O podjetju
Ali niste zadovoljni s kakovostjo izdelkov, ki jih dobite v laboratoriju? Poskusite sodelovati z nami. Vsi naši izdelki so izdelani po najvišjih mednarodnih standardih in imajo potrdila o registraciji Ministrstva za zdravje Ukrajine. Oglejte si to sami. Oddajte poskusno naročilo.
Bakteriološke študije
Bakteriološke raziskave- namenjen izolaciji bakterij in proučevanju njihovih lastnosti z namenom postavitve mikrobiološke diagnoze.
Testni material je treba zbrati v aseptičnih pogojih v sterilne posode in čim prej dostaviti v laboratorij. Po potrebi je treba vzorce hraniti v hladilniku. Tehnika vzorčenja je odvisna od predmeta, narave bolezni in lastnosti mikroorganizma. Ena najpogostejših metod bakteriološkega raziskovanja je bakterioskopija.
Za preučevanje nefiksiranih bakterij uporabljamo dve metodi: zdrobljeno kapljico (med stekelcem in pokrovnim steklom) in visečo kapljico. Ne smemo pozabiti, da so pripravki nefiksiranih bakterij nalezljivi.
Najpomembnejši elementi bakteriološke raziskave so inokulacije in subkulture bakterijskih kultur, ki se izvajajo z bakterijsko zanko ali Pasteurjevo pipeto. Zanko steriliziramo z žarjenjem v plamenu, nato jo ohladimo z dotikom površine neinokuliranega agarja ali s spiranjem v sterilni tekočini. Pri uporabi Pasteurjeve pipete s pinceto odlomite konico, pipeto večkrat popeljite skozi plamen gorilnika in pustite, da se ohladi. Pri setvi se uporabljajo tekoči in trdni hranilni mediji. Pri setvi na poševni agar bakterijsko kulturo podrgnemo z zanko po površini agarja. Pri sejanju v debelino stolpca agarja ali želatine hranilni medij prebodemo do dna epruvete z zanko ali posebno iglo. Pri setvi v tekoče gojišče moramo paziti, da se tekočina ne izlije in ne zmoči robov epruvet in zamaškov. Inokulacije in subkulture je treba izvajati v bližini plamena plinskega gorilnika, epruvete ne smejo ostati dolgo odprte, zanka ali Pasteurjeva pipeta s kulturo se ne smejo ničesar dotikati; Preden zaprete epruveto, je treba robove zažgati. Inokulirane epruvete je treba takoj označiti.
Mikrobiološke raziskovalne metode delimo na metode za neposredno odkrivanje patogenov v pacientovem telesu - bakterioskopske in bakteriološke študije; metode posrednega dokazovanja prisotnosti patogena v telesu pacienta - serološke študije, namenjene odkrivanju specifičnih antigenov v okuženem materialu ali protiteles v krvnem serumu in različnih izločkih pacientovega telesa.
Za številne nalezljive bolezni se uporablja bakterioskopski pregled krvi, urina, cerebrospinalne tekočine, sluzi iz grla in nosu, blata in različnih patoloških substratov za prisotnost patogena. Ta metoda ima precej omejene uporabe, čeprav je zelo pomembna. Uporablja se zlasti za odkrivanje povzročiteljev malarije, recidivne vročine in leptospiroze v krvi. Cerebrospinalna tekočina se pregleda za gnojni in tuberkulozni meningitis, sluz iz grla in nosu - za davico, Vincentovo angino, blato - za amebiazo, balantidiazo, giardijo; urin - za leptospirozo. V punktatu kužnega bubona in brisih odtisov, vzetih iz antraksnega karbunkla, je mogoče videti bacile kuge in antraksa; mikroskopija pikčastega brisa iz kostnega mozga in vranice, granulacije iz razjede lahko odkrijejo lišmanijo; v sputumu - Mycobacterium tuberculosis. Prednost bakterioskopske metode je njena hitrost. Rezultate analize lahko dobite v nekaj urah. Pri nekaterih boleznih (malarija, epidemični cerebrospinalni meningitis itd.) Lahko odkrijejo patogene v telesu bolnika že prvi dan bolezni, kar je zelo pomembno za pravočasno diagnozo in zdravljenje. Možnosti bakterioskopske diagnoze so se bistveno povečale zaradi obdelave pripravkov s specifičnimi serumi, ki vsebujejo protitelesa proti določenemu patogenu, označena s fluorokromi (metoda imunofluorescence) ali encimi (metoda encimskega imunskega testa). V tem primeru se označena protitelesa kombinirajo z antigenom, ki se odkrije z imunofluorescentno metodo pod fluorescentnim mikroskopom in z metodo encimskega imunskega testa - z obarvanjem produkta encimske reakcije po vnosu mešanice substrat-indikator.
Bakteriološka diagnostična metoda temelji na izolaciji patogena iz krvi, cerebrospinalne tekočine, sputuma, sluzi iz grla in nosu, blata, urina, žolča pacienta in v primeru smrti - iz kosov inokuliranih organov. na posebnih hranilnih medijih. Bakteriološka diagnostika se pogosto uporablja za preučevanje sluzi iz grla in nosu za bakterije davice, za izolacijo povzročiteljev črevesnih okužb (na primer kolere, griže, salmoneloze, escherichiosis) iz bolnikovega blata, povzročiteljev pljučnice iz sputuma in v drugih primerih. . V tem primeru se upoštevajo značilnosti domnevne okužbe, kraj selektivne lokalizacije patogena in poti njegovega sproščanja v okolje. Študija daje pozitivne rezultate že v prvih urah ali dneh bolezni. Vendar pa laboratorij poroča o končnem odgovoru za večino nalezljivih bolezni šele po 2-4 dneh, za brucelozo in tuberkulozo pa po 3-4 tednih. To je odvisno od časa, ki je potreben za rast mikroorganizmov in njihovo identifikacijo (biokemično in serološko). Vsak mikrob potrebuje za svojo rast ustrezen hranilni medij. Glede na to, kateri mikrob naj bi izolirali (kar ugotovimo s kliničnim in epidemiološkim pregledom pacienta), izberemo ustrezno hranilno gojišče. Včasih se setev izvaja hkrati na več hranilnih medijih. Vrednost rezultatov bakterioloških študij je v veliki meri odvisna od tega, ali je material pravilno odvzet bolniku in ali je pravilno dostavljen v laboratorij. Infektivni material se zbira v sterilnih posodah ob upoštevanju aseptičnih pravil.
Najpomembnejša faza bakteriološke raziskave je identifikacija- določanje vrste ali vrste bakterij, pridobljenih v obliki čiste kulture. Pri identifikaciji bakterij se preučujejo njihove fiziološke in biokemične lastnosti ter tvorba toksinov. Serološke metode za identifikacijo bakterij se pogosto uporabljajo. V mnogih primerih je učinkovita biološka metoda za identifikacijo mikroorganizmov, ki temelji na okužbi laboratorijskih živali s preiskovanim materialom ali nastalo bakterijsko kulturo in ugotavljanju značilnih patoloških sprememb pri živalih.
Za izolacijo čistih kultur se uporabljajo mehanske in biološke metode. Primer mehanske metode: kapljico preskusnega materiala zdrobimo z isto sterilno lopatico ali bakterijsko zanko po površini gostega hranilnega medija zaporedno v prvi, drugi in tretji petrijevki. Izolacija čiste kulture poteka iz zraslih posameznih kolonij in je sestavljena iz njihovega pregleda in presejanja na svežem hranilnem mediju. Biološke metode za izolacijo čistih kultur temeljijo na upoštevanju ene ali druge lastnosti izoliranega mikroba, ki ga razlikuje od drugih mikrobov, najdenih v proučevanem materialu.
Biološka metoda uporablja tovrstne hranilne medije, v katerih se ustvarijo pogoji, ki so ugodni za razvoj določene vrste mikroba. Biološke metode vključujejo tudi okužbo laboratorijskih živali, ki so občutljive na izolirane vrste bakterij.
Bakteriološka raziskava je niz metod za identifikacijo patogenih mikroorganizmov pri bolniku, nosilcu ali na okoljskih predmetih.
Izolacija čiste kulture;
Metode bakteriološkega raziskovanja se vedno bolj uvajajo v prakso za podrobnejši pregled bolnikov, ugotavljanje etiološkega dejavnika vnetnega procesa, predpisovanje racionalne terapije in določanje njene učinkovitosti.
Raznolikost kliničnega materiala in edinstvenost mikroflore posameznih organov določata značilnosti bakterioloških raziskovalnih metod, ki zahtevajo uporabo posebnih tehnik vzorčenja, inokulacije na hranilnih medijih in analize.
Bakteriološki pregled kliničnega materiala je sestavljen iz več faz:
Vzorčenje za raziskave;
Sejanje na hranilne medije;
Izolacija čiste kulture;
Identifikacija in diferenciacija izoliranih kultur mikroorganizmov;
Analiza rezultatov raziskave.
Med bakteriološkim pregledom se izvede tako imenovana setev materiala, zbranega od pacienta, na hranilne medije, kar spodbuja rast in razmnoževanje povzročitelja bolezni. Med študijo je mogoče ugotoviti ne le dejstvo prisotnosti, temveč tudi koncentracijo patogenih mikroorganizmov v določenem biomaterialu.
Metoda bakteriološke preiskave preiskuje sputum, cerebrospinalno tekočino, kri, pa tudi izcedek iz genitalij, ustne votline, žrela in ran bolnika. Tako lahko mikroorganizme posejemo skoraj iz katerega koli dela človeškega telesa.
Tehnika bakteriološke kulture je izjemno priročna in učinkovita za odkrivanje in določanje vrste bakterij in gliv. Odkrivanje virusov predstavlja določeno težavo zaradi posebnosti njihove biologije.
Bakteriološka preiskava (kultura) je zelo pomembna ne le za določitev specifične vrste mikroorganizma, temveč tudi za določitev stopnje občutljivosti določenega antibiotika nanj. Tako se določi največja učinkovitost določene vrste antibiotične terapije.
Pri izvajanju analize je pomembno vedeti, da nekateri mikroorganizmi, na primer pnevmokoki, umrejo precej hitro, ker imajo povečano nagnjenost k samouničenju. Tako je treba pridelke opraviti v kratkem času.
Glavna metoda mikrobiološke diagnostike in »zlati standard« mikrobiologije je bakteriološka metoda.
Namen bakteriološke metode sestoji iz izolacije čiste kulture patogena iz preskusnega materiala, zbiranja čiste kulture in identifikacije te kulture z nizom lastnosti: morfoloških, tinktorialnih, kulturnih, biokemičnih, antigenskih, s prisotnostjo dejavnikov patogenosti, toksigenosti in določanja njene občutljivosti. do protimikrobnih zdravil in bakteriofagov.
Bakteriološka raziskovalna metoda vključuje:
1. inokulacija testnega materiala v hranilne gojišča
2. izolacija čiste kulture
3. identifikacija mikroorganizmov (določitev vrste).
Izolacija in identifikacija čistih kultur aerobnih in anaerobnih bakterij vključuje naslednje študije:
I. stopnja (delo z domačim gradivom)
Cilj: pridobivanje izoliranih kolonij
1. Predhodna mikroskopija daje približno predstavo o mikroflori
2. Priprava materiala za raziskavo
3. Sejanje na trdne hranilne medije za pridobitev izoliranih kolonij
4. Inkubacija pri optimalni temperaturi, največkrat 37°C, 18-24 ur
Stopnja II
Cilj: pridobitev čiste kulture
1. Makroskopska študija kolonij v prepuščeni in odbiti svetlobi (značilnosti velikosti, oblike, barve, prosojnosti, konsistence, strukture, konture, površine kolonij).
2. Mikroskopski pregled izoliranih kolonij
3. Testiranje aerotolerance (za potrditev prisotnosti strogih anaerobov v testnem materialu).
4. Posejanje kolonij, značilnih za posamezno vrsto, na čistih ali selektivnih gojiščih in inkubacija v optimalnih pogojih.
Stopnja III
Cilj: Identifikacija izolirane čiste kulture
1. Za identifikacijo izbrane kulture na podlagi nabora bioloških lastnosti se preučuje naslednje:
· morfološke in tinktorialne lastnosti
· kulturne lastnosti (naravnost rasti na hranilnih medijih)
· biokemijske lastnosti (encimska aktivnost mikroorganizmov)
Serološke lastnosti (antigene)
· virulentne lastnosti (zmožnost proizvajanja dejavnikov patogenosti: toksinov, encimov, obrambnih in agresivnih dejavnikov)
patogenost za živali
· fagolizabilnost (občutljivost za diagnostične bakteriofage)
občutljivost na antibiotike
· druge posamezne nepremičnine
Stopnja IV (zaključek)
Na podlagi preučenih lastnosti se sklepa o izbrani kulturi.
Prva stopnja raziskave. Pregled patološkega materiala se začne z mikroskopijo. Mikroskopija obarvanega naravnega materiala omogoča približno določitev sestave mikrobne pokrajine preučevanega predmeta in nekatere morfološke značilnosti mikroorganizmov. Rezultati mikroskopiranja nativnega materiala v veliki meri določajo potek nadaljnjih raziskav, nato pa jih primerjamo s podatki, pridobljenimi z inokulacijo na hranilnih gojiščih.
Če je v vzorcu zadostna vsebnost patogenih mikroorganizmov, se inokulacija izvede na trdnih hranilnih medijih (za pridobitev izoliranih kolonij). Če je v preskusnem materialu malo bakterij, se inokulacija izvede na tekočem obogatitvenem hranilnem mediju. Hranilni mediji so izbrani glede na potrebe mikroorganizmov.
Gojenje mikroorganizmov je možno le, če so ustvarjeni optimalni pogoji za njihovo življenje in upoštevana pravila, ki izključujejo kontaminacijo (naključno kontaminacijo s tujimi mikrobi) preučevanega materiala. V epruveti, bučki ali petrijevki lahko ustvarimo umetne pogoje, ki bi preprečili kontaminacijo kulture z drugimi vrstami. Vsa steklena posoda in gojišča morajo biti sterilni in po inokulaciji mikrobnega materiala zaščiteni pred zunanjo kontaminacijo, kar dosežemo z zamaški ali kovinskimi pokrovčki in pokrovčki. Manipulacije s preskusnim materialom je treba izvajati v območju plamena alkoholne svetilke, da se prepreči kontaminacija materiala iz zunanjega okolja, pa tudi zaradi izpolnjevanja varnostnih predpisov.
Inokulacijo materiala na hranilnih medijih je treba opraviti najpozneje 2 uri od trenutka zbiranja.
Druga stopnja raziskave.Študija kolonij in izolacija čistih kultur. Po enem dnevu inkubacije se na posodicah razvijejo kolonije, pri prvem potegu je rast neprekinjena, pri naslednjih potehih pa izolirane kolonije. Kolonija je skupek mikrobov iste vrste, ki rastejo iz ene celice. Ker je material največkrat mešanica mikrobov, raste več vrst kolonij. Različne kolonije označimo s svinčnikom in jih obrobimo v krogu od spodaj ter jih proučujemo (tabela 11). Najprej se kolonije preučujejo s prostim očesom: makroskopski znaki. Skodelico pogledamo (ne da bi jo odprli) od spodaj v prepustni svetlobi, zabeležimo prosojnost kolonij (prozorna, če ne zastre svetlobe; prosojna, če delno zadrži svetlobo; neprozorna, če svetloba ne prehaja skozi kolonija) in izmeri se velikost kolonij (v mm). Nato preučujejo kolonije s strani pokrova, upoštevajo obliko (pravilna okrogla, nepravilna, ravna, konveksna), naravo površine (gladka, sijoča, motna, hrapava, nagubana, mokra, suha, sluzasta), barvo (brezbarven, obarvan).
Tabela 11. Shema za preučevanje kolonij
| № | Podpis | Možne značilnosti kolonij |
| 1. | Oblika | Ravna, konveksna, kupolasta, vdolbina, okrogla, rozeta, zvezda |
| 2. | Velikost, mm | Velika (4-5 mm), srednja (2-4 mm), majhna (1-2 mm), pritlikava (< 1 мм) |
| 3. | Površinski značaj | Gladka (oblika S), hrapava (oblika R), sluzasta (oblika M), progasta, grudasta, mat, sijoča |
| 4. | barva | Brezbarven, obarvan |
| 5. | Preglednost | Prozoren, neprozoren, prosojen |
| 6. | Značaj robov | Gladka, nazobčana, z resami, vlaknasta, nazobčana |
| 7. | Notranja struktura | Homogen, zrnat, heterogen |
| 8. | Doslednost | Viskozno, sluzasto, drobljivo |
| 9. | Emulgiranje v kapljici vode | Dobro slabo |
Opomba: točke 5-7 preučujemo pri majhni povečavi mikroskopa.
Še bolje lahko vidite razlike med kolonijami, če jih gledate s povečavo. Če želite to narediti, postavite zaprto skodelico z dnom navzgor na oder, rahlo spustite kondenzor, uporabite rahlo povečavo leče (x8), premaknite skodelico, preučite mikroskopske značilnosti kolonij: naravo roba ( gladka, valovita, nazobčana, nazobčana), struktura (homogena, zrnata, vlaknasta, homogena ali različna v središču in obrobju).
Nato se preučuje morfologija mikrobnih celic iz kolonij. Da bi to naredili, naredimo brise iz dela vsake od označenih kolonij in jih obarvamo po Gramu. Pri jemanju kolonij bodimo pozorni na konsistenco (suha, če se kolonija drobi in jo je težko pobrati; mehka, če jo jemljemo zlahka z zanko; sluzasta, če kolonijo vlečemo z zanko; trda, če je del kolonije ne vzamete z zanko, odstranite lahko le celotno kolonijo) .
Pri pregledu brisov se ugotovi, da kolonijo predstavlja ena vrsta mikroba, zato je mogoče izolirati čiste kulture bakterij. Da bi to naredili, proučevane kolonije ponovno posejemo na poševni agar. Pri ponovni setvi iz kolonij moramo paziti, da vzamemo točno tiste kolonije, ki so namenjene, ne da bi se z zanko dotaknili bližnjih kolonij. Epruvete označimo in inkubiramo v termostatu pri 37 °C 24 ur.
Tretja stopnja raziskave. Identifikacija izolirane kulture. Identifikacija mikrobov - določanje sistematičnega položaja kulture, izolirane iz materiala, do vrste in različice. Prvi pogoj za zanesljivo identifikacijo je brezpogojna čistost kulture. Za identifikacijo mikrobov se uporablja niz značilnosti: morfološke (oblika, velikost, prisotnost bičkov, kapsul, spor, relativni položaj v razmazu), tinktorialne (povezava z barvanjem po Gramu ali drugimi metodami), kemične (razmerje gvanin + citozin). v Molekula DNK), kulturna (prehranske potrebe, pogoji gojenja, hitrost in narava rasti na različnih hranilnih medijih), encimska (cepitev različnih snovi s tvorbo vmesnih in končnih produktov), serološka (antigenska struktura, specifičnost), biološka (virulentnost). za živali, toksigenost, alergenost, vpliv antibiotikov itd.).
Za biokemijsko diferenciacijo je pomembna sposobnost bakterij, da fermentirajo ogljikove hidrate s tvorbo vmesnih in končnih produktov, sposobnost razgradnje beljakovin in peptonov ter preučevanje redoks encimov.
Za preučevanje saharolitičnih encimov se izolirane kulture nacepijo v epruvete s poltekočim medijem, ki vsebuje laktozo, glukozo in druge ogljikove hidrate ter polihidrične alkohole. Pri poltekočih gojiščih se inokulacija izvede z vbrizgavanjem v globino gojišča. Pri sejanju z injekcijo epruveto z gojiščem držimo pod kotom, odstranimo zamašek in rob epruvete zažgemo. Material vzamemo s sterilno zanko in z njim skoraj do dna prebodemo stolpec hranilnega medija.
Za določitev proteolitičnih encimov izolirano kulturo nacepimo na peptonsko vodo ali MPB. To storite tako, da epruveto s cepivom vzamete v roko bližje sebi, epruveto z gojiščem pa bolj stran od sebe. Obe epruveti hkrati odpremo, z mezincem in robom dlani primemo njuni čepki, robove epruvet opečemo, s kalcinirano ohlajeno zanko zajamemo malo kulture in jo prenesemo v drugo epruveto, v tekočem mediju nadrobimo na steno epruvete in ga z medijem speremo.
Pri setvi in ponovni setvi je treba paziti na skladnost s pravili sterilnosti, da ne bi onesnažili svojih pridelkov s tujo mikrofloro in tudi ne onesnažili okolja. Epruvete označimo in postavimo v termostat za 24-urno inkubacijo pri 37 °C.
Zaključek
Računovodstvo rezultatov. Zaključek študije. Upoštevajo se rezultati identifikacije in na podlagi celotnega dobljenih podatkov, na podlagi razvrstitve in značilnosti tipičnih sevov, opisanih v priročniku (Burgeejev ključ, 1994-1996), se določi tip izoliranih posevkov.
Za pregled vzorcev na prisotnost določenih bakterij se uporabljajo različne diagnostične metode, vključno z bakterioskopsko metodo. V tem članku bomo obravnavali značilnosti te metode, pa tudi metodo bakteriološke raziskave.
Bistvo bakterioskopske diagnostične metode
Bakterioskopska metoda preučevanja vzorca je namenjena identifikaciji mikroorganizmov v proučevani snovi, pa tudi podrobnemu preučevanju lastnosti teh mikroorganizmov, razjasnitvi njihove količine in obnašanja v obravnavanem okolju. Prednosti tega načina preučevanja analiz so enostavnost, hitrost in dostopnost. Izvaja se lahko v skoraj katerem koli laboratoriju z minimalnim številom instrumentov in kemičnih reagentov. Njegove pomanjkljivosti vključujejo nezmožnost pridobitve popolne slike o vedenju mikrobov.
Materiali, potrebni za raziskavo
Za preučevanje analiz z uporabo bakterioskopske metode so potrebna naslednja orodja:
- Kovinska zanka.
- Zdrs. Ta predmet mora biti čist, saj lahko vsaka kontaminacija vpliva na stanje vzorca.
- Pinceta.
- Filtrirni papir.
Nova stekelca očistimo z 1% raztopino sode. Po vrenju v takšni raztopini steklo speremo z destilirano vodo, šibko raztopino klorovodikove kisline in nato ponovno z destilirano vodo. Uporabljeno steklo očistimo v več fazah: najprej ga damo v raztopino žveplove kisline za 60-120 minut, nato prekuhamo v raztopini sode, nato pa steklo speremo z vodo. Po tem se kozarec potopi v medicinski alkohol.
Kozarce za instrumente shranjujte v alkoholu ali v tesno zaprtih posodah. Poleg tega mora biti v slednjem primeru steklo suho.
Za to študijo boste potrebovali tudi naslednje kemične reagente:
- Alkohol;
- Lugolova raztopina;
- Barvila.
Najpogosteje uporabljena barvila so fuksin Ziehl, metilen modro in karbolni encijan vijolet. Zadnje barvilo je raztopina navadnega fuksina v petodstotni karbolni vodi
Napredek študije
Kulturo lahko preučujete tako v izvirni kot v barvni obliki. V slednjem primeru bodo tako kolonije mikroorganizmov kot posamezne bakterije mrtve, kar nam omogoča, da se bolje seznanimo s strukturo teh preprostih organizmov. Pri pregledu zdravila v izvirni obliki laboratorijski tehnik prejme več informacij o aktivnosti mikrobov. V obeh primerih preparat pregledamo z mikroskopom.
Barvanje medija poteka v dveh stopnjah: najprej se pripravek pripravi za postopek in šele nato se obarva. Priprava vzorca poteka na naslednji način:
- Vzorec, namenjen raziskavi, se enakomerno porazdeli po steklu instrumenta v obliki kroga ali ovala. Če so v materialu tuje nečistoče (na primer gnoj), se pred dodajanjem preskusnega vzorca na kozarec nanese 1-2 kapljici vode.
- Po tem je treba nastali madež posušiti.
- Ko se madež posuši, ga je potrebno fiksirati s plamenom gorilnika.
Da bi ga pritrdili na ta način, steklo instrumenta trikrat podržite nad plamenom. Če je bris dovolj trdno fiksiran, bo laborant, ki izvaja poskus, začutil pekoč občutek v prstih.
Na koncu tega postopka se vzorec obarva.
Metode barvanja vzorcev
Barvanje je lahko tako preprosto kot uporaba enega samega barvila. In kompleksen, pri katerem se za natančno razlikovanje bakterijskih celic glede na eno ali drugo značilnost na vzorec zaporedno nanese več različnih kemičnih reagentov za barvanje. Primer kompleksnega barvanja sta metodi po Gramu in Ziehl-Neelsenu.
Metoda po Gramu
Gramova metoda vam omogoča, da določite kemično sestavo celične membrane. Zahvaljujoč tej metodi je bila uvedena klasifikacija bakterij po Gramu: gram-pozitivne bakterije (ki vključujejo povzročitelje številnih bolezni) po obarvanju pridobijo temno vijolično barvo in gram-negativne bakterije - značilen rdeč odtenek. Metoda po Gramu je sestavljena iz naslednjih korakov:
- Najprej se zdravilo eno minuto obdeluje z Lugolovo raztopino.
- Po obdelavi z Lugolom se vzorec pobeli z alkoholom.
- Nato preparat speremo z destilirano vodo in dodatno obarvamo s fuksinom.
Ziehl-Neelsenova metoda
Metoda Ziehl-Neelsen se uporablja za določanje kislinsko občutljivih bakterij, katerih celične membrane vsebujejo veliko količino lipidov, na primer povzročiteljev tuberkuloze. Delo po tej metodi poteka v petih fazah:
- Filtrirni papir položimo na stekelce, na katerega nato nanesemo majhno količino fuksina Ziehl.
- Stekelec se nato segreva, dokler se ne pojavi značilna para. Ko se pojavi para, pustimo, da se steklo ohladi. Ta postopek ponovimo še dvakrat, nato pa pustimo, da se kozarec ponovno ohladi.
- Po tem sperite škrlatno barvo s stekla instrumenta z destilirano vodo, potem ko ste odstranili papir.
- Kozarec nato postavimo v raztopino klorovodikove ali žveplove kisline, dokler vzorec popolnoma ne izgubi barve.
- Nazadnje na beljeni preparat nanesemo raztopino metilen modrega, steklo speremo z destilirano vodo in pustimo, da se posuši za nadaljnjo preiskavo nastalega preparata pod mikroskopom.
Lefflerjeva metoda
Preproste metode obarvanja vključujejo Lefflerjevo metodo. Z njim modrijo vse bakterije. Ta metoda se izvaja v dveh korakih:
- Na razmaz položimo filtrirni papir, na katerega nanesemo Loefflerjevo raztopino metilen modrega. Zdravilo pustimo v tem stanju 3-5 minut.
- Po tem času preparat speremo z vodo in posušimo, nato pa ga lahko pregledamo pod mikroskopom.
Z bakterioskopsko metodo obarvamo najmanj dva preparata, od tega enega po enostavni metodi, enega pa po kompleksni metodi.
Bakteriološka metoda
Pogosto je pri preučevanju testov potrebno določiti občutljivost patogena na določeno zdravilo. V tem primeru se vzorec pregleda z bakteriološko metodo. Ta metoda je sestavljena iz naslednjih korakov:
- Najprej je potrebno očistiti kulturo, da bi identificirali specifične vrste mikrobov. Da bi to naredili, je treba vzorec postaviti v okolje, v katerem je razvoj bakterij, ki jih želimo odkriti, najbolj verjeten. Možno je tudi mehansko ločevanje biomateriala med setvijo.
- Po pridobitvi čiste kulture se iz nje odvzeti vzorci pregledajo z bakterioskopsko metodo.
Sledijo primeri gojišč, ki se uporabljajo za odkrivanje mikroorganizmov:
- Elschnigov medij, sestavljen iz ene tretjine konjskega seruma in dveh tretjin juhe.
- Loefflerjev serum, ki se uporablja za identifikacijo povzročiteljev davice. Ta medij je sestavljen iz treh četrtin konjskega ali govejega seruma in ene četrtine juhe, ki vsebuje 1 % glukoze.
- Krvni agar, ki se uporablja za identifikacijo streptokokov in testiranje njihove občutljivosti na antibakterijska zdravila. Ta medij je sestavljen iz 5-10 % živalskega krvnega seruma in agarja.
Vrste bakterioskopskih testov
Bakterioskopija testov blata
Za bakterioskopsko preiskavo analize blata je potreben vzorec bolnika. Če je treba analizirati črevesno mikrofloro, katere motnje v sestavi kažejo na prisotnost disbakterioze ali nalezljive bolezni prebavnega sistema, se vzorec vzame z zanko, ki se vstavi v anus približno 10 centimetrov globoko.
Pri pregledu vzorca blata se lahko odkrijejo naslednji nevarni mikroorganizmi:
- Stafilokoki.
- Klebsiella, katere prisotnost kaže na poškodbo debelega črevesa.
- Pseudomonas aeruginosa, ki proizvaja človeku izjemno nevarne toksine.
Prisotnost Pseudomonas aeruginosa v človeškem telesu lahko povzroči zastrupitev krvi in meningitis – bolezni, ki sta lahko usodni.
Bakterioskopija urinskih testov
Preiskava urina za bakterioskopsko preiskavo se opravi, če obstaja sum na vnetje sečil in prisotnost bolezni, kot sta pielonefritis in cistitis, katerih povzročitelji so E. coli in nekateri povzročitelji spolno prenosljivih bolezni. Za takšno preiskavo potrebujemo od 50 do 100 ml urina, urin pa shranjujemo v sterilni posodi. Preden opravite test, se morate dobro umiti, da bo v urinu manj tujih nečistoč. Med menstruacijo ni priporočljivo darovati urina.
Bakterioskopska analiza urina je nepogrešljiva pri odkrivanju bolezni sečil pri dojenčkih. V tem primeru se urin zbira skozi kateter v sterilno posodo. Preiskavo vzorca urina je treba opraviti čim prej, sicer bo odkrivanje povzročiteljev bolezni težko.
Bakterioskopija sputuma
Pri analizi sputuma se pregledata dva razmaza. Enega od njih preučujejo na prisotnost Kochovega bacila, povzročitelja tuberkuloze. Na podlagi rezultatov druge študije se sklepa o prisotnosti drugih mikrobov v sputumu.
Za analizo sputuma na tuberkulozo se vzorec obarva z metodo Ziehl-Neelsena.
Za testiranje prisotnosti drugih mikrobov se vzorec obarva po Gramu. Z bakterioskopsko metodo z barvanjem po Gramu je mogoče identificirati pnevmokok, bakterijo, ki povzroča pljučnico. Tudi pri delu z vzorcem po tej shemi je mogoče zaznati prisotnost streptokokov v sputumu - povzročiteljev vnetja grla, pa tudi Staphylococcus aureus. Slednji mikroorganizem predstavlja posebno nevarnost za zdravje ljudi. Izzove gnojne procese in nastanek abscesov, tudi na notranjih organih.
Naj povzamemo
Bakterioskopska diagnostična metoda je ena glavnih raziskovalnih metod v mikrobiologiji. Kljub svojim pomanjkljivostim se ta metoda v sodobni medicini pogosto uporablja za diagnosticiranje najrazličnejših bolezni, od katerih so nekatere, na primer tuberkuloza, še posebej nevarne za ljudi.
9971 0
Uporaba bakteriološke metode omogoča izolacijo patogena v čisti kulturi iz materiala, pridobljenega od pacienta, in njegovo identifikacijo na podlagi študije niza lastnosti. Večina bakterij je sposobna gojenja na različnih umetnih hranilnih gojiščih (razen klamidije in rikecije), zato je bakteriološka metoda pomembna pri diagnostiki številnih nalezljivih bolezni.
Če je rezultat pozitiven, bakteriološka metoda omogoča določitev občutljivosti izoliranega patogena na protimikrobna zdravila. Vendar pa je učinkovitost te študije odvisna od številnih parametrov, zlasti od pogoji za zbiranje gradiva in njega prevoz v laboratorij.
TO osnovne zahteve Zahteve za izbiro in prevoz materiala za bakteriološke raziskave vključujejo:
- jemanje materiala pred začetkom etiotropnega zdravljenja;
- skladnost s sterilnimi pogoji pri zbiranju materiala;
- tehnična pravilnost zbiranja gradiva;
- zadostna količina materiala;
- zagotavljanje temperaturnih pogojev za skladiščenje in transport materiala;
- zmanjšanje časovnega intervala med zbiranjem materiala in setvijo na trdnih hranilnih medijih.
Prevoz materiala v laboratorij je treba opraviti čim prej, vendar ne več kot v 1-2 urah po odvzemu. Vzorce materiala je treba hraniti pri določeni temperaturi; zlasti običajno sterilne materiale (kri, cerebrospinalna tekočina) hranimo in dostavljamo v laboratorij pri 37 °C. Nesterilne materiale (urin, izločke dihal itd.) hranimo pri sobni temperaturi največ 1-2 uri oziroma največ en dan pri 4 °C (pogoji domačega hladilnika). Če vzorcev ni mogoče dostaviti v laboratorij v predpisanem roku, je priporočljiva uporaba transportnih medijev, namenjenih ohranjanju viabilnosti patogenov v pogojih shranjevanja.
Kri za raziskave je treba vzeti bolniku v obdobju naraščajoče telesne temperature, na začetku pojava vročine. Priporočljivo je pregledati 3-4 vzorce krvi, odvzete v intervalih 4-6 ur, kar je upravičeno z vidika zmanjšanja tveganja "manjkajoče" prehodne bakteriemije in povečanja možnosti potrditve etiološke vloge izolirane oportunistične mikroflore. iz krvi, če se ta mikroflora odkrije v več vzorcih venske krvi. Vzorec krvi v količini 10 ml za odraslega in 5 ml za otroka nacepimo v najmanj dve steklenički z gojiščem za aerobne in anaerobne mikroorganizme v razmerju 1:10. Priporočljiva je ena študija arterijske krvi.
Vzemi cerebrospinalna tekočina(CSF) proizvaja zdravnik med lumbalno punkcijo v količini 1-2 ml v suho sterilno epruveto. Vzorec takoj dostavimo v laboratorij, kjer takoj začnemo tudi z njegovim pregledom. Če to ni mogoče, material hranimo več ur pri 37 °C. Bistveno poveča število pozitivnih rezultatov bakteriološke preiskave z inokulacijo 1-2 kapljic CSF v epruveto, ki vsebuje poltekoči medij z glukozo in v petrijevko s "krvnim" agarjem. Za pošiljanje materiala uporabite izotermne škatle, grelne blazine, termovke ali drugo embalažo, kjer se vzdržuje temperatura okoli 37 °C.
Iztrebki za bakteriološke raziskave vzamemo 3-5 g s sterilnimi lesenimi lopaticami v sterilno posodo s tesno prilegajočim pokrovom. Preiskavo odvzetega materiala je treba začeti najkasneje 2 uri kasneje, če preiskave v tem času ni mogoče začeti, je treba odvzeti manjšo količino materiala in jo položiti v ustrezen transportni medij. Pri zbiranju blata si je treba prizadevati za pošiljanje patoloških nečistoč (sluz, gnoj, epitelijski delci itd.) Če obstajajo, se izogibati vnosu krvnih nečistoč, ki imajo baktericidne lastnosti, v material.
Za zbiranje materiala lahko uporabite rektalne brise (z vatirano konico). Bris je treba navlažiti s sterilno izotonično raztopino natrijevega klorida ali transportnim medijem (vendar ne z oljnim gelom). Vnesemo ga per rektum do globine 5-6 cm in z obračanjem tampona previdno odstranimo, spremljamo videz fekalne barve na tamponu. Bris damo v suho epruveto, če se študija materiala začne v 2 urah, drugače - v transportnem mediju.
jezim se(povprečni delež prosto sproščenega urina) v količini 3-5 ml zberemo v sterilno posodo po temeljitem toaletnem delu zunanjih genitalij. Bolje je zbirati urin zjutraj.
Žolč zbrani med duodenalno intubacijo v sobi za zdravljenje ločeno v delih A, B in C v tri sterilne epruvete ob upoštevanju pravil asepse.
Voda za izpiranje želodca zbrani v sterilnih kozarcih v količini 20-50 ml. Upoštevati je treba, da se v teh primerih izpiranje želodca izvaja samo z indiferentnimi (brez bakteriostatičnega ali baktericidnega učinka na mikroorganizme) raztopinami - po možnosti z vrelo vodo (brez dodajanja sode, kalijevega permanganata itd.).
izpljunek. Jutranji izpljunek, ki se sprosti med napadom kašlja, se zbere v sterilni kozarec. Pred kašljanjem si bolnik umije zobe in spere usta s prekuhano vodo, da mehansko odstrani ostanke hrane, luščeni epitelij in ustno mikrofloro.
Voda za izpiranje bronhijev. Med bronhoskopijo se injicira največ 5 ml izotonične raztopine natrijevega klorida, čemur sledi odsesavanje v sterilno cevko.
Izcedek iz žrela, ust in nosu. Material iz ustne votline se vzame na prazen želodec ali 2 uri po obroku s sterilno vatirano palčko ali žlico iz sluznice in njenih prizadetih območij na vhodih v kanale žlez slinavk, s površine jezika in od razjed. Če obstaja film, ga odstranite s sterilno pinceto. Material iz nosne votline odvzamemo s suho sterilno vatirano palčko, ki jo vstavimo globoko v nosno votlino. Material iz nazofarinksa odvzamemo s sterilno posteriorno faringealno vatirano palčko, ki jo previdno vstavimo skozi nosno odprtino v nazofarinks. Če se začne kašelj, tampona ne odstranimo, dokler kašelj ne mine. Za testiranje na davico sočasno pregledamo filme in sluz iz nosu in grla, pri čemer material vzamemo z različnimi brisi.
Testni material s posebnimi tehnikami nacepimo na trdna hranilna gojišča, da dosežemo rast posameznih kolonij mikroorganizmov, ki jih nato presejemo, da izoliramo čisto kulturo povzročitelja.
Določene vrste bakterij izoliramo s selektivnimi gojišči, ki zavirajo rast tujih mikroorganizmov ali vsebujejo snovi, ki spodbujajo rast določenih patogenih mikrobov.
Mikroorganizmi izolirani na hranilnih gojiščih identificirati, tj. določi njihovo vrsto ali vrsto. V zadnjem času se za identifikacijo v zdravstveni praksi uporabljajo mikrotestni sistemi, ki so plošče z naborom diferencialno diagnostičnih okolij, kar pospeši raziskavo. Mikrotestni sistemi se uporabljajo tudi za določanje občutljivosti mikroorganizmov na protimikrobna zdravila z redčenjem antibiotika v tekočem hranilnem mediju.
Pri ocenjevanju rezultatov bakteriološke študije mora zdravnik upoštevati, da negativni rezultat ne pomeni vedno odsotnosti patogena in je lahko povezan z uporabo protimikrobnih zdravil, visoko mikrocidno aktivnostjo krvi in tehničnimi napakami. Odkrivanje patogenega mikroba v materialu bolnika, ne glede na klinično sliko, je možno v primeru rekonvalescentne, zdrave ali prehodne bakterijske okužbe.
Izolacijo oportunističnih mikroorganizmov (staphylococcus epidermidis, Escherichia coli) in celo saprofitov iz krvi ob upoštevanju vseh aseptičnih pravil je treba obravnavati kot manifestacijo bakteriemije, zlasti če so ti mikrobi najdeni v več kot enem vzorcu materiala ali v različnih substratih ( kri, urin), saj so lahko ti in drugi "nepatogeni" mikroorganizmi z zmanjšanjem imunoreaktivnosti telesa povzročitelji infekcijskih procesov, vključno s sepso.
Obstaja določena težava interpretacija rezultatov bakteriološke preiskave nesterilnih gojišč, in sicer dokaz etiološke vloge oportunističnih mikroorganizmov. V tem primeru se upoštevajo takšni kazalniki, kot so vrsta izoliranih kultur, število mikrobnih celic določene vrste v materialu, njihova ponavljajoča se izolacija med boleznijo, prisotnost monokulture ali združenja mikroorganizma.
Yushchuk N.D., Vengerov Yu.Ya.
Bakteriološka (kulturna) metoda
niz metod za umetno gojenje mikroorganizmov na hranilnih medijih za njihovo identifikacijo pri ugotavljanju nalezljive bolezni ali drugega procesa, ki ga povzročajo mikrobi, in za določitev številnih fizioloških lastnosti za druge namene, na primer pri izbiri zdravila za kemoterapijo. Sodobne metode za preučevanje večine biol. Lastnosti bakterij možni le, če obstaja čisto vodo(cm.). Kontaminacija zelišča z drugimi vrstami mikrobov praviloma vodi do izkrivljenih rezultatov in napačnih zaključkov. Zato je prva naloga B.m. je pridobiti čisto travo katere koli vrste (var) iz mikrobne asociacije in preprečiti kontaminacijo s tujo mikrofloro materiala za raziskave in mikrobne kulture na vseh stopnjah študije. To je mogoče pri zbiranju materiala v sterilnih pogojih v sterilne posode, inokulaciji materiala v sterilna gojišča s sterilnim instrumentom, preprečevanju vstopa mikrobov iz zraka med dostavo, skladiščenju in inkubaciji materiala in inokuliranih hranilnih gojišč. Druga naloga B.m. - mikrobna identifikacija(glej) izolirana čista zelišča, tretji je določanje dodatnih lastnosti, na primer občutljivost na antibiotike, virulenca. Faze B.M.: 1) zbiranje gradiva (glej. Materiali za raziskave) in njegovo dostavo bakterijam. laboratorij; 2) mikroskopske raziskave. material (glej Bakterioskopska metoda). Tega koraka pogosto ne izvedemo, čeprav je kljub manjši občutljivosti pri nekaterih predhodna mikroskopija primerih zagotavlja približne informacije o patogenu in vam omogoča izbiro medija, potrebnega za inokulacijo; 3) obdelava raziskav. fizični material ali kem. dejavnikov za odstranitev ali zmanjšanje tuje mikroflore. Ta ukrep se uporablja na primer pri pregledu sputuma, izolaciji kislinsko odpornih mikrobov in mikrobov, ki tvorijo spore; 4) setvene raziskave. material (glej bakteriološke kulture) na hranilnih medijih za pridobitev izoliranih kolonij; 5) inkubacija inokuliranih hranilnih gojišč. Čas in temperatura inkubacije sta odvisna od pričakovane vrste rastline. Običajno se pridelki hranijo v termostatu pri 37 °C 1-2 dni. Če rasti ni, lahko inkubacijsko dobo podaljšamo še za 2 do 3 dni. Za daljšo inkubacijo je treba preprečiti izsušitev gojišča, za kar se pridelki dajo v eksikator z vodo ali pa se zamaški cevi napolnijo s parafinom; 6) raziskave kolonije(cm.). Za študijo se izberejo homogene izolirane kolonije, ki se nahajajo daleč od robov posode in vzdolž poteze zanke, obdane s črto in oštevilčene. Če se študija izvaja na neusmerjen način (polietiološki proces itd.), Potem se na podlagi rezultatov vizualnega pregleda izberejo 2-3 kolonije vseh vrst, ki so prisotne na plošči, in iz njih naredijo razmaze; 7) ponovno sejanje iz izbranih kolonij na akumulacijske medije. Da bi to naredili, so iz preostalega dela kolonije v razmazu reza identificirali bakterije enotne oblike in barve; z zanko, ki se poskuša ne dotikati sosednjih kolonij, vzamemo del bakterij in jih nacepimo na MPA poševna v epruveti ali posebnem mediju s črto; 8) inkubacija pridelkov v termostatu, dokler se ne pojavi stalna rast (običajno 1-2 dni); 9) ugotavljanje čistosti trave, vzgojene na poševnih gojiščih, z makroskopskim pregledom rasti in mikroskopiranjem razmaza z njega; 10) identifikacija izolirane čiste trave in po potrebi (na zahtevo klinika, epidemiologa) določitev različnih biol. sv-v; 11) sklep o vrstni pripadnosti izbrane vrste in njenih lastnostih. Zaključek je podan na uradnem obrazcu s sklicevanjem na številko, pod Krim je ta rastlina vpisana v laboratorijski dnevnik. B.m. je glavni v prehrani večine bakterij. okužbe. Praviloma ima visoko občutljivost, ki omogoča razlikovanje od raziskav. čisti material, tudi če je začetni odmerek materiala vseboval več deset osebkov. Za B.m. značilna visoka specifičnost. Izolacija ene ali druge vrste bakterij iz patološkega materiala ob upoštevanju številnih pogojev (glej. Povzročitelj bolezni) zanesljivo ugotavlja etiologijo patološkega procesa. Izjema so oportunistične bakterije, avtohtone za določen biotop, za določanje etiola. Njegova vloga zahteva posebna merila, pa tudi razlikovanje med prenašalcem in boleznijo (na primer prenašanje davice pri streptokoknem vnetju grla). Vrednost B.m. je tudi v tem, da je z njegovo pomočjo mogoče določiti zdravila, potrebna za predpisovanje kemoterapije in seroterapije, ugotavljanje vira okužbe in mehanizmov prenosa povzročitelja ter izbiro protiepidemičnih ukrepov. Končno je B.m. nanaša na zgodnje metode d-ki. Slabosti B. m. - nevarnost okužbe, zapletenost, intenzivnost dela, trajanje. Zanesljive podatke o sestavi mikroflore in njenih lastnostih je mogoče pridobiti le s preučevanjem vzorca 3-10 flore.
