Algoritmo para la realización de investigaciones bacteriológicas. Método bacteriológico para el diagnóstico de enfermedades infecciosas. Características del análisis.

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Estudios bacteriológicos

Investigación bacteriológica- destinado al aislamiento de bacterias y al estudio de sus propiedades para realizar un diagnóstico microbiológico.
El material de prueba debe recogerse en condiciones asépticas en recipientes estériles y entregarse al laboratorio lo antes posible. Si es necesario, las muestras deben almacenarse refrigeradas. La técnica de muestreo depende del objeto, la naturaleza de la enfermedad y las propiedades del microorganismo. Uno de los métodos comunes de investigación bacteriológica es la bacterioscopia.
Para estudiar las bacterias no fijadas, se utilizan dos métodos: una gota triturada (entre el portaobjetos y el cubreobjetos) y una gota colgante. Debe recordarse que las preparaciones de bacterias no fijadas son infecciosas.
Los elementos más importantes de la investigación bacteriológica incluyen la inoculación y el subcultivo de cultivos bacterianos realizados con un asa bacteriana o una pipeta Pasteur. El asa se esteriliza recociendo en una llama, luego se enfría tocando un área de agar sin inocular o enjuagando con un líquido estéril. Cuando utilice una pipeta Pasteur, rompa la punta con unas pinzas, pase la pipeta por la llama del quemador varias veces y déjela enfriar. Al sembrar se utilizan medios nutritivos líquidos y sólidos. Cuando se siembra en agar inclinado, el cultivo bacteriano se frota con un asa sobre la superficie del agar. Al sembrar en el espesor de una columna de agar o gelatina, el medio nutritivo se perfora hasta el fondo del tubo con un bucle o una aguja especial. Al sembrar en medio líquido se debe tener cuidado de que el líquido no se derrame y moje los bordes de los tubos y tapones. Las inoculaciones y subcultivos deben realizarse cerca de la llama de un quemador de gas, los tubos de ensayo no deben permanecer abiertos por mucho tiempo, el asa o la pipeta Pasteur con el cultivo no deben tocar nada; Antes de cerrar el tubo de ensayo, se deben quemar los bordes. Los tubos inoculados deben etiquetarse inmediatamente.

Los métodos de investigación microbiológica se dividen en métodos para la detección directa de patógenos en el cuerpo del paciente: estudios bacterioscópicos y bacteriológicos; métodos de evidencia indirecta de la presencia de un patógeno en el cuerpo del paciente: estudios serológicos destinados a detectar antígenos específicos en material infectado o anticuerpos en el suero sanguíneo y diversas secreciones del cuerpo del paciente.
El examen bacterioscópico de sangre, orina, líquido cefalorraquídeo, moco de la garganta y la nariz, heces y diversos sustratos patológicos para detectar la presencia de un patógeno se utiliza para muchas enfermedades infecciosas. Este método tiene aplicaciones bastante limitadas, aunque es muy importante. Se utiliza, en particular, para detectar en la sangre patógenos de la malaria, la fiebre recurrente y la leptospirosis. El líquido cefalorraquídeo se examina en busca de meningitis purulenta y tuberculosa, moco de la garganta y la nariz, para difteria, angina de Vincent, heces, para amebiasis, balantidiasis, giardiasis; orina - para leptospirosis. Los bacilos de la peste y el ántrax se pueden observar en el punteado del bubón de la peste y en las huellas tomadas del ántrax; la microscopía de un frotis puntiforme de la médula ósea y el bazo, las granulaciones de una úlcera pueden detectar leishmania; en esputo - Mycobacterium tuberculosis. La ventaja del método bacterioscópico es su rapidez. Los resultados del análisis se pueden obtener en unas pocas horas. En algunas enfermedades (malaria, meningitis cerebroespinal epidémica, etc.), los patógenos pueden detectarse en el cuerpo del paciente ya en el primer día de la enfermedad, lo cual es muy importante para el diagnóstico y tratamiento oportunos. Las posibilidades del diagnóstico bacterioscópico se han ampliado significativamente debido al tratamiento de preparaciones con sueros específicos que contienen anticuerpos contra un patógeno determinado, marcados con fluorocromos (método de inmunofluorescencia) o enzimas (método de inmunoensayo enzimático). En este caso, los anticuerpos marcados se combinan con un antígeno, que se detecta mediante el método inmunofluorescente bajo un microscopio fluorescente, y mediante el método de inmunoensayo enzimático, tiñendo el producto de reacción enzimática después de la introducción de una mezcla de sustrato e indicador.
El método de diagnóstico bacteriológico se basa en el aislamiento del patógeno de la sangre, líquido cefalorraquídeo, esputo, moco de garganta y nariz, heces, orina, bilis del paciente y, en caso de muerte, de trozos de órganos que se inoculan. en medios nutritivos especiales. Los diagnósticos bacteriológicos se utilizan ampliamente para estudiar la mucosidad de la garganta y la nariz en busca de bacterias de la difteria, para aislar patógenos de infecciones intestinales (por ejemplo, cólera, disentería, salmonelosis, escherichiosis) de las heces del paciente, patógenos de neumonía del esputo y, en otros casos. . En este caso, se tienen en cuenta las características de la infección sospechada, el lugar de localización selectiva del patógeno y las rutas de su liberación al medio ambiente. El estudio da resultados positivos ya en las primeras horas o días de la enfermedad. Sin embargo, el laboratorio informa la respuesta final para la mayoría de las enfermedades infecciosas solo después de 2 a 4 días, y para la brucelosis y la tuberculosis, después de 3 a 4 semanas. Esto depende del tiempo necesario para el crecimiento de los microorganismos y su identificación (bioquímica y serológica). Cada microbio requiere un medio nutritivo apropiado para su crecimiento. Dependiendo del microbio que se vaya a aislar (que se determina durante el examen clínico y epidemiológico del paciente), se selecciona el medio nutritivo adecuado. En ocasiones, la siembra se realiza simultáneamente en varios medios nutritivos. El valor de los resultados de los estudios bacteriológicos está determinado en gran medida por si el material se extrae correctamente del paciente y si se entrega correctamente al laboratorio. El material infeccioso se recoge en recipientes esterilizados, observando reglas de asepsia.

La etapa más importante de la investigación bacteriológica es la identificación.- determinación de la especie o tipo de bacteria obtenida en forma de cultivo puro. Al identificar bacterias, se estudian sus propiedades fisiológicas y bioquímicas y la formación de toxinas. Los métodos serológicos para identificar bacterias se utilizan ampliamente. En muchos casos resulta eficaz un método biológico para identificar microorganismos, basado en infectar animales de laboratorio con el material en estudio o el cultivo bacteriano resultante e identificar cambios patológicos característicos en los animales.
Se utilizan métodos mecánicos y biológicos para aislar cultivos puros. Un ejemplo de método mecánico: se muele una gota del material de prueba con la misma espátula estéril o asa bacteriana sobre la superficie de un medio nutritivo denso, secuencialmente en la primera, segunda y tercera placas de Petri. El aislamiento de un cultivo puro se realiza a partir de colonias individuales cultivadas y consiste en su examen y detección en un medio nutritivo fresco. Los métodos biológicos para aislar cultivos puros se basan en tener en cuenta una u otra propiedad del microbio aislado, que lo distingue de otros microbios que se encuentran en el material en estudio.
El método biológico utiliza este tipo de medios nutritivos en los que se crean las condiciones favorables para el desarrollo de un determinado tipo de microbio. Los métodos biológicos también incluyen la infección de animales de laboratorio que son sensibles a las especies aisladas de bacterias.
La investigación bacteriológica es un conjunto de métodos para identificar microorganismos patógenos en un paciente, un portador o en objetos ambientales.

Aislamiento de cultura pura;

Se introducen cada vez más en la práctica métodos de investigación bacteriológica para realizar un examen más detallado de los pacientes, establecer el factor etiológico del proceso inflamatorio, prescribir una terapia racional y determinar su eficacia.

La diversidad del material clínico y la singularidad de la microflora de los órganos individuales determinan las características de los métodos de investigación bacteriológica, que requieren el uso de técnicas especiales de muestreo, inoculación en medios nutritivos y análisis.

El examen bacteriológico del material clínico consta de varias etapas:

Muestreo para investigación;

Siembra en medios nutritivos;

Aislamiento de cultura pura;

Identificación y diferenciación de cultivos de microorganismos aislados;

Análisis de los resultados de la investigación.

Durante el examen bacteriológico, la llamada siembra del material recolectado del paciente se lleva a cabo en medios nutritivos, lo que promueve el crecimiento y la reproducción del agente causante de la enfermedad. Durante el estudio, es posible identificar no solo el hecho de la presencia, sino también la concentración de microorganismos patógenos en un biomaterial en particular.
El método de examen bacteriológico examina el esputo, el líquido cefalorraquídeo, la sangre, así como la secreción de los genitales, la cavidad bucal, la faringe y las heridas del paciente. Por tanto, se pueden sembrar microorganismos de casi cualquier parte del cuerpo humano.
La técnica de cultivo bacteriológico es sumamente conveniente y eficaz para detectar y determinar el tipo de bacterias y hongos. La detección de virus presenta cierta dificultad debido a las peculiaridades de su biología.
El examen bacteriológico (cultivo) es de gran importancia no solo para determinar el tipo específico de microorganismo, sino también para establecer el grado de sensibilidad de un antibiótico en particular. De este modo, se determina la eficacia máxima de un tipo particular de terapia con antibióticos.
Al realizar un análisis, es importante recordar que algunos microorganismos, como los neumococos, mueren con bastante rapidez porque tienen una mayor tendencia a autodestruirse. Por tanto, los cultivos deben realizarse en poco tiempo.

El principal método de diagnóstico microbiológico y el "estándar de oro" de la microbiología es el método bacteriológico.

El propósito del método bacteriológico. Consiste en aislar un cultivo puro del patógeno del material de prueba, acumular un cultivo puro e identificar este cultivo por un conjunto de propiedades: morfológicas, tintoriales, culturales, bioquímicas, antigénicas, por la presencia de factores de patogenicidad, toxigenicidad y determinando su sensibilidad. a fármacos antimicrobianos y bacteriófagos.

El método de investigación bacteriológica incluye:

1. inoculación del material de prueba en medios nutritivos

2. aislamiento de la cultura pura

3. identificación de microorganismos (determinación de especies).

El aislamiento e identificación de cultivos puros de bacterias aeróbicas y anaeróbicas implica los siguientes estudios:

Etapa I (trabajar con material nativo)

Objetivo: obtener colonias aisladas

1. La microscopía preliminar da una idea aproximada de la microflora.

2. Preparación de material para la investigación.

3. Siembra en medios nutritivos sólidos para obtener colonias aisladas.

4. Incubación a temperatura óptima, normalmente 37°C, durante 18 a 24 horas.

Etapa II

Objetivo: obtener una cultura pura

1. Estudio macroscópico de colonias en luz transmitida y reflejada (características de tamaño, forma, color, transparencia, consistencia, estructura, contorno, superficie de las colonias).

2. Examen microscópico de colonias aisladas.

3. Pruebas de aerotolerancia (para confirmar la presencia de anaerobios estrictos en el material de prueba).

4. Siembra de colonias características de una determinada especie en medios de acumulación de cultivo puro o medios selectivos e incubación en condiciones óptimas.

Etapa III

Objetivo: identificación de cultivos puros aislados.

1. Para identificar el cultivo seleccionado en función de un conjunto de propiedades biológicas se estudia lo siguiente:

· morfología y propiedades tintoriales

· propiedades culturales (carácter de crecimiento en medios nutritivos)

· propiedades bioquímicas (actividad enzimática de los microorganismos)

Propiedades serológicas (antigénicas)

· propiedades virulentas (la capacidad de producir factores de patogenicidad: toxinas, enzimas, factores de defensa y agresión)

patogenicidad para los animales

· fagolizabilidad (sensibilidad a los bacteriófagos de diagnóstico)

sensibilidad a los antibióticos

· otras propiedades individuales

Etapa IV (Conclusión)

Con base en las propiedades estudiadas, se llega a una conclusión sobre la cultura seleccionada.

La primera etapa de la investigación. El examen del material patológico comienza con la microscopía. La microscopía del material nativo teñido permite establecer aproximadamente la composición del paisaje microbiano del objeto en estudio y algunas características morfológicas de los microorganismos. Los resultados de la microscopía del material nativo determinan en gran medida el curso de futuras investigaciones; posteriormente se comparan con los datos obtenidos mediante la inoculación en medios nutritivos.

Si la muestra contiene un contenido suficiente de microorganismos patógenos, la inoculación se realiza en medios nutritivos sólidos (para obtener colonias aisladas). Si hay pocas bacterias en el material de prueba, la inoculación se realiza en medios nutritivos de enriquecimiento líquido. Los medios nutritivos se seleccionan según las necesidades de los microorganismos.

El cultivo de microorganismos sólo es posible si se crean las condiciones óptimas para su vida y se observan reglas que excluyen la contaminación (contaminación accidental por microbios extraños) del material en estudio. Se pueden crear condiciones artificiales que impidan la contaminación del cultivo por otras especies en un tubo de ensayo, un matraz o una placa de Petri. Todo el material de vidrio y los medios de cultivo deben ser estériles y, tras la inoculación del material microbiano, protegerse de la contaminación externa, lo que se consigue mediante tapones o cápsulas y tapas metálicas. Las manipulaciones con el material de prueba deben realizarse en la zona de llama de una lámpara de alcohol para evitar la contaminación del material del ambiente externo, así como para cumplir con las normas de seguridad.

La inoculación del material en medios nutritivos debe realizarse a más tardar 2 horas desde el momento de la recolección.

Segunda etapa de la investigación. Estudio de colonias y aislamiento de cultivos puros. Después de un día de incubación, las colonias crecen en las placas, y en la primera pasada el crecimiento es continuo, y en las siguientes pasadas, colonias aisladas. Una colonia es una colección de microbios de la misma especie que crecen a partir de una célula. Dado que el material suele ser una mezcla de microbios, crecen varios tipos de colonias. Se marcan con un lápiz las diferentes colonias, delimitándolas en un círculo desde abajo, y se estudian (Cuadro 11). En primer lugar, las colonias se estudian a simple vista: signos macroscópicos. La copa se ve (sin abrirla) desde abajo con luz transmitida, se observa la transparencia de las colonias (transparente, si no bloquea la luz; translúcida, si bloquea parcialmente la luz; opaca, si la luz no atraviesa la colonia), y se mide el tamaño de las colonias (en mm). Luego estudian las colonias desde el costado de la tapa, observan la forma (redonda regular, irregular, plana, convexa), la naturaleza de la superficie (lisa, brillante, opaca, rugosa, arrugada, húmeda, seca, viscosa), el color. (incoloro, coloreado).

Tabla 11. Esquema de estudio de colonias.

№	Firmar	Posibles características de las colonias.
1.	Forma	Plano, convexo, abovedado, deprimido, redondo, roseta, estrella
2.	Tamaño, mm	Grande (4-5 mm), mediano (2-4 mm), pequeño (1-2 mm), enano (< 1 мм)
3.	Carácter superficial	Liso (forma de S), rugoso (forma de R), viscoso (forma de M), estriado, grumoso, mate, brillante
4.	Color	Incoloro, coloreado
5.	Transparencia	Transparente, opaco, translúcido.
6.	Carácter de los bordes	Lisa, dentada, con flecos, fibrosa, festoneada
7.	Estructura interna	Homogéneo, granular, heterogéneo.
8.	Consistencia	Viscoso, viscoso, quebradizo
9.	Emulsificación en una gota de agua.	Bueno malo

Nota: los puntos 5 a 7 se estudian con un aumento bajo del microscopio.

Puedes ver las diferencias entre colonias aún mejor cuando las ves con aumento. Para hacer esto, coloque una copa cerrada con el fondo hacia arriba en el escenario, baje ligeramente el condensador, use un ligero aumento de la lente (x8), mueva la copa, estudie las características microscópicas de las colonias: la naturaleza del borde ( lisa, ondulada, dentada, festoneada), estructura (homogénea, granular, fibrosa, homogénea o diferente en el centro y periferia).

A continuación se estudia la morfología de las células microbianas de las colonias. Para ello se realizan frotis de una parte de cada una de las colonias marcadas y se tiñen con Gram. Al tomar colonias, preste atención a la consistencia (seca, si la colonia se desmorona y es difícil de recoger; blanda, si se toma fácilmente con un asa; viscosa, si la colonia se tira con un asa; dura, si es parte de la colonia no se toma con un bucle, solo se puede eliminar la colonia completa).

Al observar los frotis, se establece que la colonia está representada por un tipo de microbio, por lo que se pueden aislar cultivos puros de bacterias. Para ello, las colonias estudiadas se vuelven a sembrar en agar inclinado. Al volver a sembrar desde colonias, se debe tener cuidado de tomar exactamente las colonias deseadas, sin tocar las colonias cercanas con el asa. Los tubos se etiquetan y se incuban en un termostato a 37°C durante 24 horas.

La tercera etapa de la investigación. Identificación de la cultura aislada. Identificación de microbios: determinación de la posición sistemática de un cultivo aislado de un material en especies y variantes. La primera condición para una identificación fiable es la pureza incondicional del cultivo. Para identificar microbios se utiliza un conjunto de características: morfológicas (forma, tamaño, presencia de flagelos, cápsulas, esporas, posición relativa en un frotis), tintoriales (relación con la tinción de Gram u otros métodos), químicas (proporción de guanina + citosina en Molécula de ADN), cultural (necesidades nutricionales, condiciones de cultivo, tasa y naturaleza de crecimiento en diversos medios nutritivos), enzimática (escisión de diversas sustancias con la formación de productos intermedios y finales), serológica (estructura antigénica, especificidad), biológica (virulencia). para animales, toxigenicidad, alergenicidad, influencia de los antibióticos, etc.).

Para la diferenciación bioquímica, la capacidad de las bacterias para fermentar carbohidratos con la formación de intermediarios y productos finales, la capacidad de degradar proteínas y peptonas y estudiar enzimas redox.

Para estudiar las enzimas sacarolíticas, se inoculan cultivos aislados en tubos de ensayo con medios semilíquidos que contienen lactosa, glucosa y otros carbohidratos y alcoholes polihídricos. Para medios semilíquidos, la inoculación se realiza inyectando en la profundidad del medio. Al sembrar por inyección, el tubo de ensayo con el medio se mantiene inclinado, se quita el tapón y se quema el borde del tubo de ensayo. El material se toma con un asa estéril y con él se perfora la columna de medio nutritivo casi hasta el fondo.

Para determinar las enzimas proteolíticas, el cultivo aislado se inocula en agua de peptona o MPB. Para hacer esto, tome en su mano el tubo de ensayo con la inoculación más cerca de usted y el tubo de ensayo con el medio más lejos de usted. Se abren ambos tubos al mismo tiempo, agarrando sus tapones con el dedo meñique y el borde de la palma, se queman los bordes de los tubos, se toma un poco de cultivo con un asa enfriada calcinada y se transfiere al segundo tubo. tritúrelo en un medio líquido en la pared del tubo de ensayo y lávelo con el medio.

Al sembrar y resembrar, se debe prestar atención al cumplimiento de las reglas de esterilidad para no contaminar sus cultivos con microflora extraña y tampoco contaminar el medio ambiente. Los tubos se etiquetan y se colocan en un termostato para su incubación a 37°C durante 24 horas.

Conclusión

Contabilización de resultados. Conclusión del estudio. Se tienen en cuenta los resultados de la identificación y, a partir de la totalidad de los datos obtenidos, a partir de la clasificación y características de las cepas típicas descritas en el manual (Clave de Burgee, 1994-1996), se determina el tipo de cultivos aislados.

Para examinar las muestras en busca de la presencia de determinadas bacterias, se utilizan varios métodos de diagnóstico, incluido el método bacterioscópico. En este artículo se analizarán las características de este método, así como el método de investigación bacteriológica.

La esencia del método de diagnóstico bacterioscópico.

El método bacterioscópico de examen de una muestra tiene como objetivo identificar microorganismos en la sustancia en estudio, así como estudiar en detalle las propiedades de estos microorganismos, aclarar su cantidad y comportamiento en el medio considerado. Las ventajas de este método de estudio de análisis son la sencillez, rapidez y accesibilidad. Puede realizarse en casi cualquier laboratorio utilizando un número mínimo de instrumentos y reactivos químicos. Sus desventajas incluyen la imposibilidad de obtener una imagen completa del comportamiento de los microbios.

Materiales necesarios para la investigación.

Para estudiar análisis mediante el método bacterioscópico, se requieren las siguientes herramientas:

Bucle metálico.
Deslizar. Este artículo debe estar limpio, ya que cualquier contaminación puede afectar el estado de la muestra.
Pinzas.
Papel de filtro.

Los portaobjetos nuevos se limpian con una solución de refresco al 1%. Después de hervir en dicha solución, el vidrio se lava con agua destilada, una solución débil de ácido clorhídrico y luego nuevamente con agua destilada. El vidrio usado se limpia en varias etapas: primero se coloca en una solución de ácido sulfúrico durante 60 a 120 minutos, luego se hierve en una solución de soda y luego se lava con agua. Después de eso, el vaso se sumerge en alcohol medicinal.

Los vasos para instrumentos deben almacenarse en alcohol o en recipientes bien cerrados. Además, en este último caso, el vidrio debe estar seco.

Para este estudio también necesitará los siguientes reactivos químicos:

Alcohol;
la solución de Lugol;
Tintes.

Los colorantes más utilizados son la fucsina de Ziehl, el azul de metileno y la violeta de genciana carbólica. El último tinte es una solución de fucsina común en cinco por ciento de agua carbólica.

Progreso del estudio.

Puedes estudiar la cultura tanto en su forma original como en color. En este último caso, tanto las colonias de microorganismos como las bacterias individuales morirán, lo que nos permitirá conocer mejor la estructura de estos organismos simples. Al examinar el fármaco en su forma original, el técnico de laboratorio, a su vez, recibe más información sobre la actividad de los microbios. En ambos casos, la preparación se examina con un microscopio.

La tinción del medio se realiza en dos etapas: primero, se prepara la preparación para el procedimiento y solo luego se tiñe. La preparación de la muestra se realiza de la siguiente manera:

La muestra destinada a la investigación se distribuye uniformemente sobre el cristal del instrumento en forma de círculo u óvalo. Si hay impurezas extrañas en el material (por ejemplo, pus), se aplican 1-2 gotas de agua al vidrio antes de agregar la muestra de prueba.
Después de eso, el frotis resultante debe secarse.
Una vez que la mancha se haya secado, se debe fijar con la llama del mechero.

Para fijarlo de esta forma, se coloca el cristal del instrumento tres veces sobre la llama. Si el frotis se fija con suficiente firmeza, el asistente de laboratorio que realiza el experimento sentirá una sensación de ardor en los dedos.

Al final de este procedimiento, se tiñe la muestra.

Métodos de tinción de muestras.

La coloración puede ser tan sencilla como utilizar un solo tinte. Y complejo, en el que, para diferenciar con precisión las células bacterianas según uno u otro de sus rasgos característicos, se aplican secuencialmente a la muestra varios reactivos químicos de tinción diferentes. Un ejemplo de tinción compleja son los métodos de Gram y Ziehl-Neelsen.

método de gramo

El método de Gram le permite determinar la composición química de la membrana celular. Gracias a este método, se introdujo la clasificación de bacterias Gram: las bacterias grampositivas (que incluyen agentes causantes de muchas enfermedades) después de la tinción adquieren un color púrpura oscuro y las bacterias gramnegativas, un tinte rojo característico. El método de Gram consta de los siguientes pasos:

Primero, el medicamento se trata con solución de Lugol durante un minuto.
Después del tratamiento con Lugol, la muestra se blanquea con alcohol.
Luego, la preparación se lava con agua destilada y además se tiñe con fucsina.

Método Ziehl-Neelsen

El método Ziehl-Neelsen se utiliza para determinar las bacterias sensibles a los ácidos cuyas membranas celulares contienen una gran cantidad de lípidos, por ejemplo, los agentes causantes de la tuberculosis. El trabajo con este método se lleva a cabo en cinco etapas:

Se coloca papel de filtro sobre un portaobjetos de vidrio, sobre el que luego se aplica una pequeña cantidad de fucsina Ziehl.
A continuación se calienta el portaobjetos hasta que aparece el vapor característico. Después de que aparece el vapor, se deja enfriar el vaso. Este procedimiento se repite dos veces más, después de lo cual se deja enfriar nuevamente el vidrio.
Después de esto, lave el magenta del cristal del instrumento con agua destilada, después de retirar el papel.
Luego se coloca el vidrio en una solución de ácido clorhídrico o sulfúrico hasta que la muestra pierde completamente su color.
Finalmente, se aplica una solución de azul de metileno a la preparación blanqueada, se lava el vidrio con agua destilada y se deja secar para un examen más detallado de la preparación resultante bajo un microscopio.

método leffler

Los métodos de tinción simples incluyen el método Leffler. Con él, todas las bacterias se vuelven azules. Este método se lleva a cabo en dos pasos:

Se coloca papel de filtro sobre el frotis, sobre el cual se aplica la solución de azul de metileno de Loeffler. El medicamento se deja en este estado durante 3-5 minutos.
Después de este período de tiempo, la preparación se lava con agua y se seca, después de lo cual se puede examinar bajo un microscopio.

Con el método bacterioscópico se tiñen al menos dos preparaciones, una de ellas se tiñe mediante un método simple y la otra se tiñe mediante un método complejo.

Método bacteriológico

A menudo, al estudiar las pruebas, es necesario determinar la sensibilidad de un patógeno a un fármaco en particular. En este caso, la muestra se examina mediante el método bacteriológico. Este método consta de los siguientes pasos:

Primero, es necesario purificar el cultivo para identificar tipos específicos de microbios. Para ello, se debe colocar la muestra en un ambiente en el que sea más probable el desarrollo de las bacterias a detectar. También es posible separar mecánicamente el biomaterial durante la siembra.
Después de obtener un cultivo puro, las muestras tomadas del mismo se examinan mediante el método bacterioscópico.

Los siguientes son ejemplos de medios utilizados para detectar microorganismos:

Medio de Elschnig, compuesto por un tercio de suero de caballo y dos tercios de caldo.
Suero de Loeffler, que se utiliza para identificar patógenos de la difteria. Este medio consta de tres cuartos de suero de caballo o bovino y un cuarto de caldo que contiene 1% de glucosa.
Agar sangre utilizado para identificar estreptococos y probar su sensibilidad a los fármacos antibacterianos. Este medio consta de un 5-10% de suero sanguíneo animal y agar.

Tipos de pruebas de bacterioscopia

Bacterioscopia de pruebas de heces.

Para el examen bacterioscópico del análisis de heces, se requiere una muestra del paciente. Si es necesario analizar la microflora intestinal, cuyas alteraciones en su composición indican la presencia de disbacteriosis o enfermedades infecciosas del sistema digestivo, la muestra se toma mediante un asa que se inserta en el ano a unos 10 centímetros de profundidad.

Al examinar una muestra de heces, se pueden detectar los siguientes microorganismos peligrosos:

Estafilococos.
Klebsiella, cuya presencia indica daño al colon.
Pseudomonas aeruginosa, que produce toxinas extremadamente peligrosas para los humanos.

La presencia de Pseudomonas aeruginosa en el cuerpo humano puede provocar envenenamiento de la sangre y meningitis, enfermedades que pueden ser fatales.

Bacterioscopia de análisis de orina.

Se realiza un análisis de orina para examen bacterioscópico si existe sospecha de inflamación del sistema urinario y la presencia de enfermedades como pielonefritis y cistitis, cuyos agentes causantes son E. coli y algunos patógenos de enfermedades de transmisión sexual, respectivamente. Para tal prueba, se requieren de 50 a 100 ml de orina, y la orina debe almacenarse en un recipiente esterilizado. Antes de realizar la prueba, es necesario lavarse bien para que haya menos impurezas extrañas en la orina. No se recomienda donar orina durante la menstruación.

El análisis bacterioscópico de orina es indispensable para detectar enfermedades del sistema urinario en los bebés. En este caso, la orina se recoge a través de un catéter en un recipiente esterilizado. El examen de una muestra de orina debe realizarse lo antes posible, de lo contrario será difícil la detección de patógenos.

Bacterioscopia de esputo

Al analizar el esputo, se examinan dos frotis. Uno de ellos está siendo estudiado por la presencia del bacilo de Koch, el agente causante de la tuberculosis. A partir de los resultados del segundo estudio, se extraen conclusiones sobre la presencia de otros microbios en el esputo.

Para analizar el esputo en busca de tuberculosis, la muestra se tiñe mediante el método de Ziehl-Neelsen.

Para comprobar la presencia de otros microbios, la muestra se tiñe de Gram. Mediante el método bacterioscópico mediante tinción de Gram, es posible identificar el neumococo, una bacteria que causa neumonía. Además, cuando se trabaja con una muestra de acuerdo con este esquema, es posible detectar la presencia de estreptococos en el esputo, los agentes causantes del dolor de garganta, así como Staphylococcus aureus. Este último microorganismo representa un peligro particular para la salud humana. Provoca procesos purulentos y la formación de abscesos, incluso en los órganos internos.

resumámoslo

El método de diagnóstico bacterioscópico es uno de los principales métodos de investigación en microbiología. A pesar de sus deficiencias, este método se utiliza ampliamente en la medicina moderna para diagnosticar una amplia variedad de enfermedades, algunas de las cuales, por ejemplo, la tuberculosis, representan un peligro particular para los humanos.

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El uso del método bacteriológico permite aislar el patógeno en cultivo puro a partir del material obtenido del paciente e identificarlo a partir del estudio de un conjunto de propiedades. La mayoría de las bacterias son capaces de crecer en diversos medios nutritivos artificiales (excepto clamidia y rickettsia), por lo que el método bacteriológico es importante en el diagnóstico de muchas enfermedades infecciosas.

Si se obtiene un resultado positivo, el método bacteriológico permite determinar la sensibilidad del patógeno aislado a los fármacos antimicrobianos. Sin embargo, la eficacia de este estudio depende de muchos parámetros, en particular de condiciones para recolectar material y él transporte al laboratorio.

A requerimientos básicos Los requisitos para la selección y transporte de material para investigación bacteriológica incluyen:

tomar material antes del inicio del tratamiento etiotrópico;
cumplimiento de condiciones estériles al recolectar material;
corrección técnica de la recogida de materiales;
cantidad suficiente de material;
asegurar las condiciones de temperatura para almacenar y transportar material;
minimizando el intervalo de tiempo entre la recolección del material y la siembra en medios nutritivos sólidos.

El transporte del material al laboratorio debe realizarse lo antes posible, pero no más de 1-2 horas después de su recogida. Las muestras de material deben mantenerse a una temperatura determinada; En particular, los materiales normalmente estériles (sangre, líquido cefalorraquídeo) se almacenan y entregan al laboratorio a 37 °C. Los materiales no esterilizados (orina, secreciones respiratorias, etc.) se almacenan a temperatura ambiente durante no más de 1 a 2 horas o no más de un día a 4 °C (condiciones de refrigerador doméstico). Si es imposible entregar las muestras al laboratorio dentro del plazo regulado, se recomienda utilizar medios de transporte diseñados para preservar la viabilidad de los patógenos en condiciones de conservación.

Sangre para la investigación debe tomarse del paciente durante el período de aumento de la temperatura corporal, al comienzo de la aparición de la fiebre. Se recomienda examinar de 3 a 4 muestras de sangre tomadas a intervalos de 4 a 6 horas, lo que se justifica desde el punto de vista de reducir el riesgo de bacteriemia transitoria "perdida" y aumentar la capacidad de confirmar el papel etiológico de la microflora oportunista aislada. de la sangre, si esta microflora se detecta en varias muestras venosas. Se inocula una muestra de sangre en una cantidad de 10 ml para un adulto y 5 ml para niños en al menos dos frascos con un medio para microorganismos aeróbicos y anaeróbicos en una proporción de 1:10. Es aconsejable un único estudio de sangre arterial.

Llevar fluido cerebroespinal(LCR) lo produce un médico durante una punción lumbar en una cantidad de 1 a 2 ml en un tubo seco y estéril. La muestra se entrega inmediatamente al laboratorio, donde también comienza inmediatamente su examen. Si esto no es posible, el material se almacena a 37 °C durante varias horas. Aumenta significativamente el número de resultados positivos del examen bacteriológico al inocular 1-2 gotas de LCR en un tubo de ensayo que contiene un medio semilíquido con glucosa y en una placa de Petri con agar "sangre". Para el envío del material utilizar cajas isotérmicas, almohadillas térmicas, termos o cualquier otro embalaje donde se mantenga la temperatura en torno a los 37 °C.

Excremento para la investigación bacteriológica, se toman de 3 a 5 g con espátulas de madera esterilizadas en un recipiente esterilizado con tapa hermética. El examen del material recolectado debe comenzar a más tardar 2 horas después, si no es posible comenzar el examen dentro de este tiempo, se debe recolectar una pequeña cantidad de material y colocarlo en un medio de transporte adecuado. Al recolectar heces, se debe esforzarse por enviar impurezas patológicas (moco, pus, partículas epiteliales, etc.) para su examen, si las hubiera, evitando la introducción en el material de impurezas sanguíneas que tienen propiedades bactericidas.

Se pueden utilizar hisopos rectales (con punta de algodón) para recolectar el material. El hisopo debe humedecerse con una solución isotónica estéril de cloruro de sodio o un medio de transporte (pero no con gel oleoso). Se introduce por el recto hasta una profundidad de 5-6 cm y, girando el tampón, se retira con cuidado, controlando la aparición del color fecal en el tampón. El hisopo se coloca en un tubo de ensayo seco si el estudio del material comienza dentro de 2 horas; en caso contrario, en un medio de transporte.

estoy orinando(una porción promedio de orina liberada libremente) en una cantidad de 3 a 5 ml se recoge en un recipiente estéril después de un lavado minucioso de los genitales externos. Es preferible recolectar la orina por la mañana.

Bilis recogido durante la intubación duodenal en la sala de tratamiento por separado en las porciones A, B y C en tres tubos estériles, observando las reglas de asepsia.

Agua de lavado gástrico recogido en frascos esterilizados en cantidades de 20-50 ml. Debe tenerse en cuenta que en estos casos el lavado gástrico se realiza solo con soluciones indiferentes (que no tienen efecto bacteriostático o bactericida sobre los microorganismos), preferiblemente agua hervida (sin agregar refrescos, permanganato de potasio, etc.).

Esputo. El esputo matutino que se libera durante un ataque de tos se recoge en un frasco esterilizado. Antes de toser, el paciente se cepilla los dientes y se enjuaga la boca con agua hervida para eliminar mecánicamente los restos de comida, el epitelio descamado y la microflora bucal.

Agua de lavado bronquial. Durante la broncoscopia, no se inyectan más de 5 ml de solución isotónica de cloruro de sodio y luego se aspira en un tubo esterilizado.

Secreción de la faringe, boca y nariz.. El material de la cavidad bucal se toma con el estómago vacío o 2 horas después de una comida con un hisopo o cuchara de algodón esterilizado de la membrana mucosa y sus áreas afectadas en las entradas de los conductos de las glándulas salivales, la superficie de la lengua y de las úlceras. Si queda película, retírela con unas pinzas esterilizadas. El material de la cavidad nasal se extrae con un hisopo de algodón seco y esterilizado, que se inserta profundamente en la cavidad nasal. El material de la nasofaringe se toma con un hisopo de algodón faríngeo posterior estéril, que se inserta con cuidado a través de la abertura nasal hacia la nasofaringe. Si comienza la tos, no se retira el tampón hasta que la tos desaparezca. Para detectar la difteria, se examinan simultáneamente películas y mocos de la nariz y la garganta, tomando el material con diferentes hisopos.

El material de prueba se inocula en medios nutritivos sólidos mediante técnicas especiales para obtener el crecimiento de colonias individuales de microorganismos, que luego se seleccionan para aislar un cultivo puro del patógeno.

Ciertos tipos de bacterias se aíslan utilizando medios selectivos que inhiben el crecimiento de microorganismos extraños o contienen sustancias que estimulan el crecimiento de ciertos microbios patógenos.

Microorganismos aislados en medios nutritivos. identificar, es decir. determinar su especie o tipo. Recientemente, para la identificación en la práctica sanitaria se han utilizado sistemas de microtest, que son paneles con un conjunto de entornos de diagnóstico diferencial, lo que agiliza la investigación. Los sistemas de micropruebas también se utilizan para determinar la sensibilidad de los microorganismos a los medicamentos antimicrobianos diluyendo el antibiótico en un medio nutritivo líquido.

Al evaluar los resultados de un estudio bacteriológico, el médico debe tener en cuenta que un resultado negativo no siempre significa la ausencia de un patógeno y puede estar asociado con el uso de medicamentos antimicrobianos, alta actividad microcida de la sangre y errores técnicos. La detección de un microbio patógeno en el material de un paciente, independientemente del cuadro clínico, es posible en caso de portador bacteriano convaleciente, sano o transitorio.

El aislamiento de la sangre, sujeto a todas las reglas de asepsia, de microorganismos oportunistas (estafilococos epidermidis, Escherichia coli) e incluso saprófitos debe considerarse una manifestación de bacteriemia, especialmente si estos microbios se encuentran en más de una muestra de material o en diferentes sustratos ( sangre, orina), ya que al reducir la inmunorreactividad del cuerpo, estos y otros microorganismos "no patógenos" pueden ser agentes causantes de procesos infecciosos, incluida la sepsis.

Hay una cierta dificultad interpretación de los resultados del examen bacteriológico de medios no estériles, es decir, prueba del papel etiológico de los microorganismos oportunistas. En este caso, se tienen en cuenta indicadores como el tipo de cultivos aislados, el número de células microbianas de un tipo determinado en el material, su aislamiento repetido durante la enfermedad, la presencia de un monocultivo o asociación de un microorganismo.

Yushchuk N.D., Vengerov Yu.Ya.

Método bacteriológico (cultural)

un conjunto de métodos para el cultivo artificial de microorganismos en medios nutritivos con el fin de identificarlos al establecer una enfermedad infecciosa u otro proceso causado por microbios y determinar una serie de propiedades fisiológicas para otros fines, por ejemplo, al elegir un fármaco de quimioterapia. Métodos modernos para estudiar la mayoría de los biol. Las propiedades de las bacterias sólo son posibles si hay agua limpia(cm.). La contaminación de la hierba con otros tipos de microbios, por regla general, conduce a resultados distorsionados y conclusiones incorrectas. Por tanto, la primera tarea de B.m. es obtener pasto puro de cualquier tipo (var) a partir de una asociación microbiana y evitar la contaminación por microflora extraña del material de investigación y cultivo microbiano en todas las etapas del estudio. Esto es posible cuando se recolecta material en condiciones estériles en recipientes esterilizados, se inocula el material en medios estériles con un instrumento esterilizado y se evita la entrada de microbios del aire durante la entrega, almacenamiento e incubación del material y los medios nutritivos inoculados. La segunda tarea de B.m. - identificación microbiana(ver) hierbas puras aisladas, la tercera es la determinación de propiedades adicionales, por ejemplo, sensibilidad a los antibióticos, virulencia. Etapas de B.M.: 1) recolección de material (ver. Materiales para la investigación) y su entrega a las bacterias. laboratorio; 2) investigación en microscopía. materiales (ver Método bacterioscópico). Este paso a menudo no se realiza, aunque, a pesar de la menor sensibilidad, la microscopía preliminar en algunos casos proporciona información aproximada sobre el patógeno y le permite seleccionar los medios necesarios para la inoculación; 3) procesamiento de la investigación. material fisico o química. factores para eliminar o reducir la microflora extraña. Esta medida se utiliza, por ejemplo, al examinar el esputo, aislar microbios resistentes al ácido y formadores de esporas; 4) investigación de siembra. materiales (ver Cultivos bacteriológicos) en medios nutritivos para obtener colonias aisladas; 5) incubación de medios nutritivos inoculados. El momento y la temperatura de incubación dependen de la especie esperada de la planta. Normalmente, los cultivos se mantienen en un termostato a 37°C durante 1 o 2 días. Si no hay crecimiento, el período de incubación se puede extender por otros 2 a 3 días. Para una incubación más prolongada es necesario evitar que el medio se seque, para lo cual se colocan los cultivos en un desecador con agua o se llenan los tapones de los tubos con parafina; 6) investigación colonias(cm.). Para el estudio, se seleccionan colonias aisladas homogéneas ubicadas lejos de los bordes del plato y a lo largo del recorrido del bucle, se rodean con una línea y se numeran. Si el estudio se lleva a cabo de manera no dirigida (proceso polietiológico, etc.), según los resultados de una inspección visual, se seleccionan 2-3 colonias de todos los tipos presentes en la placa y se hacen frotis a partir de ellas; 7) resembrar de colonias seleccionadas en medios de acumulación. Para ello, del resto de la colonia, en un frotis del corte se identificaron bacterias de forma y color uniformes; mediante un asa, procurando no tocar las colonias vecinas, se toma una parte de las bacterias y se inocula en una MPA biselado en un tubo de ensayo o en un medio especial con una raya; 8) incubación de cultivos en un termostato hasta que aparezca un crecimiento continuo (generalmente 1-2 días); 9) determinación de la pureza de la hierba cultivada en medios inclinados mediante examen macroscópico del crecimiento y microscopía de un frotis del mismo; 10) identificación de la hierba pura aislada y, si es necesario (a petición del médico, epidemiólogo), determinación de diversos biol. sv-v; 11) conclusión sobre la identidad de especie de la especie seleccionada y sus propiedades. La conclusión se da en el formulario oficial con referencia al número; en Crimea, esta planta se registra en el diario del laboratorio. B.m. Es el principal en la dieta de la mayoría de las bacterias. infecciones. Suele tener una alta sensibilidad, lo que le permite distinguirse de la investigación. material puro, incluso si la dosis de semilla del material contenía varias docenas de individuos. Para B.m. caracterizado por una alta especificidad. Aislamiento de uno u otro tipo de bacteria a partir de material patológico sujeto a una serie de condiciones (ver. El agente causante de la enfermedad) establece de manera confiable la etiología del proceso patológico. La excepción son las bacterias oportunistas, autóctonas de un biotopo particular, para determinar el etiol. Su papel requiere criterios especiales, así como una distinción entre portador y enfermedad (por ejemplo, portador de difteria en el dolor de garganta estreptocócico). El valor de B.m. También radica en el hecho de que con su ayuda se pueden establecer los medicamentos necesarios para prescribir quimioterapia y seroterapia, identificar la fuente de infección y los mecanismos de transmisión del patógeno y elegir medidas antiepidémicas. Finalmente, B.m. se refiere a los primeros métodos de d-ki. Desventajas de B. m.: peligro de infección, complejidad, intensidad del trabajo, duración. Sólo se pueden obtener datos fiables sobre la composición de la microflora y sus propiedades estudiando una muestra de 3 a 10 especies de flora.