Principalele etape ale cercetării virologice. Studii virologice. Folosind Time Machine

Cercetarea virologică în clinica bolilor infecțioase devine din ce în ce mai importantă valoare mai mare, care se datorează în primul rând creșterii proporției infecțiilor virale, al căror tablou clinic nu este întotdeauna tipic. În același timp, metode rapide și fiabile de diagnostic virusologic nu au fost dezvoltate pentru toate bolile infecțioase; multe dintre ele necesită forță de muncă intensă și necesită conditii speciale, animale experimentale, medii de cultură și personal instruit. Momentan pentru diagnosticare infecții virale Ei folosesc 3 tipuri principale de cercetare.
1. Examinarea microscopică a materialului infecțios pentru a identifica antigenul viral sau modificările patognomonice în țesuturi. În scopuri de diagnostic, direct examinare microscopica materialul infectios de la pacienti este folosit pentru un numar limitat de infectii virale (rabie, varicela, febra galbena, herpes etc.). O metodă bazată pe detectarea antigenului viral folosind anticorpi fluorescenți a devenit mai utilizată. Metoda imunofluorescenței poate fi de încredere numai dacă toate cerințele tehnice sunt strict îndeplinite.
2. Metode virologice.
3. Studii serologice pentru determinarea creșterii titrului de anticorpi pe parcursul bolii. Metodele de cercetare serologică sunt mai accesibile în condiții de laborator.
Pentru aceste studii, este necesar să se ia ser sanguin în perioada acută a bolii și în perioada de convalescență (seruri împerecheate). Probe de sânge pentru studii serologice luate steril fără anticoagulante și conservanți.
Principalele etape ale cercetării virologice sunt izolarea virusurilor, identificarea acestora și caracterizarea proprietăților biologice de bază. În prezent, nu există o metodă unificată pentru izolarea diferitelor grupuri de viruși. Acest lucru se datorează în primul rând diversității proprietăților lor și particularităților cultivării în afara organismului gazdă. Pentru cercetare se folosesc biosubstrate (spălări de pe mucoase, sânge și componente ale acestuia, lichid cefalorahidian, urină și fecale, biopsii de organe și țesuturi sau bucăți din acestea prelevate în timpul autopsiei), care sunt supuse unei prelucrări speciale urmate de trecerea materialului. Materialul luat pentru cercetare trebuie păstrat la o temperatură de la -20 °C la -70 °C. În funcție de diagnosticul preliminar, prelucrarea materialului are propriile sale caracteristici, dar în toate cazurile se presupune că se obține un substrat care este purificat la maxim din impuritățile de mucus, celulele organelor și țesuturilor sau fragmentele acestora și bacterii. Acest lucru se realizează prin omogenizarea materialului studiat într-un aparat special sau prin măcinarea lui într-un mortar de porțelan la rece cu sticlă de cuarț (bucăți de organe și țesuturi) cu adaos de refrigerat steril (+4 C) 0,9 %

soluție de clorură de sodiu până se obține o suspensie 10-30% și centrifugare ulterioară la 1500-3000 rpm timp de 10-15 minute. Lichidul supernatant astfel obținut este utilizat pentru cercetări ulterioare.
Inainte de dezvoltare intensivăși s-a folosit introducerea în practica pe scară largă a metodei culturii de țesuturi și celule, infectarea animalelor de experiment sau a embrionilor de pui. Aceste metode sunt folosite și astăzi. Detectarea virusurilor folosind animale este cea mai potrivită în cazurile în care este posibilă reproducerea unei imagini tipice într-un experiment boală infecțioasă sau manifestările sale individuale. Astfel, agenții patogeni ai grupului de arbovirusuri și Coxsackie pot fi detectați prin infecția în creierul șoarecilor care alăptează, gripa prin infectarea embrionilor de pui sau administrarea intranazală a materialului de testat la șoareci. În laboratoarele de virologie din anul trecut Metoda culturii celulare și tisulare a devenit cea mai utilizată, făcând posibilă izolarea adenovirusurilor, virusurilor herpetice, virusului sincițial respirator, mixovirusurilor și altele, și efectuarea diagnosticului etiologic al bolii în primele etape ale cercetării. Baza pentru aceasta este caracteristicile citologice bine studiate ale interacțiunii majorității virusurilor și celulelor. Astfel, infecția celulelor HeLa, Hep-2 cu material care conține adenovirus tip 2, deja în a 3-a zi duce la o modificare a modelului de creștere a monostratului celular și la apariția celulelor tipice sub formă de ciorchini de struguri etc. , bine definit la microscopul obișnuit la o mărire redusă.
De o importanță excepțională pentru diagnosticul etiologic al unei boli infecțioase este standardizarea izolării virusului din materialul de testat, care în această etapă Lucrarea implică utilizarea animalelor liniare pure din punct de vedere genetic, ținând cont de caracteristicile fenotipice (în primul rând de vârstă) ale acestora. Acest lucru se datorează în primul rând faptului că animalele experimentale de diferite linii genetice și vârste în grade diferite sensibile la viruși. Astfel, în timpul infecției intracerebrale a șoarecilor cu tulpina neurotropă WSN a virusului gripal, sensibilitatea animalelor din liniile BALB/c, A, CBA și în consanguinitate a fost cea mai mare; același model s-a stabilit și în cazurile de administrare intranazală a testului. material. Esential pentru rezultate finale munca privind izolarea virusului implică o examinare preliminară a animalelor, a embrionilor de pui, a culturilor de celule și țesuturi pentru transportul latent al virusului. Embrionii de pui, care sunt utilizați pe scară largă în practica de laborator, pot fi infectați cu viruși de leucemie aviară, encefalomielita aviară, sinuzită infecțioasă, psitacoză, boala Newcastle și agenți patogeni ai unora. infecții bacteriene(febră paratifoidă etc.), precum și micoplasme. Mai mult număr mai mare agenții bacterieni și în special virali sunt capabili să infecteze spontan celulele și țesuturile cultivate și să supraviețuiască în ele. Prezența lor afectează semnificativ evaluarea materialului studiat. Unele tipuri de micoplasme în cultura celulară
poate provoca hemaglutinare și hemadsorbție și chiar să formeze plăci similare cu cele formate de viruși sub învelișul de agar. Contaminarea culturilor celulare de un tip de către altele este, de asemenea, de importanță nu mică, cel mai adesea aceasta este asociată cu celulele HeLa și se observă atunci când se lucrează cu diferite tipuri de culturi în aceeași cameră, când sticla de laborator este slab procesată etc. de contaminare a culturilor celulare sau infectarea animalelor cu agenți bacterieni, cum ar fi De regulă, se manifestă destul de clar (modificări ale modelului de creștere al unui monostrat de celule, proprietățile mediului de cultură, moartea embrionilor de pui sau a animalelor). cu anumite simptome etc.) și nu prezintă dificultăți deosebite în evaluarea rezultatelor. Situația este mai complicată cu formele latente de infecție, unde este necesară utilizarea metodelor serologice și a altor metode. Aceste instrucțiuni trebuie luate în considerare în munca unui virolog, în special atunci când se efectuează diagnosticul etiologic al cazurilor neclare ale bolii.

Metode de cercetare virologică

metode de studiere a biologiei virusurilor si de identificare a acestora. În virologie, metodele de biologie moleculară sunt utilizate pe scară largă, cu ajutorul cărora a fost posibilă stabilirea structurii moleculare a particulelor virale, a metodelor de penetrare a acestora în celulă și a caracteristicilor reproducerii virale, a structurii primare a acizilor nucleici virali și a proteinelor. Sunt în curs de dezvoltare metode pentru a determina secvența elementelor constitutive ale acizilor nucleici virali și ale aminoacizilor proteici. Devine posibilă legarea funcțiilor acizilor nucleici și proteinelor pe care le codifică cu secvența de nucleotide și stabilirea cauzelor proceselor intracelulare care joacă un rol important în patogenia infecției virale.

Metodele de cercetare virologică se bazează și pe procese imunologice (interacțiunea antigenului cu anticorpii), proprietățile biologice ale virusului (capacitatea de hemaglutinare, hemoliză, activitate enzimatică), caracteristicile interacțiunii virusului cu celula gazdă (natura efectului citopatic). , formarea de incluziuni intracelulare etc.) .

În diagnosticul infecțiilor virale, în cultivarea, izolarea și identificarea virusurilor, precum și în producerea preparatelor de vaccin, metoda culturii de țesut și celule este utilizată pe scară largă. Se folosesc culturi de celule primare, secundare, stabile continue și diploide. Culturile primare se obțin prin dispersarea țesutului cu enzime proteolitice (tripsină, colagenază). Sursa celulelor poate fi țesuturile și organele (de obicei rinichii) embrionilor umani și animale. O suspensie de celule într-un mediu nutritiv este plasată în așa-numitele saltele, sticle sau vase Petri, unde, după atașarea la suprafața vasului, celulele încep să se înmulțească. Pentru infecția cu virus, se folosește de obicei un monostrat celular. Se scurge lichidul nutritiv, se adauga suspensia virala in anumite dilutii, iar dupa contactul cu celulele se adauga mediu nutritiv proaspat, de obicei fara ser.

Celulele majorității culturilor primare pot fi subcultivate; o astfel de cultură se numește cultură secundară. Odată cu trecerea ulterioară a celulelor, se formează o populație de celule asemănătoare fibroblastelor, capabile de reproducere rapidă, majoritatea care păstrează setul original de cromozomi. Acestea sunt așa-numitele celule diploide. Prin cultivarea în serie a celulelor, se obțin culturi de celule continue stabile. În timpul trecerilor, apar celule omogene cu diviziune rapidă cu un set heteroploid de cromozomi. Liniile celulare stabile pot fi cu un singur strat sau în suspensie. Culturile cu un singur strat cresc sub forma unui strat continuu pe suprafața sticlei, în timp ce culturile în suspensie cresc sub formă de suspensii în diferite vase folosind dispozitive de amestecare. Există mai mult de 400 de linii celulare derivate din 40 tipuri variate animale (inclusiv primate, păsări, reptile, amfibieni, pești, insecte) și oameni.

Bucăți de organe și țesuturi individuale (culturi de organe) pot fi cultivate în medii nutritive artificiale. Aceste tipuri de culturi păstrează structura țesuturilor, ceea ce este deosebit de important pentru izolarea și trecerea virusurilor care nu se reproduc în culturi de țesut nediferențiate (de exemplu, coronavirusuri).

În culturile de celule infectate, virusurile pot fi detectate prin modificări ale morfologiei celulare, efecte citopatice, care pot fi specifice, apariția incluziunilor, prin determinarea antigenelor virale în celulă și în fluidul de cultură; stabilirea proprietăților biologice ale descendenților virali în fluidul de cultură și titrarea virusurilor în cultura de țesuturi, embrioni de pui sau animale sensibile; prin identificarea acizilor nucleici virali individuali în celule prin hibridizare moleculară sau acumulări de acizi nucleici prin metoda citochimică folosind microscopia fluorescentă.

Izolarea virușilor este un proces care necesită multă muncă și mult timp. Se efectuează pentru a determina tipul sau varianta virusului care circulă în rândul populației (de exemplu, pentru a identifica o serovariantă a virusului gripal, o tulpină sălbatică sau vaccinală a virusului poliomielitei etc.); în cazurile în care este necesar să se efectueze măsuri epidemiologice urgente; când apar noi tipuri sau variante de viruși; dacă este necesar, confirmați diagnosticul preliminar; pentru a indica viruși în obiecte mediu inconjurator. La izolarea virusurilor se ia în considerare posibilitatea persistenței acestora în corpul uman, precum și apariția unei infecții mixte cauzate de doi sau mai mulți viruși. O populație omogenă genetic a virusului obținută dintr-un virion se numește clonă virală, iar procesul de obținere a acesteia se numește clonare.

Pentru a izola virusurile, se folosește infecția animalelor de laborator susceptibile și a embrionilor de pui, dar cel mai adesea se utilizează cultura de țesut. Prezența unui virus este determinată de obicei de degenerarea celulară specifică (efect citopatic), formarea de simplaste și sinciții, detectarea incluziunilor intracelulare, precum și un antigen specific detectat prin imunofluorescență, hemadsorbție, hemaglutinare (pentru virusurile hemaglutinante), etc. . Aceste semne pot fi detectate numai după 2-3 treceri ale virusului.

Pentru izolarea unui număr de virusuri, cum ar fi virusurile gripale, se folosesc embrioni de pui, iar pentru izolarea unor virusuri Coxsackie și a unui număr de arbovirusuri se folosesc șoareci nou-născuți. Identificarea virusurilor izolate se realizează folosind reacții serologice si alte metode.

Când se lucrează cu viruși, se determină titrul acestora. Titrarea virusurilor se efectuează de obicei în cultura de țesuturi, determinând cea mai mare diluție a lichidului care conține virus la care are loc degenerarea țesuturilor, se formează incluziuni și antigene specifici virusului. Metoda plăcii poate fi utilizată pentru a titra un număr de viruși. Plăcile, sau coloniile negative de viruși, sunt focare de celule distruse de virus într-o cultură de țesut cu un singur strat sub o acoperire cu agar. Numărarea coloniilor permite analiza cantitativa activitatea infecțioasă a virusurilor pe baza calculului că o particulă de virus infecțios formează o placă. Plăcile sunt detectate prin colorarea culturii cu coloranți intravitali, de obicei roșu neutru; plăcile nu adsorb colorantul și, prin urmare, sunt vizibile ca pete luminoase pe fundalul celulelor vii colorate. Titrul virusului este exprimat ca număr de unități formatoare de placă pe 1 ml.

Purificarea și concentrarea virusurilor se realizează de obicei prin ultracentrifugare diferențială urmată de centrifugare cu gradient de concentrație sau densitate. Pentru purificarea virusurilor se folosesc metode imunologice, cromatografia de schimb ionic, imunosorbenti etc.

Diagnosticul de laborator al infecțiilor virale include detectarea agentului patogen sau a componentelor acestuia în materialul clinic; izolarea virusului din acest material; serodiagnostic. Alegerea unei metode de diagnostic de laborator în fiecare caz special depinde de natura bolii, perioada bolii și capacitățile laboratorului. Diagnosticare modernă infecțiile virale se bazează pe metode expres care vă permit să obțineți un răspuns la câteva ore după ce ați luat material clinic întâlniri timpurii după boală, Acestea includ microscopia electronică și imună electronică, precum și imunofluorescența, metoda de hibridizare moleculară, detectarea anticorpilor din clasa IgM etc.

Microscopia electronică a virușilor colorați negativ face posibilă diferențierea virușilor și determinarea concentrației acestora. Utilizarea microscopiei electronice în diagnosticul infecțiilor virale este limitată la acele cazuri în care concentrația de particule virale în materialul clinic este destul de mare (10 5 în 1). mlși mai sus). Dezavantajul metodei este incapacitatea de a distinge virușii aparținând aceluiași grup taxonomic. Această deficiență este depășită prin utilizarea microscopiei electronice imune. Metoda se bazează pe formarea de complexe imune prin adăugarea de ser specific la particulele virale, concentrând simultan particulele virale, permițând identificarea acestora. Metoda este folosită și pentru a detecta anticorpi. În scopuri de diagnostic expres, se efectuează examinarea microscopică electronică a extractelor de țesut, fecale, lichid din vezicule și secreții din nazofaringe. Microscopia electronică este utilizată pe scară largă pentru a studia morfogeneza virusului; capacitățile sale sunt extinse cu utilizarea anticorpilor marcați.

Metoda de hibridizare moleculară, bazată pe detectarea acizilor nucleici specifici virusului, face posibilă detectarea unor copii unice ale genelor și nu are o sensibilitate egală. Reacția se bazează pe hibridizarea catenelor complementare de ADN sau ARN (sonde) și formarea de structuri dublu catenare. Cea mai ieftină sondă este ADN-ul recombinat clonat. Sonda este marcată cu precursori radioactivi (de obicei fosfor radioactiv). Utilizarea reacțiilor colorimetrice este promițătoare. Există mai multe opțiuni de hibridizare moleculară: hibridizare spot, hibridizare blot, hibridizare sandwich, hibridizare in situ etc.

Anticorpii din clasa IgM apar mai devreme decât anticorpii din clasa G (în a 3-a-5 zi de boală) și dispar după câteva săptămâni, deci detectarea lor indică o infecție recentă. Anticorpii din clasa IgM sunt detectați prin imunofluorescență sau prin utilizare imunotestul enzimatic folosind antiseruri anti-μ (seruri cu lanț greu anti-IgM).

Metodele serologice în virologie se bazează pe reacții imunologice clasice (vezi Metode de cercetare imunologică) : reacții de fixare a complementului, inhibarea hemaglutinării, neutralizare biologică, imunodifuzie, hemaglutinare indirectă, hemoliză radială, imunofluorescență, imunotest enzimatic, radioimunotest. Au fost dezvoltate micrometode pentru multe reacții, iar tehnicile lor sunt îmbunătățite constant. Aceste metode sunt folosite pentru identificarea virusurilor folosind un set de seruri cunoscute si pentru serodiagnostic pentru a determina cresterea anticorpilor in al doilea ser fata de primul (primul ser se ia in primele zile dupa boala, al doilea - dupa 2-). 3 saptamani). O valoare diagnostică nu este mai mică de o creștere de patru ori a anticorpilor în al doilea ser. Dacă detectarea anticorpilor din clasa IgM indică o infecție recentă, atunci anticorpii din clasa IgC persistă câțiva ani și uneori pe viață.

Pentru a identifica antigenele individuale ale virusurilor și anticorpii împotriva acestora în amestecuri complexe fără purificarea prealabilă a proteinelor, se utilizează imunoblot. Metoda combină fracţionarea proteinelor utilizând electroforeza pe gel de poliacrilamidă cu imunoindicarea ulterioară a proteinelor utilizând metoda imunotestării enzimatice. Separarea proteinelor reduce cerințele pentru puritatea chimică a antigenului și face posibilă identificarea perechilor individuale antigen-anticorp. Această sarcină este relevantă, de exemplu, în serodiagnosticul infecției cu HIV, unde fals reacții pozitive imunotestele enzimatice sunt cauzate de prezența anticorpilor la antigenele celulare, care sunt prezenți ca urmare a purificării insuficiente a proteinelor virale. Identificarea anticorpilor din serul pacientului la antigenele virale interne și externe face posibilă determinarea stadiului bolii și, atunci când se analizează populațiile, variabilitatea proteinelor virale. Imunoblotting pentru infecția cu HIV este utilizat ca test de confirmare pentru a identifica antigenele virale individuale și anticorpii împotriva acestora. Atunci când se analizează populațiile, metoda este utilizată pentru a determina variabilitatea proteinelor virale. Valoarea mare a metodei constă în posibilitatea analizării antigenelor sintetizate cu ajutorul tehnologiei ADN recombinant, stabilirea dimensiunilor acestora și a prezenței determinanților antigenici.

Studiile virologice sunt studii menite să izoleze virusurile și să studieze proprietățile acestora, precum și să stabilească legătura etiologică a virusurilor cu anumite boli.

Materialul pentru cercetare este luat în funcție de localizarea virusurilor predominante în corpul pacientului și de căile de eliberare a acestora în mediul extern. Materialul este colectat în recipiente sterile, livrat la laborator cât mai repede posibil și depozitat congelat sau pe gheață până la examinare. Înainte de utilizare, materialul pentru izolarea virusului este procesat (și) pentru a suprima microflora străină și este procesat pentru a îndepărta particulele mari.

Virușii sunt izolați prin infectarea animalelor de laborator, a embrionilor de pui și a culturilor de țesuturi cu material care conține virus. Alegerea metodei de izolare depinde de agentul cauzal suspectat al bolii. Astfel, culturile de țesuturi (vezi) sunt utilizate atunci când se lucrează cu viruși care nu sunt patogeni pentru animalele de laborator sau când sunt detectate în cultura de țesuturi mai devreme decât la infectarea animalelor. Embrionii de pui sunt infectați pentru a izola agenții patogeni, oreionul infecțios (în cavitățile amniotice și alantoide), (în sacul vitelin), variola (în membrana corioalantoică).

Dintre animalele de laborator, șoarecii albi sunt cel mai adesea folosiți pentru a izola virusurile, urmați de iepuri, șobolani, porcușori de Guineea, maimuțe. Pentru arbovirusuri, cea mai eficientă este introducerea de material care conține virusuri în cap sau, pentru virusurile pneumotrope, pe membrana mucoasă. tractului respirator, pentru virusurile variolei, - pe o cornee scarificată.

Izolarea virusului este cea mai eficientă în perioada acuta boli. Un punct esențial în stabilirea naturii virale a bolii îl reprezintă rezultatele studiilor serologice ale serurilor prelevate în mod repetat de la același pacient la debutul bolii și în perioada de convalescență. Detectarea anticorpilor la virusurile izolate în al doilea ser într-un titru care este de 4 sau mai multe ori mai mare decât în primul ser indică o legătură etiologică a virusurilor cu această boală.

Devreme și metoda rapida detectarea antigenelor virale este o metodă de anticorpi fluorescenți, bazată pe fixarea specifică a anticorpilor marcați cu fluorocrom pe suprafața antigenului. Antigenul este ușor de detectat prin microscopie fluorescentă (vezi) datorită fluorescenței strălucitoare a anticorpilor adsorbiți pe antigen. Metoda anticorpilor fluorescenți este utilizată pentru a examina frotiurile prelevate de la pacienți, secțiunile histologice ale țesuturilor afectate și preparatele de cultură de țesuturi. Ele sunt, de asemenea, folosite pentru a detecta corpuri elementare (virioni) (vezi). Printre alte metode morfologice, sunt utilizate cele care detectează incluziuni virale intracelulare în secțiuni ale organelor și țesuturilor afectate. Detectarea incluziunilor indică infecție și în unele cazuri contribuie la diagnosticarea unei boli virale. Diverse sunt utilizate pentru a detecta anticorpii virali în sângele pacienților și pentru a studia structura antigenică a virusurilor. Reacția de neutralizare este utilizată pentru aproape toate infecțiile virale. Se bazează pe capacitatea anticorpilor imuni de a neutraliza proprietățile infecțioase ale virusurilor atunci când amestecul este introdus în corpul animalelor susceptibile sau în cultura de țesut. Pentru a determina indicele de neutralizare, o doză constantă de ser este amestecată cu diferite diluții de viruși, iar pentru a determina titrul de anticorpi, se amestecă diferite diluții de ser cu o doză constantă de viruși. Controlul este infectarea animalelor (sau a culturii de țesuturi) cu un amestec de virusuri cu ser normal sau cu soluție salină. Reacția de neutralizare este efectuată nu numai pentru a detecta anticorpi, ci și pentru a determina tipul și tipul de viruși.

Reacția de fixare a complementului [de exemplu, reacția Bordet-Giangou (vezi)] este utilizată pentru a detecta atât antigenele virale, cât și anticorpii. În primul caz, reacția implică interacțiunea unui ser imunitar cunoscut și a unui material în care se presupune prezența antigenelor: ser sanguin, tampoane nazofaringiene, extracte tisulare ale unui organism infectat. În al doilea caz - un antigen cunoscut (diagnosticum) și serul pacientului sau al convalescentului.

RSK este utilizat pentru diagnosticarea bolilor cauzate de virusurile gripale, virusurile variolei, adenovirusurile și arbovirusurile.

ÎN diagnostic de laborator infecțiile virale există trei abordări principale

1) examinarea directă a materialului pentru prezența antigenului viral sau a acizilor nucleici;

2) izolarea și identificarea virusului din materialul clinic;

Metode directe de diagnosticare a materialului clinic

Metodele directe sunt metode care permit detectarea unui virus, antigen viral sau acid nucleic viral (NA) direct în materialul clinic, adică sunt cele mai rapide (2-24 ore).

Microscopia electronică (EM). Folosind această metodă, puteți detecta virusul în sine.

microscopia electronică imunitară (IEM), care utilizează anticorpi specifici împotriva virușilor. Ca urmare a interacțiunii anticorpilor cu virușii, se formează complexe, care sunt mai ușor de detectat după contrast negativ.

Reacția de imunofluorescență (RIF). Metoda se bazează pe utilizarea anticorpilor asociați cu un colorant

Metoda RIF este utilizată pe scară largă pentru a descifra rapid etiologia infecțiilor virale respiratorii acute atunci când se analizează frotiurile de amprentă din membrana mucoasă a tractului respirator superior.

Testul imunosorbent legat de enzime (ELISA). Metodele de imunotest enzimatic pentru determinarea antigenelor virale sunt în principiu similare cu RIF, dar se bazează pe etichetarea anticorpilor cu enzime mai degrabă decât cu coloranți.

Radioimunotest (RIA). Metoda se bazează pe marcarea anticorpilor cu radioizotopi, ceea ce asigură o sensibilitate ridicată în determinarea antigenului viral.

Metode moleculare. Inițial, metoda foarte specifică de hibridizare a NK a fost considerată o metodă clasică de identificare a genomului viral, dar în zilele noastre izolarea genomului viral cu ajutorul polimerazei este din ce în ce mai utilizată. reacție în lanț(PCR).

Hibridarea moleculară a acizilor nucleici. Metoda se bazează pe hibridizarea catenelor complementare de ADN sau ARN cu formarea de structuri dublu catenare și pe identificarea acestora

PCR se bazează pe principiul replicării naturale a ADN-ului. Esența metodei este repetarea mai multor cicluri de sinteză (amplificare) a unei secvențe de ADN specifică virusului folosind ADN polimeraza Taq termostabilă și doi primeri specifici - așa-numiții primeri.

Metodele citologice sunt în prezent limitate valoare de diagnostic, dar pentru o serie de infecții ar trebui să fie utilizate în continuare. Sunt examinate materialele de autopsie, biopsiile și frotiurile care, după o prelucrare adecvată, sunt colorate și analizate la microscop.

Pentru izolarea cu succes a virusului material clinic trebuie luate în conformitate cu patogeneza bolii suspectate și la o dată cât mai devreme posibilă.

De regulă, ei iau:

– pentru infecții respiratorii – clătire nazofaringiană;

– pentru infectii enterovirale – spalaturi si fecale (reo-, enterovirusuri);

– pentru leziuni ale pielii și mucoaselor – răzuire, conținut de vezicule (herpes, varicelă);

– pentru infectii cu exantem – spalaturi (rujeola, rubeola);

– pentru infecții arbovirale – sânge, lichid cefalorahidian.

Pentru a izola virusurile, se folosesc culturi celulare, animale de laborator și embrioni de pui. Procesul este îndelungat, necesitând uneori mai multe treceri înainte ca virusul să fie detectat și identificat folosind una sau mai multe metode - reacție de neutralizare (RN), RIF, ELISA sau PCR.

Serodiagnostic

Diagnosticul serologic, bazat pe reacția antigen-anticorp, poate fi utilizat pentru a determina ambele și joacă un rol în determinarea etiologiei infecției virale chiar și în rezultate negative izolarea virusului.

RSK este unul dintre testele serologice tradiționale și este folosit pentru a diagnostica multe infecții virale. La reacție iau parte două sisteme: anticorpi din serul pacientului + virus standard și globule roșii de oaie + anticorpi împotriva acestora, precum și complement titrat. Dacă anticorpii și virusul se potrivesc, acest complex leagă complementul și nu are loc liza globulelor roșii de oaie (reacție pozitivă). Cu RSC negativ, complementul promovează liza eritrocitelor. Dezavantajul metodei este sensibilitatea insuficient de mare și dificultatea standardizării reactivilor.Metoda IF, ca și ELISA, este utilizată pentru determinarea anticorpilor în ser.

Cercetări pentru diagnosticarea bolilor de natură virală. Acest lucru este necesar pentru a identifica virusul, a studia biologia acestuia și capacitatea de a afecta celulele animale și umane. Astfel, devine posibilă înțelegerea patogenezei boli viraleși, în consecință, alegeți metoda potrivită de tratament.

Care este diagnosticul?

În celulele vii. Pentru a-l studia este necesar să-l cultivăm la nivelul unui organism experimental sau în acest scop în practică medicalăși microbiologie în general, se efectuează metode de cercetare virologică, care au următoarele abordări principale:

Drept;
indirect;
serologic.

Materialul poate fi examinat direct pentru prezența acizilor nucleici, a antigenului viral sau, de exemplu, virusul poate fi izolat și identificat din materialul clinic.

Pe lângă capacitatea de a stabili etiologia bolii și de a monitoriza efectul terapeutic, metodele de cercetare virologică joacă un rol important în măsurile anti-epidemice. Pentru izolare se folosesc embrioni de pui, animale de laborator sau culturi celulare.

Cum se cercetează?

Cea mai rapidă este metoda directă. Vă permite să detectați un virus, antigen sau NA (acid nucleic) în materialul clinic în sine. Durează de la două ore până la o zi.

EM - microscopie electronică. Detectează virusul direct.
IEM - microscopie electronică imună. Folosește anticorpi specifici împotriva virușilor.
RIF - reacție de imunofluorescență. Folosește anticorpi legați de un colorant. Astfel de metode de cercetare virologică sunt utilizate pe scară largă pentru a descifra rapid etiologia ARVI (infecții virale respiratorii acute), atunci când frotiurile de amprentă sunt prelevate de pe membrana mucoasă a tractului respirator superior.
ELISA - test imunosorbent legat de enzime - determinarea antigenelor virale, asemănătoare RIF, dar pe baza etichetării anticorpilor cu enzime.
RIA - radioimunotest. Utilizează radiomarcarea anticorpilor pentru a oferi o sensibilitate ridicată în detectarea antigenului viral.
Hibridarea moleculară - NK sau izolarea genomilor virusului folosind PCR (reacția în lanț a polimerazei).
Citologia este rar folosită, dar pentru anumite infecții aceste metode de cercetare virologică sunt foarte eficiente. Materialele de biopsie, autopsiile și frotiurile prelucrate pentru colorare și analiză la microscop sunt examinate.

Care este rostul cercetării?

Pentru a izola cu succes virușii, materialul clinic este luat în conformitate cu patogeneza și cât mai devreme posibil. Adesea, acest proces necesită mai multe pasaje înainte de a aplica anumite metode de cercetare virologică.

Microbiologia este studiul creaturilor microscopice. Iar domeniul ei nu este doar medicina. Este știința fundamentală pentru Agricultură, medicina veterinara, industriile spatiale si tehnice, geologie.

Dar, desigur, totul a fost creat pentru om și pentru dezvoltarea lui pe această planetă frumoasă. Prin urmare, este foarte important să detectați pericolul la timp și să îl neutralizați. Virușii sunt diferiți de bacterii. Acestea sunt structuri care intră în organism și provoacă formarea unei noi generații. Ele arată ca niște cristale și au ca scop controlul procesului de reproducere, deși ei înșiși nu se hrănesc, nu cresc și nu secretă produse metabolice.

Virusul este capabil să provoace boli severe în orice organism viu în care intră. În plus, poate evolua. De aceea, metodele de cercetare virologică în microbiologie trebuie dezvoltate și îmbunătățite, deoarece civilizația umană în ansamblu poate fi amenințată.

Materiale

Pentru a detecta și identifica virușii în medicină, de regulă, se iau următoarele:

clătire nazofaringian ( infecție respiratorie);
înroșirea și fecalele ( infecții cu enterovirus);
răzuire, conținut de vezicule (leziuni ale pielii, mucoase, cum ar fi herpes, varicela);
bufeuri (infectii exantemale, cum ar fi rujeola, rubeola);
sânge, lichid cefalorahidian (infecții cu arbovirus).

faze

Toate etapele metodei de cercetare virologică includ:

colectarea materialelor;
selecția, obținerea unui sistem de testare, determinarea viabilității acestuia;
infecția sistemului de testare;
indicația virusului;
determinarea tipului de virus.

Practic, virusurile patogeni diferă prin prezența specificității tisulare și a tipului. Luați, de exemplu, poliovirusul, care se reproduce numai la primate (în celulele lor). În consecință, o cultură specifică de țesut este utilizată pentru a izola un virus specific. Dacă vorbim despre un agent patogen necunoscut, atunci ar fi indicat să infectăm simultan trei, sau mai bine zis, patru culturi celulare.

Astfel, poate că unul dintre ei va fi sensibil. Pentru a determina prezența unui virus în culturile infectate, ei se uită la dezvoltarea degenerării celulare specifice, incluziuni intracelulare, identificarea unui antigen specific, reacții de hemaglutinare pozitivă și hemadsorbție.

Toate metodele de cercetare virologică (directe și indirecte, serologice) trebuie selectate ca fiind cele mai potrivite pentru cazul specific de infecție suspectată.

Metodele indirecte se bazează pe izolarea și identificarea virusului. Sunt laborioase, consumatoare de timp, dar precise.

Serodiagnostic

Acest diagnostic se referă la o metodă bazată pe reacția antigen-anticorp. Cel mai adesea se folosesc seruri de sânge pereche, luate la intervale de câteva săptămâni. Dacă titrul de anticorpi crește de 4 ori sau mai mult, reacția este considerată pozitivă. Pentru a determina specificitatea tipului virusului, se folosește o reacție de neutralizare a virusului. Pentru a determina specificitatea grupului, este necesar să se obțină o reacție de fixare a complementului.

Utilizate pe scară largă diverse opțiuni imunotest enzimatic, reacție de inhibare a hemaglutinării, hemaglutinare pasivă, hemaglutinare pasivă inversă, RIF. Chiar și în inginerie genetică a fost dezvoltată o metodă de producere a anticorpilor monoclonali. Specificitatea îngustă a monoclonelor poate fi depășită prin utilizarea mai multor anticorpi monoclonali la diferiți determinanți virali. Astfel, specificitatea și sensibilitatea testului de detectare a antigenului a fost crescută.

Unele caracteristici

Astăzi, au fost create multe sisteme de testare diferite pentru diagnosticarea imunologică a infecțiilor rezultate din intrarea unui virus într-un organism viu.

Astfel, metodele de cercetare virologică sunt metode de izolare a virusurilor, studierea proprietăților acestora și stabilirea legăturii lor etiologice cu anumite boli.