras se unan a proteínas adaptadoras para formar complejos de activación cuando la célula recibe una señal que estimula la apoptosis. En los complejos de activación, varias moléculas de procaspasas se encuentran directamente próximas entre sí, lo que es suficiente para su transición a un estado activo, después de lo cual se cortan entre sí.
Dos vías de señalización mejor entendidas para la activación de la cascada de caspasa en células de mamíferos se denominan externa e interna (mitocondrial), cada una de las cuales usa su propio iniciador procaspasa.
4. Formas de activación de la apoptosis.
4.1. Camino externo
La célula puede recibir una señal que induce la apoptosis desde el exterior, por ejemplo, de linfocitos citotóxicos. En este caso, se activa la llamada ruta externa ( vía extrínseca ), Comenzando con los receptores de muerte. Los receptores de muerte son proteínas transmembrana que pertenecen a la familia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF), como el propio receptor de TNF y el receptor de muerte Fas. Forman homotrímeros, en los que cada monómero tiene un dominio de unión a ligando extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de muerte citoplasmática; a través de proteínas adaptadoras, atrae y activa las procaspasas.
Los ligandos del receptor de muerte también son homotrímeros. Están relacionados entre sí y pertenecen a la familia de moléculas de señalización del factor de necrosis tumoral. Por ejemplo, los linfocitos citotóxicos llevan ligandos Fas en su superficie, que pueden unirse a los receptores de muerte Fas en el plasmalema de las células diana. En este caso, los dominios intracelulares de estos receptores se combinan con una proteína adaptadora ( FADD, dominio de muerte asociado a Fas ), Y estos, a su vez, atraen por parte del iniciador las procaspasas 8 y / o 10. Como resultado de esta serie de eventos, un complejo de señalización que induce la muerte, DISC ( complejo de señalización inductor de muerte ). Después de la activación en este complejo por las caspasas iniciadoras, las procaspasas efectoras se cortan y se desencadena la cascada apoptótica.
Muchas células sintetizan moléculas y, hasta cierto punto, las protegen de la activación de la vía externa de la apoptosis. Un ejemplo de tal protección puede ser la expresión de los llamados receptores señuelo ( receptores señuelo ), Que tienen dominios extracelulares de unión a ligando, pero no dominios citoplásmicos de esmetri, y por lo tanto no pueden desencadenar la apoptosis y competir con los receptores de muerte convencionales por ligandos. Las células también pueden producir proteínas que bloquean la vía externa de la apoptosis, por ejemplo, FLIP, que es similar en estructura a las procaspasas 8 y 10, pero no tiene actividad protealítica. Inhibe la unión de las procaspasas iniciadoras al complejo DISC.
4.2. Camino interior
Apoptosoma
La apoptosis también puede desencadenarse desde el interior de la célula, por ejemplo, en el caso de lesión, daño del ADN, falta de oxígeno, nutrientes o señales de supervivencia extracelular. En los vertebrados, esta vía de señalización se llama interna ( camino intrínseco ) O mitocondrial, el evento clave es la liberación de ciertas moléculas del espacio intermembrana de las mitocondrias. Para tales moléculas de la plántula, existe el citcromo c, para que las mentes malvadas entren en la lanza de transporte de electrones de las mitocondrias, la protea del citoplasma tiene su propia función: llegar al adaptador Apaf ( factor activador de proteasa apoptótica l ), Lo que hace que se oligomerice en una estructura en forma de rueda de siete miembros llamada apoptosoma. El apoptosoma atrae y activa el iniciador procaspasa-9, que luego puede activar el iniciador procaspasa.
En algunas células, la vía externa de la apoptosis debe activar la vía interna para destruir eficazmente la célula. La vía interna está estrictamente regulada por proteínas de la familia Bcl-2.
4.2.1. Regulación de la vía interna por proteínas de la familia Bcl-2
La familia Bcl-2 incluye proteínas conservadas evolutivamente, cuya función principal es regular la liberación del citocromo cy otras moléculas del espacio de la membrana mitocondrial. Entre ellos se encuentran moléculas proapoptóticas y antiapoptóticas que pueden interactuar entre sí en diversas combinaciones, suprimiendo entre sí, el equilibrio entre su actividad y determinar el destino de la célula.
Actualmente se conocen alrededor de 20 proteínas de esta familia, todas las cuales contienen al menos uno de los cuatro dominios alfa helicoidales de homología de Bcl2, llamado BH1-4 ( homología bcl2 ). Las proteínas antiapópticas de la familia Bcl2 contienen los cuatro dominios, incluido el propio Bcl-2, así como Bcl-X L, Bcl-w, Mcl-1 y A1. Las proteínas proapoptóticas se dividen en dos grupos, los miembros del primero de los cuales contienen tres dominios BH (BH1-3), en particular Bak, Bax y Bok (el último se expresa solo en tejidos de órganos reproductores). El más numeroso entre la familia Bcl-2 es el segundo grupo de proteínas proapoptóticas que contienen solo el dominio BH3 (solo BH3); este grupo incluye Bim, Bid, Bad, Bik / Nbk, Bmf, Nix / BNIP3, Hrk, Noxa, Puma.
En condiciones normales (es decir, cuando la célula no sufre apoptosis), las proteínas antiapoptóticas como Bcl-2 y Bcl-X L se unen a las proteínas proapoptóticas BH123 (Bax y Bak) y evitan que se polimericen en la membrana mitocondrial externa formando poros. Como resultado de la acción de un cierto estímulo apoptótico en la célula, se activan o sintetizan proteínas proapoptóticas que contienen solo el dominio BH3. Estas, a su vez, inhiben las proteínas antiapoptóticas, eliminando el efecto inhibidor sobre Bak y Bax, o interactúan directamente con estas últimas y promueven su oligomerización y formación de poros. Debido a la permeabilización de la membrana externa, el citocromo c ingresa al citosol, así como otros mediadores de la apoptosis, como el AIF (ing. factor inductor de apoptosis ).
Por ejemplo, la falta de señales de supervivencia en la célula mediadas por MAP-quinasa JNK activa la expresión de la proteína BH3 Bim, que desencadena la vía interna de la apoptosis. En el caso del daño del ADN, se produce la acumulación del supresor tumoral p53, que estimula la transcripción de genes que codifican las proteínas BH3 Puma y Noxa, que también facilitan el paso de la apoptosis. Otra proteína BH3, Bid, proporciona un vínculo entre las vías externas e internas de la apoptosis. Después de la activación de los receptores de muerte y, como consecuencia, la caspasa-8, esta última corta Bid con la formación de una forma truncada de tBid (Bid truncada), que se desplaza hacia la mitocondria, donde suprime Bcl-2.
La división celular en general es un proceso bastante monótono llamado ciclo celular. Contiene una gran cantidad de "puntos de control" en los que se controla la transición de la celda de una fase del ciclo a otra. La destrucción de uno o más "puntos de control" puede conducir tanto a una proliferación incontrolada como a la muerte celular, en particular, a la apoptosis. El cuadro morfológico de la apoptosis con todos los rasgos característicos (cromatólisis, ausencia de respuesta inflamatoria, canibalismo celular, etc.) fue descrito por L. Graper y denominado "eliminación celular fisiológica". En 1971 J. Kerr propuso el término "apoptosis" (del latín aro - con, ptosis - caer) por analogía con las hojas que caen de un árbol aquí y allá. Durante la apoptosis, se distinguen tres fases: temprana (disminución del tamaño celular, fragmentación del ADN en fragmentos grandes), intermedia (fragmentación adicional del ADN) y tardía (cuerpos apoptóticos). La apoptosis juega un papel importante en el desarrollo de la placenta humana. Con el transcurso del embarazo, hay un aumento de los cambios apoptóticos en la placenta que funciona normalmente.
Tertemiz y col.
en su trabajo demostraron que la apoptosis está involucrada en los mecanismos de regulación fisiológica de la vasculogénesis placentaria. La basculogénesis placentaria comienza el día 21 del embarazo e incluye la aparición de hemangioblastos e islotes de células angiogénicas. La vasculogénesis de la placenta se estudió utilizando métodos histológicos (preparaciones teñidas con hematoxilina y eosina), inmunohistoquímicos (detección de CD31), genéticos moleculares (CD31-TUNEL - marcaje de extremos de muesca de X-dUTP mediado por TdT) y microscopía electrónica de transmisión. El estudio mostró que no hay células CD31 positivas en islotes de células angiogénicas. Sin embargo, se detectó expresión de CD31 en células de capilares primitivos y en varias células estromales ubicadas entre regiones vasculogénicas. El examen morfológico de las preparaciones teñidas con hematoxilina y eosina reveló signos de apoptosis en estas células: cariopycnosis y cuerpos apoptóticos. La gravedad de la apoptosis y vasculogénesis en la placenta fue directamente proporcional.
El nivel de apoptosis está elevado en los trastornos del embarazo, como la interrupción temprana del embarazo, el embarazo ectópico, la preeclampsia.
La proliferación y diferenciación de citotrofoblastos y el desarrollo de vasos en el estroma de las vellosidades requieren un aporte adecuado de oxígeno y nutrientes del espacio intervelloso. Entre las complicaciones del embarazo, el retraso del crecimiento intrauterino es una de las principales causas de mortalidad perinatal. La alteración de la regulación de la apoptosis conduce a una disminución del número de células sincitiotrofoblasto, lo que conlleva una disminución en el suministro de nutrientes al feto y un retraso en el desarrollo intrauterino del feto. Levy y col. asociar el retraso del crecimiento intrauterino con la preeclampsia y el tabaquismo, condiciones que conducen a la falta de oxígeno en el tejido de la placenta. S. Y. Dai y col. Se estudiaron las placentas de mujeres sin malos hábitos y preeclampsia, pero que presentaban retraso en el desarrollo fetal. Los autores sugirieron que los cambios apoptóticos en las células placentarias en condiciones de falta de oxígeno pueden ser regulados por factores que se activan bajo hipoxia (factor inducible por hipoxia) - HIF-la, HIF-2a, HIF-1 p.
HIF-1 es el factor principal en la adaptación de las células a la hipoxia.
Puede alterar la expresión de varios genes responsables de la eritropoyesis, la glucólisis y la angiogénesis. Mientras que el heterodímero HIF-lp se detecta en todas las células de la placenta bajo cualquier condición, HIF-la se detecta solo durante la hipoxia. Con menos frecuencia, en condiciones de falta de oxígeno, HIF-2a, también conocido como EPAS-1, se detecta en las células. Los ARNm de HIF-la y -2a se detectan en la placenta durante todo el embarazo, pero su nivel varía significativamente según la edad gestacional. Si el nivel de ARNm de HIF-la permanece constante, entonces el nivel de ARNm de HIF-2a aumenta con el curso del embarazo. A diferencia de HIF-la, HIF-2a se expresa principalmente en células endoteliales, desempeñando un papel importante en la angiogénesis y la hematopoyesis. En la placenta humana, la expresión de HIF-la y HIF-2a se expresa al máximo en las primeras etapas, lo que asegura la resistencia de las células a la hipoxia fisiológica que se produce durante este período del embarazo. Además, se observó una mayor expresión de estos factores en la preeclampsia.
La consecuencia del efecto estimulante de estos factores sobre la apoptosis es el retraso en el desarrollo intrauterino del feto.
Así, en un estudio de S. Y. Dai et al. el índice de apoptosis en el sincitiotrofoblasto de las vellosidades fue de 1,45 + 1,26% en el grupo con retraso del crecimiento intrauterino y de 0,18 ± 0,16 en el grupo control, donde no se observó retraso del crecimiento fetal intrauterino (p
Al mismo tiempo, los infartos detectados macroscópicamente fueron significativamente más frecuentes en las placentas del grupo con retraso del crecimiento intrauterino (50%) que en el grupo de control (22%). El grado de depósito de fibrinoide en el espacio intervelloso también fue ligeramente mayor en el grupo con retraso del crecimiento intrauterino. La actividad mitótica de los elementos del trofoblasto y las células sanguíneas y vasculares a las 6 y 12-14 semanas de gestación fue estudiada por Challier et al. Los autores observaron a las 6 semanas de gestación la presencia de figuras mitóticas y la presencia de núcleos positivos para Kd67 en células de citotrofoblasto y eritroblastos. En el citotrofoblasto de las vellosidades, el número de núcleos positivos para Ki67 disminuyó a las 12-14 semanas de gestación, permaneciendo solo en los islotes de células del citotrofoblasto extravelloso. Ki67 ya no se detecta en eritroblastos en este período. En las células endoteliales a las 6 semanas de gestación, las figuras mitóticas y la expresión de Ki67 estaban ausentes; a las 12-14 semanas de gestación se detectó lectina UEA1. La ausencia de figuras mitóticas y expresión de Ki67 en células endoteliales y perivasculares a las 6 semanas de gestación indica una dependencia directa de la vasculogénesis de las células estromales, y en mayor medida que del trofoblasto.
El control del ciclo celular de las células eucariotas se lleva a cabo mediante una familia de quinasas, en particular, quinasas dependientes de ciclina. Desde el primer trimestre del embarazo en los núcleos del citotrofoblasto y el endotelio de los vasos adyacentes, se detecta ciclina D1, cuya expresión aumenta progresivamente hacia el tercer trimestre del embarazo. La CDK4 se detecta en los núcleos de citotrofoblasto tanto en el primer como en el tercer trimestre del embarazo, mientras que las células endoteliales COK4 positivas se observan sólo al final del tercer trimestre. Esto sugiere que el complejo D1 / CDK4 participa en la regulación de la proliferación de células de citotrofoblasto durante el embarazo y en el control de la angiogénesis en el tercer trimestre del embarazo. Los trastornos del equilibrio endocrino, inmunológico, la acumulación de radicales libres conducen a un aumento de la apoptosis en los tejidos de la placenta. Entonces, con la preeclampsia, la diferenciación de citotrofoblasto y el proceso de su invasión al útero se interrumpen, lo que se debe en gran parte a la apoptosis. Se sabe que la apoptosis es mucho más común en la placenta madura durante el embarazo, complicada por el retraso del crecimiento fetal, y la proteína p53 juega el papel principal en la regulación de este proceso, y la proteína Bcl-2 no participa en ella. Numerosos estudios indican una sobreexpresión de p53 y, en consecuencia, un aumento de células apoptóticas en el citotrofoblasto en el carcinoma coriónico y la deriva quística.
