Imunoblotting (detecția anticorpilor în serul pacientului împotriva anumitor antigeni patogeni). Cum este diagnosticată SIDA prin imunoblotting pentru HIV III. Colorarea imunochimică a proteinelor imobilizate pe o membrană de nitroceluloză

Ce este un imunblot? Aceasta este o metodă comună diagnostic de laborator infecții virale persoană. Este considerată una dintre cele mai precise și fiabile modalități de a detecta prezența HIV. În fiabilitatea sa, depășește chiar și rezultatele imunoblot sunt considerate irefutabile și definitive.

Informații generale

Imunoblot - ce este? Pentru a recunoaște infecția cu HIV la o persoană, este necesar să se efectueze un test de laborator al serului sanguin pentru prezența anticorpilor. Tehnica de imunoblot este numită și Western blot. Este folosit pentru a detecta infecțiile virale umane ca metodă suplimentară expertă. Este necesar să se confirme ELISA - un test de laborator care vă permite să determinați prezența anticorpilor HIV în sânge. Verificați din nou cu imunoblotting test pozitiv ELISA. Este considerat cel mai sensibil, complex și costisitor.

Scop

Ce este un imunblot? Aceasta este o metodă de laborator pentru testarea serului de sânge pentru prezența anticorpilor împotriva virusului. În timpul studiului, un specialist separă mai întâi proteinele virale într-un gel și le transferă pe o membrană de nitroceluloză. Procedura de imunoblotare este menită să detecteze HIV diferite etape. În prima etapă, virusul purificat din părțile sale constitutive este supus electroforezei, iar antigenele incluse în compoziția sa sunt separate prin greutate moleculară.

Se reproduce într-o celulă vie, înglobând informațiile sale genetice în ea. În această etapă, o persoană devine purtătoare a virusului HIV dacă a fost infectată. Specificul bolii este că pentru o lungă perioadă de timp poate să nu se arate deloc. Virusul distruge limfocitele, astfel încât imunitatea unei persoane scade și organismul devine incapabil să reziste infecțiilor. Dacă HIV este tratat corect și la timp, pacientul va trăi până la o vârstă înaintată. Lipsa terapiei duce inevitabil la rezultat fatal. Din momentul infectării, dar fără tratament, durata maximă de viață nu este mai mare de zece ani.

Particularități

Analiza imunoblot este o metodă fiabilă care vă permite să determinați prezența anticorpilor la antigenele HIV de primul și al doilea tip. Dacă o persoană este infectată, în două săptămâni apar anticorpii, care pot fi detectați mult mai târziu. Particularitatea HIV este că cantitatea de anticorpi crește rapid și rămâne în sângele pacientului. Chiar dacă sunt prezente, boala poate să nu se manifeste timp de doi sau mai mulți ani. Metoda ELISA nu determină întotdeauna cu exactitate prezența bolii, așa că este necesară confirmarea rezultatelor folosind imunoblotting și PCR dacă imunotestul enzimatic arată un rezultat pozitiv.

Indicatii de utilizare

Ce este un „imunoblot” a fost deja descoperit, dar cui este prescris acest studiu? Motivul pentru a fi testat folosind imunoblot este un rezultat ELISA pozitiv. Este necesar să se supună unui imunotest enzimatic pentru pacienții care vor fi supuși unei intervenții chirurgicale. În plus, femeile care plănuiesc o sarcină, precum și orice persoană care are dezordine, ar trebui să fie testate. viata sexuala. Imunoblotting este prescris pacienților cu HIV dacă rezultatele ELISA sunt îndoielnice. Următoarele pot fi motive pentru a consulta un medic: simptome alarmante:

pierdere bruscă în greutate;
slăbiciune, pierderea performanței;
tulburări intestinale (diaree) care durează trei săptămâni;
deshidratarea organismului;
febră;
crește noduli limfatici pe corp;
dezvoltarea candidozei, tuberculozei, pneumoniei, toxoplasmozei, exacerbarea herpesului.

Pacientul nu trebuie să se pregătească înainte de test sânge venos. Nu trebuie să consumați alimente cu 8-10 ore înainte de test. Cu o zi înainte de donarea sângelui, nu este recomandat să beți băuturi alcoolice sau de cafea, să faceți exerciții fizice intense sau să experimentați anxietate.

Unde se face analiza?

Unde pot fi testat pentru HIV? Studiile ELISA și imunoblot sunt efectuate în clinicile private ale orașului, rezultatele sunt prezentate în 24 de ore. Diagnosticul urgent este de asemenea posibil. În instituțiile medicale publice, testele ELISA și imunoblotting sunt efectuate gratuit, în conformitate cu legislația Federației Ruse. Este obligatoriu de verificat boli infecțioase femeile însărcinate, precum și pacienții supuși spitalizării sau intervenției chirurgicale.

Cum se desfășoară cercetarea?

Cum se efectuează analiza ELISA? Imunoblotul pozitiv/negativ confirmă sau infirmă rezultatele imunotestului enzimatic. Procedura de cercetare este destul de simplă. Specialistul ia sânge venos, care nu durează mai mult de cinci minute. După prelevarea probelor, locul de injectare trebuie dezinfectat și acoperit cu o bandă. Eșantionarea se efectuează pe stomacul gol, așa că după procedură nu va strica să mănânci un baton de ciocolată neagră sau să bei o băutură caldă dulce.

Pentru a primi o recomandare pentru un test gratuit la o instituție medicală publică, trebuie să vizitați un medic generalist. În general, imunoblotting nu diferă de alte analize de sânge în ceea ce privește metoda de prelevare. Metodologia cercetării este simplă. Dacă există un virus în sângele unei persoane, organismul începe să producă anticorpi pentru a-l distruge. Fiecare virus are propriul său set de proteine antigene. Detectarea acestor anticorpi este baza tehnicii de imunoblot.

Preț

Cât costă analiza? Imunoblot pentru HIV nu este un test ieftin. În medie, o examinare de screening folosind metode imunologice enzimatice costă între 500 și 900 de ruble. Imunoblotting este un studiu de verificare, al cărui cost este de la trei la cinci mii de ruble. Mai mult metode complexe sunt mult mai scumpe. De exemplu, va trebui să plătiți aproximativ 12.000 de ruble.

Interpretarea rezultatului

Cele mai comune metode de diagnosticare a infecției cu HIV sunt testele imunosorbente legate de enzime și imunobloturile. Ele sunt utilizate pentru determinarea anticorpilor împotriva virusului imunodeficienței în serul sanguin. Prezența infecției este de obicei confirmată prin două teste: screening și confirmator. Interpretarea rezultatelor studiului trebuie efectuată de un medic, care pune, de asemenea, un diagnostic și prescrie tratament. Dacă imunoblotul este pozitiv, înseamnă că un virus este prezent în corpul uman.

Un rezultat pozitiv nu ar trebui să fie un motiv pentru auto-tratament, deoarece fiecare pacient poate avea o imagine diferită a bolii. Analiza calitativa include screening și verificare. Dacă pacientul nu are un virus, rezultatul este indicat ca „negativ”. Dacă este detectat prin screening, se efectuează un studiu suplimentar de verificare. Un imunblot este un test care confirmă sau infirmă o screening. Dacă pe banda de testare apare întunecare în anumite zone (locații ale proteinelor), se pune un diagnostic de HIV. Dacă rezultatele sunt îndoielnice, testele sunt efectuate în termen de trei luni.

Puteți preveni infecția cu virusul imunodeficienței dacă urmați anumite reguli: evitați sexul ocazional, folosiți prezervativ în timpul contactului, nu luați droguri. Dacă boala este detectată la o femeie însărcinată, este important să urmați cu strictețe recomandările medicului curant și să nu uitați să treceți la examinări pentru prezența virusului.

Sângele este extras dintr-o venă. Apoi studiul se desfășoară conform instrucțiunilor:

proba este plasată într-un gel pentru separare electroforetică, rezultând proteine specifice care sunt sensibile la virus;
pe gelul tratat se aplică hârtie de nitroceluloză;
proba preparată este plasată într-un aparat de blotting.

Pentru a identifica anumite enzime, este necesar să se pregătească în mod corespunzător hârtia pentru testele de laborator. Pentru a face acest lucru, i se aplică anticorpi și un conjugat radioactiv marcat. Rezultatul studiului este evaluat vizual, sunt examinate lanțurile de enzime construite.

Decodificarea rezultatelor

După manipulare, pe hârtie rămân dungi. Ele sunt localizate acolo unde a avut loc conjugarea, adică medicamentul aplicat a reacționat cu proteina virală. În acest fel puteți detecta părți ale proteinei:

din nucleul HIV-1 – p17, p24, p55;
patogen HIV-2 – p16, p26, p56.

Rezultatele imunoblotting sunt considerate pozitive dacă sunt detectate 2 din 3 proteine HIV-1 sau HIV-2. Deoarece Western blot (al doilea nume al studiului) este adesea folosit pentru a confirma ELISA pozitiv, apoi se verifică reacția pentru proteine specifice: gp120/160, gp41 sau p24. Ele fac parte din cele trei gene principale ale SIDA - gag, pol și env. În timpul diagnosticului inițial, testul se efectuează numai pentru proteinele p25, gp110/120 și gp160; dacă dă un rezultat pozitiv, atunci testul este efectuat pentru p24. Această parte a proteinei permite virusului să fie detectat într-un stadiu incipient.

Un rezultat pozitiv este un motiv pentru a căuta diagnostice mai complexe. Este fals doar in 3 cazuri:

la pacientii cu nivel inalt bilirubina;
la contactul cu antigeni virali;
pentru patologiile țesutului conjunctiv.

Dacă pacientul nu are linii corespunzătoare proteinelor SIDA, atunci rezultatul este evaluat ca fiind negativ. Aceasta înseamnă că persoana nu este infectată cu HIV sau se află în perioada fereastră. Aceasta din urmă înseamnă că virusul ar fi putut pătrunde în organism, dar nu s-a dezvoltat încă în el. Pentru a crește acuratețea diagnosticului, se folosesc sisteme de testare:

Recombinant-HIV;
Antigen;
Peptoscreen.

După verificarea acestora, rezultatul este considerat negativ dacă proteinele gp120, gp160, Sp4 nu se găsesc în probă.

Există o altă opțiune de interpretare - un rezultat neutru sau dubios. Apare la cei care au contact sexual cu un partener infectat cu HIV. Anticorpii la proteinele gp120 și gp160 se găsesc în sângele lor. De asemenea, un răspuns îndoielnic în timpul blotting-ului este dat atunci când infecția este asimptomatică, adică este într-o stare latentă.

Este important să verificați cu atenție un rezultat discutabil. În acest scop, se folosește un studiu dinamic al serului sanguin, adică verificări regulate folosind metode de imunoblot și ELISA timp de șase luni. De asemenea, numit examinări suplimentare, deoarece prezența autoanticorpilor și a complexelor imune în sânge se poate datora:

boli infecțioase;
prezența tumorilor canceroase;
alergii.

Imunoblot (imunoblot, Western Blot, Western Blot)- combină un test imunosorbent legat de enzime (ELISA) cu transferul electroforetic preliminar al antigenelor virale pe o bandă (bandă) de nitroceluloză.

În acest frumos nume științific, „blot” este cel mai probabil tradus ca „blot”, iar „western” ca „western” reflectă direcția de răspândire a acestui „blot” pe hârtie de la stânga la dreapta, adică la harta geografica aceasta corespunde direcției de la vest la est.” Esența metodei „blot imun” constă în faptul că reacția imunoenzimei se realizează nu cu un amestec de antigene, ci cu antigene HIV, distribuite anterior prin imunoforeză în fracții situate în funcție de greutatea moleculară pe suprafața membranei de nitroceluloză. Ca urmare, principalele proteine HIV, purtătoare de determinanți antigenici, sunt distribuite pe suprafață sub formă de dungi separate, care apar în timpul unei reacții imunosorbente legate de enzime.

Imunoblot include mai multe etape:

Pregătirea benzii. Virusul imunodeficienței (HIV), purificat în prealabil și distrus în componentele sale constitutive, este supus electroforezei, iar antigenele care alcătuiesc HIV sunt separați prin greutate moleculară. Apoi, folosind metoda blotting (analoga cu stoarcerea excesului de cerneală pe un blotter), antigenele sunt transferate pe o bandă de nitroceluloză, care conține acum un spectru de benzi de antigen caracteristice HIV, care este încă invizibilă pentru ochi.

Examinarea probei. Materialul de testat (ser, plasma sanguină a pacientului etc.) este aplicat pe banda de nitroceluloză, iar dacă există anticorpi specifici în probă, aceștia se leagă de benzi antigenice strict corespunzătoare (complementare). Ca urmare a manipulărilor ulterioare, rezultatul acestei interacțiuni este vizualizat - făcut vizibil.

Interpretarea rezultatului. Prezența benzilor în anumite zone ale plăcii de nitroceluloză confirmă prezența în serul testat a anticorpilor la antigenele HIV strict definite.

Banda A - Control pozitiv

Banda B - Control pozitiv slab

Banda C - Control negativ

Banda D - Probă pozitivă (anticorpi la HIV-1 detectați)

În prezent, imunoblot (immunoblot) este principala metodă de confirmare a prezenței anticorpilor specifici virusului în serul de testat. În unele cazuri de infecție cu HIV, înainte de apariția seroconversiei, anticorpii specifici sunt detectați mai eficient prin imunoblotting decât ELISA. La studierea utilizând metoda imunoblotării, s-a constatat că cel mai adesea anticorpii la gp 41 sunt detectați în serul pacienților cu SIDA, iar detectarea p24 la persoanele examinate în scop preventiv necesită cercetări suplimentare pentru a determina dacă au infecție cu HIV. Sistemele de testare de imunoblotting bazate pe proteine recombinante modificate genetic s-au dovedit a fi mai specifice decât sistemele convenționale bazate pe lizat viral purificat. Când se utilizează un antigen recombinant, nu se formează o bandă de antigen difuză, ci o bandă îngustă de antigen clar definită, care este ușor accesibilă pentru înregistrare și evaluare.

Serurile indivizilor infectați cu HIV-1 dezvăluie anticorpi la următoarele proteine majore și glicoproteine - proteine structurale ale anvelopei (env) - gp160, gp120, gp41; miez (gag) - p17, p24, p55, precum și enzime virale (pol) - p31, p51, p66. Anticorpii la env sunt tipici pentru HIV-2 - gp140, gp105, gp36; gag - p16, p25, p56; pol - p68.

Dintre metodele de laborator necesare pentru a stabili specificitatea reacției, cea mai recunoscută este detectarea anticorpilor la proteinele anvelopei HIV-1 - gp41, gp120, gp160 și HIV-2 - gp36, gp105, gp140.

OMS consideră seruri pozitive în care anticorpii la oricare două glicoproteine HIV sunt detectați prin imunoblot. Conform acestor recomandări, dacă există o reacție doar cu una dintre proteinele învelișului (gp 160, gp 120, gp 41) în combinație sau fără o reacție cu alte proteine, rezultatul este considerat îndoielnic și se recomandă re-testarea folosind un kit dintr-o serie diferită sau de la o altă companie. Dacă și după aceasta rezultatul rămâne îndoielnic, se recomandă observarea timp de 6 luni (cercetare după 3 luni).

Disponibilitate reacție pozitivă cu antigenul p24 poate indica o perioadă de seroconversie, deoarece anticorpii la această proteină apar uneori primii. În acest caz, se recomandă, în funcție de datele clinice și epidemiologice, să se repete studiul cu o probă de ser prelevată cel puțin 2 săptămâni mai târziu, și exact așa este atunci când este necesară testarea serurilor pereche în infecția cu HIV.

Reacțiile pozitive cu proteinele gag și pol fără o reacție cu proteinele env pot reflecta seroconversia timpurie și pot indica, de asemenea, infecția cu HIV-2 sau o reacție nespecifică. Persoanele cu aceste rezultate după testarea HIV-2 sunt retestate după 3 luni (în decurs de 6 luni).

În acest frumos nume științific, „blot” este cel mai probabil tradus ca „blot”, iar „western” - deoarece „western” reflectă direcția de distribuție a acestui „blot” pe hârtie de la stânga la dreapta, adică pe un harta geografică aceasta corespunde direcției de la vest la est." Esența metodei „blot imun” constă în faptul că reacția imunoenzimei se realizează nu cu un amestec de antigene, ci cu antigene HIV, distribuite anterior prin imunoforeză în fracții situate în funcție de greutatea moleculară pe suprafața membranei de nitroceluloză. Ca urmare, principalele proteine HIV, purtătoare de determinanți antigenici, sunt distribuite pe suprafață sub formă de dungi separate, care apar în timpul unei reacții imunosorbente legate de enzime.

Imunoblot include mai multe etape:

Interpretarea rezultatului. Prezența benzilor în anumite zone ale plăcii de nitroceluloză confirmă prezența în serul testat a anticorpilor la antigenele HIV strict definite.

Banda A - Control pozitiv

Banda B - Control pozitiv slab

Banda C - Control negativ

Banda D - Probă pozitivă (anticorpi la HIV-1 detectați)

În prezent, imunoblot (immunoblot) este principala metodă de confirmare a prezenței anticorpilor specifici virusului în serul de testat. În unele cazuri de infecție cu HIV, înainte de apariția seroconversiei, anticorpii specifici sunt detectați mai eficient prin imunoblot decât prin ELISA. La studierea utilizând metoda imunoblotării, s-a constatat că cel mai adesea anticorpii la gp 41 sunt detectați în serul pacienților cu SIDA, iar detectarea p24 la persoanele examinate în scop preventiv necesită cercetări suplimentare pentru a determina dacă au infecție cu HIV. Sistemele de testare de imunoblotting bazate pe proteine recombinante modificate genetic s-au dovedit a fi mai specifice decât sistemele convenționale bazate pe lizat viral purificat. Când se utilizează un antigen recombinant, nu se formează o bandă de antigen difuză, ci o bandă îngustă de antigen clar definită, care este ușor accesibilă pentru înregistrare și evaluare.

Prezența unei reacții pozitive cu antigenul p24 poate indica o perioadă de seroconversie, deoarece anticorpii la această proteină apar uneori primii. În acest caz, se recomandă, în funcție de datele clinice și epidemiologice, să se repete studiul cu o probă de ser prelevată cel puțin 2 săptămâni mai târziu, și exact așa este atunci când este necesară testarea serurilor pereche în infecția cu HIV.

Imunoblotting -(din engleză „blot” - spot) - o metodă de identificare a antigenelor (sau anticorpilor) folosind seruri (sau antigene) cunoscute. Este o combinație de electroforeză pe gel și ELISA. Inițial, celulele bacteriene sau virionii sunt distruși cu ajutorul ultrasunetelor, iar apoi toți antigenii virusului sau celulele bacteriene sunt separați prin electroforeză și se obține un reactiv comercial pe o peliculă specială de nitroceluloză. La efectuarea imunoblotării, serul pacientului aflat în studiu este aplicat pe un film cu antigeni cunoscuți. După incubarea și spălarea anticorpilor nelegați, se trece la ELISA - pe film se aplică antiser la imunoglobulinele umane marcate cu o enzimă și un substrat cromogen care își schimbă culoarea atunci când interacționează cu enzima. În prezența complexelor antigen-anticorp-antiser la imunoglobulină-enzimă, pe purtător apar pete colorate. Metoda imunoblot vă permite să detectați separat anticorpii pe diverse antigene agent patogen (de exemplu, în infecția cu HIV, imunoblotting detectează anticorpi la gp120, gp24 și alți antigeni virali).

Radioimunotest (RIA)

Metoda se bazează pe o reacție antigen-anticorp folosind un antigen sau anticorp marcat cu radionuclid. 125I, 14C, 3H, 51Cr și alți radionuclizi sunt utilizați ca etichete. Complexele imune rezultate sunt izolate din sistem și radioactivitatea lor este determinată pe contoare (radiație β). Intensitatea radiației este direct proporțională cu numărul de antigen și molecule de anticorpi legați.

Versiunea în fază solidă a RIA care utilizează anticorpi marcați sau antigeni absorbiți în godeurile panourilor de polistiren este larg răspândită.

RIA este utilizat pentru a detecta antigenele microbilor, virușilor, diverși hormoni, enzime, substanțe medicinale, imunoglobulinele, precum și alte substanțe conținute în materialul de testat în concentrații minore de 10-12-10-15 g/l.

Întrebări de control

Reacția de bacterioliză imună: ce fel de reacție este; ce este un antigen, ce este un anticorp, mecanism de reacție, metode de producție, uz practic. Reacție de hemoliză imună: ingrediente necesare, procedură; controale, aplicare practică. Reacție locală de hemoliză în gel (reacție Jerne): principiu de reacție, metodă de formulare, aplicare practică. Reacția de fixare a complementului: principiu de reacție; ce se formează atunci când serul imunitar interacționează cu un antigen specific; ce se întâmplă cu complementul dacă este prezent în timpul acestei interacțiuni? Care este soarta complementului dacă nu există o afinitate specifică între antigen și anticorpi? Ce reacție poate fi folosită pentru a determina ce sa întâmplat cu complementul; de ce se utilizează această reacție specială; Care este rezultatul pozitiv vizibil al RSC? De ce? Ce proprietate a complementului este folosită în prima fază a RSC? In faza a doua? Dacă rezultat final RSC este hemoliză, ce înseamnă - pozitiv sau rezultat negativ? Explicați rezultatele: RSK+ + + +, RSK+ + +, RSK+ +, RSK+. Numiți ingredientele primului sistem RSK și ingredientele celui de-al doilea sistem RSK. De ce trebuie să fie inactivat serul de testare? Cum se titra complementul? Ser hemolitic: ce conține, cum se obține, care este titrul și cum se determină? Ce animale sunt folosite pentru a obține componente RSC? Metodologia de înființare a RSC în frig. La stadializare, care dintre următoarele reacții necesită participarea complementului: precipitare, floculare, aglutinare, detectarea anticorpilor incompleti, bacterioliză imună, hemoliză imună, Jerne, RSC? Reacția de imunofluorescență (RIF) - indică succesiunea evenimentelor din reacția directă Koons; ingredientele necesare. Ce este un antigen, ce este un anticorp, cu ce sunt marcați anticorpii, cum se ia în considerare rezultatul reacției, cum arată un rezultat pozitiv? Aplicație practică - ce se poate determina folosind această reacție? Reacție de imunofluorescență indirectă - indicați succesiunea evenimentelor din timpul acestei reacții, ingredientele necesare, care este antigenul, ce seruri imune sunt utilizate; uz practic; avantajul RIF indirect în comparație cu reacția directă. Test imunosorbent legat(ELISA) – principiu de reacție; ingredientele necesare; indicați secvența evenimentelor atunci când se efectuează o reacție pentru a detecta un antigen în materialul testat; ingredientele necesare; Ce se întâmplă când rezultatul este pozitiv, cum arată? Indicați secvența acțiunilor la efectuarea ELISA pentru detectarea anticorpilor în serul de testat; ingredientele necesare; ce se intampla daca rezultatul este pozitiv? Immunoblotting – principiu de reacție; etapele principale; ingredientele necesare; cum este luat în considerare rezultatul; beneficiile reacției. Radioimunotest (RIA) - care sunt principalele etape ale reacției; Cu ce sunt etichetați anticorpii sau antigenele, cum se ia în considerare rezultatul? Microscopia imunoelectronică - principiul metodei; etapele principale; ingredientele necesare; cu ce sunt marcați anticorpii? cum se ia în considerare rezultatul reacției. Reacții de imobilizare – principiul metodei, tehnica setarii, componente, înregistrarea rezultatelor.

Sarcini de finalizat în timpul procesului de auto-studiu.

Completați tabelul „Reacții imune” în legătură cu reacțiile discutate în acest subiect.

Reacții imune

Lucrul elevilor în timpul unei lecții practice

Începeți munca imediat cu configurarea fazei 1 a RSK, dar notați-o în caiet mai târziu (vezi mai jos).

1. Reacție de hemoliză imună. Vizualizați o reacție demonstrativă a hemolizei imune, schițați-o sub forma unei diagrame, explicați rezultatul în tuburile experimentale și de control.

2. Reacția de fixare a complementului

a) analizați RSK-ul conform tabelului;

b) desenați într-un caiet o diagramă a configurației RSC sub formă de tabel;

c) pune faza a doua a RSK (prima faza este pusa la inceputul lectiei);

d) analizează pregătirile de diagnostic necesare pentru RSC;

d) ţine cont de rezultat. Formulați o concluzie despre prezența anticorpilor specifici în serul de testat.

3. Reacția de imunofluorescență. Studiați tabelul, faceți o diagramă a reacției în caiet; uită-te la serurile de diagnostic; determinați ce conține serul, cum este preparat, pentru ce reacție (RIF directă sau indirectă) este utilizat. Uitați-vă la rezultatul demonstrației RIF într-un microscop cu fluorescență.

4. Testul imunosorbent legat de enzime (ELISA). În caiet, întocmește o schemă pentru stabilirea unei reacții în două versiuni: pentru detectarea unui antigen în materialul studiat și pentru detectarea anticorpilor în ser. Examinați trusa de ingrediente pentru HIV și hepatita B. Identificați ce conține fiecare ingredient și pentru ce este utilizat.

5. Imunoblotting. Faceți o diagramă a reacției în caiet; urmăriți demonstrația - rezultatul reacției.

6. Radioimunotest (RIA). Faceți o diagramă a reacției în caiet.

7. Microscopia electronică imunitară (IEM). Urmărește demonstrația - rezultatul reacției, întocmește o diagramă a reacției în caiet, indica cu săgeți antigenul (virusul) și anticorpii etichetați.

Imunoblotting este o metodă extrem de sensibilă pentru detectarea proteinelor, bazată pe o combinație de electroforeză și ELISA sau RIA. Imunoblotting este utilizat ca metoda de diagnostic pentru infectarea cu HIV etc.

Într-un sens general, imunoblotarea se referă la analiza unui amestec de proteine transferate pe un suport de membrană solidă, de care sunt legate prin legături covalente, urmată de imunodetecție.

Se poate analiza un amestec de proteine aplicat direct pe substrat - analiza dot blot - sau dupa fractionarea lui preliminara prin electrofocalizare, electroforeza disc sau electroforeza bidimensionala - analiza Western blot.

Antigenii patogeni sunt separați folosind electroforeză pe gel de poliacrilamidă, apoi transferați din gel pe hârtie activată sau membrană de nitroceluloză și dezvoltați folosind ELISA.

Companiile produc astfel de benzi cu „bloturi” de antigene. Pe aceste benzi se aplică serul pacientului. . Apoi, după incubare, pacientul este spălat de anticorpii nelegați și se aplică ser împotriva imunoglobulinelor umane marcate cu o enzimă. . Complexul format pe bandă (antigen + anticorp pacient + anticorp împotriva Ig umană) este detectat prin adăugarea unui substrat cromogen care își schimbă culoarea sub acțiunea unei enzime.

Această metodologie este, de asemenea, utilizată pentru a selecta clone de bacterii, fagi sau viruși care exprimă produsele țintă ale genelor donate.

Transferul proteinelor pe membrană se realizează fie pasiv, fie folosind echipamente de electrotransfer. Eficiența transferului de proteine către membrană este influențată de mulți factori, cum ar fi greutatea moleculară a proteinelor, porozitatea gelului, timpul de transfer și compoziția soluției tampon (trans-tampon) utilizată.

În funcție de obiectivele și condițiile experimentului, condițiile de transfer sunt selectate pentru a se asigura cele mai bune rezultate. Nitroceluloza, difluorura de poliviniliden (PVDF) sau membranele de nailon încărcate pozitiv sunt utilizate în mod obișnuit ca substraturi. Nitroceluloza poate lega până la 80 - 100 μg de proteine la 1 cm2.

Proteinele cu greutate moleculară mică (cu o greutate moleculară mai mică de 20 kDa) pot fi pierdute ca urmare a spălărilor, ceea ce face posibilă studierea preliminară a polimorfismului anumitor loci genetici pe baza lungimii fragmentelor de restricție ADN corespunzătoare.

În plus, folosind hibridizarea Southern, puteți afla cu ușurință dacă gena țintă are un loc de hidroliză de către o anumită enzimă de restricție în partea sa internă, ceea ce vă permite să alegeți strategia optimă pentru clonarea regiunii genomului studiat.

Folosind o schemă similară, moleculele de ARN pot fi transferate dintr-un gel de agaroză într-un filtru de nitroceluloză. Această metodă a fost numită Northern blot, spre deosebire de Southern blot, deoarece numele de familie Southern în Limba englezăînseamnă „sudic”.

Transferul proteinelor pe filtre din gel a fost denumit în consecință Western blot. Proteinele mari (>100 kDa) denaturate în soluție de dodecil sulfat de sodiu (SDS) pot fi transferate slab la membrană dacă etanolul este prezent în tamponul trans. Alcoolul îmbunătățește semnificativ transferul de proteine din gelul SDS-poliacrilamidă, dar îngustează porii din gel, ceea ce duce la reținerea proteinelor mari.

Membrana PVDF este optimizată pentru imunodetecție și este capabilă să rețină până la 160 μg/cm2 de proteine legate în mod specific, cu niveluri foarte scăzute de legare nespecifică.

Imunoblotting

O proprietate importantă a acestei membrane este posibilitatea utilizării sale repetate. Membranele de nailon Zeta-Probe leagă eficient proteinele SDS în absența alcoolului, iar această legare este rezistentă la tratamentele ulterioare. Proteinele cu greutate moleculară mică sunt de asemenea reținute eficient. Cu o capacitate mare de legare de aproximativ 480 μg de proteină per cm2, membranele Zeta-Probe permit detectarea urmelor de proteine în amestecurile de testat.

Odată ce antigenul este imobilizat pe membrană, locurile de legare rămase sunt blocate cu soluții de gelatină, albumină serică bovină sau lapte degresat.

Apoi membrana este incubată într-o soluție de anticorpi policlonali sau monoclonali la antigenul studiat. După spălarea anticorpilor nelegați, membrana este incubată într-o soluție de anticorpi secundari, care sunt un conjugat al enzimelor fosfatază alcalină (AP) sau peroxidază de hrean (HRP) cu anticorpi anti-specie (anticorpi de capră la imunoglobulinele de iepure, șoarece sau umane). ) sau proteinele A (proteina Staphylococcus aureus) sau G (proteina Streptococcus sp.), având afinitate mare pentru regiunea Fc a imunoglobulinelor.

Detectarea complexelor imune formate se realizează chimic sau chemiluminescent. Substraturi pentru reactie chimica Când utilizați conjugați de fosfatază alcalină, utilizați 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfat (BCIP) sau tetrazoliu albastru (NBT), iar când utilizați conjugați de peroxidază de hrean, utilizați 4-clor-1-naftol și peroxid de hidrogen.

Ca rezultat al reacțiilor enzimatice, pe membrană se formează o bandă sau o pată colorată la locul de localizare a complexului antigen-anticorp.

Sensibilitatea acestei metode este de 100 pg de proteină atunci când se utilizează conjugate AP și 100-500 pg când se utilizează conjugate HRP. Detectarea chemiluminiscentă a complexelor imune permite detectarea a mai puțin de 5 pg de antigen. Principiul acestei metode este că atunci când HRP reacționează cu peroxid de hidrogen și diacilhidrazină luminol ciclic, este emisă lumină la o lungime de undă de 428 nm, care poate fi înregistrată pe o peliculă fotosensibilă.

Reacția de imunoblot (IB) a fost dezvoltată pe baza ELISA. Este cea mai specifică și sensibilă metodă de analiză imunochimică. Immunoblotting (din engleză blot - blot, colorare) combină ELISA cu electroforeza. Este utilizat pentru a detecta nu anticorpi complecși la HIV, ci anticorpi la proteinele sale structurale individuale (proteine p24, glicoproteine gp120, gp 41 etc.). Se referă la reacțiile experților (de confirmare) pentru diagnosticarea infecției cu HIV.

Reacția se desfășoară în mai multe etape:

Virusul este distrus în componente - antigene (p24, gp120, gp 41 etc.), care sunt supuși electroforezei într-un gel de poliacrilamidă, adică separarea antigenilor în fracții după greutatea moleculară.

2. Gelul este acoperit cu o membrană de nitroceluloză și fracțiile de antigen sunt transferate în acesta prin electroforeză. Nitroceluloza se comportă ca hârtie absorbantă. Membrana este tăiată în benzi. Companiile produc astfel de benzi cu „bloturi” de antigene.

Imunoblotting - o metodă indirectă suplimentară

Benzile acoperite cu antigeni HIV sunt scufundate în serul subiectului și apoi spălate pentru a îndepărta materialul nelegat.

4. Se incubează benzile cu ser antiglobulinic marcat cu peroxidază și se spală.

Se adaugă substratul și se notează numărul de fracții colorate (pete) care corespund zonei de localizare a complexului AG-AT.

Prezența benzilor în anumite zone ale benzii confirmă prezența în serul testat a anticorpilor la antigenele HIV strict definite. Rezultatul imunoblotării este considerat pozitiv dacă benzile corespunzătoare oricărui doi dintre cei trei antigene HIV - p24, gp41 și gp 120 sunt vizibile pe membrană (Fig. 37).

DESENE

LISTA REFERINȚELOR UTILIZATE

Literatura principală

Microbiologie medicală, virologie și imunologie: un manual pentru studenții la medicină. universități ed. a II-a, rev. si suplimentare — 702 p. Ed. A.A. Vorobyova. M.: MIA, 2012.

2. Microbiologie, virologie și imunologie: un manual pentru clasele de laborator: manual/(V.B. Sboychakov și alții); editat de V.B. Sboychakova, M.M. Karapats. – M.: GEOTAR-Media, 2014.- 320 p.: ill.

3. Microbiologie medicală, imunologie și virologie [Resursă electronică]: manual pentru miere.

universități - 760 p. — Mod de acces: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN9785299004250.html Korotyaev A.I., Babichev S.A. Sankt Petersburg: Spetslit, 2010.

4. Microbiologie medicală, virologie și imunologie [Resursa electronică] : manual: în 2 volume / Vol. 1. - 448 p. — Mod de acces: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142241.html Zverev V.V., Boychenko M.N.

M.: Geotar Media, 2010. .

5. Microbiologie medicală, virologie și imunologie [Resursa electronică]: manual: în 2 volume.T. 2. - 480 p. Mod de acces: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142242.html Zverev V.V., Boychenko M.N. M.: Geotar Media, 2010.

literatură suplimentară

1. Reacții de imunodiagnostic: tutorial/ alcătuit de: G.K.Davletshina, Z.G.Gabidullin, A.A.Akhtarieva, M.M.Tuigunov, A.K.Bulgakov, T.A.Savchenko, R.F.

Khusnarizanova, Yu.Z. Gabidullin, M.M. Alsynbaev - Ufa: Editura Instituției de Învățământ Buget de Stat de Învățământ Profesional Superior BSMU a Ministerului Sănătății al Rusiei, 2016. - 86 p.

2. Caracteristicile unor proprietăți care determină potențialul patogen al variațiilor co-cultivate ale bacteriilor Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E.coli, Proteus: publicație științifică / Yu. Z. Gabidullin, R. S. Sufiyarov, I. I. Dolgushin - Ufa, 2015. - 250 s.

Acasă » Immunoblot – ce este? Imunoblot în diagnosticul bolilor infecțioase

Imunoblot - ce este? Imunoblot în diagnosticul bolilor infecțioase

Ce este un imunblot? Aceasta este o metodă comună pentru diagnosticul de laborator al infecțiilor virale umane. Este una dintre cele mai precise și fiabile modalități de a detecta prezența HIV.

Pentru fiabilitate, este chiar mai mare decât testul imunosorbent legat de enzime (elisa). Rezultatele imunoblot sunt considerate concludente și concludente Informații generale

Imunoblot - ce este? Pentru a recunoaște o persoană ca având HIV, trebuie să treci metoda de laborator teste de ser sanguin pentru prezența anticorpilor.

Secțiunile Western blot sunt numite și Western blot. Este folosit pentru a detecta infecțiile virale umane ca metodă suplimentară expertă. Acest lucru este necesar pentru a confirma ELISA - un test de laborator care vă permite să determinați prezența anticorpilor împotriva HIV în sânge. Immunoblot reverificare ELISA pozitiv.

Este considerat cel mai sensibil, complex și costisitor.

Ţintă

Ce este un imunblot? Această tehnică cercetare de laborator ser de sânge pentru prezența anticorpilor împotriva virusului.

Pe parcursul cercetare specială proteine virale totale în gel și pe membrana de nitroceluloză.

Imunoblotting (detecția anticorpilor în serul pacientului împotriva anumitor antigeni patogeni)

Procedura secțiunii Western blot are scopul de a determina infecția cu HIV în diferite stadii. În prima etapă, virusul purificat din părțile sale constitutive este supus electroforezei, iar antigenii incluși în acesta sunt împărțiți la greutatea moleculară.

Virusul imunodeficienței umane se reproduce în celulele vii încorporate în informațiile sale genetice. În această etapă, o persoană devine purtătoare a virusului HIV dacă ați fost infectat.

Specificul acestei boli este că nu se manifestă mult timp. Virusul distruge limfocitele, astfel imunitatea unei persoane scade și organismul devine incapabil să lupte împotriva infecțiilor.

Dacă HIV este tratat corect și prompt, pacientul va trăi până la o vârstă înaintată. Lipsa tratamentului duce inevitabil la moarte. Din momentul infectării, dar fără tratament, perioada maximă nu este mai mare de zece ani.

Particularități

Analiza imunoblot este o metodă fiabilă care vă permite să determinați prezența anticorpilor la antigenele HIV de primul și al doilea tip.

Dacă o persoană este infectată, după două săptămâni, anticorpii pot fi detectați mult mai târziu. O caracteristică specială a HIV este că cantitatea de anticorpi crește rapid și rămâne în sângele pacientului. Chiar dacă sunt prezente, boala poate să nu se manifeste timp de doi sau mai mulți ani. Metoda ELISA nu indică întotdeauna cu exactitate prezența bolii, necesitând confirmarea rezultatelor din secțiunile PCR și Western blot dacă imunotestul enzimatic a arătat un rezultat pozitiv.

Indicatii pentru

Ce fel de „imunoblot” a fost deja descoperit, dar care este introdus în studiu?

Motivul testării pentru virusul imunodeficienței umane (HIV) este imunoblotul. rezultat pozitiv ELISA. Este necesar să treacă printr-un test imunosorbent legat de enzime la pacienții care urmează să fie supuși unei intervenții chirurgicale. În plus, ar trebui să faceți o analiză a femeilor care plănuiesc să rămână însărcinate, precum și a celor care sunt promiscue. Secțiunile Western blot sunt prescrise pacienților cu infecție HIV dacă rezultatele Elisa sunt echivoce.

Următoarele simptome alarmante pot fi motivul pentru a contacta un medic: pierdere rapidă în greutate; slăbiciune, pierdere a funcției; tulburări intestinale (diaree), care durează trei săptămâni; deshidratare; febră; ganglioni limfatici măriți în organism; dezvoltarea candidozei, tuberculoză. , pneumonie, toxoplasmoză, exacerbare a herpesului.

Pacientul nu trebuie să se pregătească înainte de a dona sânge venos.

Nu mâncați cu 8-10 ore înainte de test. Nu este recomandat să beți alcool sau băuturi grele de cafea cu o zi înainte de a dona sânge. exercițiu fizic, simte-te entuziasmat.

Unde se face analiza?

Unde pot fi testat pentru HIV?

ELISA, analiza imunoblot, efectuată în clinicile private ale orașului, dă rezultate într-o zi. Diagnosticul urgent este de asemenea posibil. În instituțiile publice, testele medicale Elisa și secțiunile Western blot sunt gratuite, în conformitate cu legislația Federației Ruse.

Screening obligatoriu pentru boli infecțioase la femeile însărcinate și la pacienții care necesită spitalizare sau intervenție chirurgicală Cum se efectuează acest test?

Cum se efectuează ELISA? Imunoblot pozitiv/negativ confirmă sau infirmă rezultatele elisa. Procedura este destul de simplă. Specialistul recoltează sânge venos, care durează mai puțin de cinci minute.

După prelevare, locul de injectare trebuie dezinfectat și acoperit cu un bandaj. Eșantionarea se efectuează pe stomacul gol, așa că după procedură nu va strica să mănânci un baton de ciocolată neagră sau o băutură caldă dulce.

Pentru a primi o recomandare pentru un test gratuit la o instituție medicală publică, trebuie să vizitați un terapeut.

În general, imunoblotul nu diferă de alte teste de sânge prin colectare. Metodologia cercetării este simplă. Dacă un virus este prezent în sângele unei persoane, organismul începe să producă anticorpi pentru a-l distruge. Pentru fiecare virus există mulți antigeni proteici. Detectarea acestor anticorpi este baza metodei secțiunii Western blot. Preț

Cât durează analiza? Imunoblot HIV este unul dintre cele mai ieftine teste.

În medie, metodele de screening prin imunotestare variază de la 500 la 900 de ruble. Secțiunile Western blot sunt studiul testelor, al căror cost variază de la trei la cinci mii de ruble. Metodele mai complexe sunt mult mai scumpe. De exemplu, pentru analiza polimerazei reacție în lanț(PCR) va trebui să plătiți aproximativ 12.000 de ruble.

Interpretarea rezultatelor

Cele mai comune metode de diagnosticare a infecției cu HIV sunt testul imunoabsorbant legat de enzime și imunoblot.

Ele sunt utilizate pentru determinarea anticorpilor împotriva virusului imunodeficienței umane în ser. Infecția este de obicei confirmată prin două teste: screening și confirmator. Rezultatele trebuie interpretate de un medic, care diagnostichează și prescrie tratamentul. Dacă imunoblotul este pozitiv, înseamnă că există un virus în corpul uman.

Un rezultat pozitiv nu ar trebui să fie un motiv pentru un tratament independent, deoarece fiecare pacient poate avea propria sa imagine a bolii.

Analiza calitativă include screening și certificare. Dacă virusul nu este detectat la pacient, rezultatul este „negativ”. Când acest certificat este detectat, sunt efectuate studii suplimentare de screening. Analiza imunoblot, care confirmă sau infirmă screening-ul. Dacă benzile de testare apar în anumite zone întunecate (localizarea proteinelor), se pune un diagnostic de HIV.

Dacă rezultatele sunt îndoielnice, atunci testele sunt efectuate în termen de trei luni.

Pentru a preveni infectarea cu virusul imunodeficienței umane, este posibil dacă respectați anumite reguli: evitați contactul sexual ocazional, folosiți prezervative în timpul contactului, nu utilizați medicamente.

Dacă boala este detectată la o femeie însărcinată, este important să urmați recomandările medicului curant și să nu uitați să testați prezența virusului.

Ce este Western blot?

Identificarea proteinelor în amestecuri complexe sau extracte din diferite țesuturi este una dintre problemele frecvent întâlnite. Folosind un instrument precum anticorpii specifici, este posibil să se determine proteina studiată cu un timp și costuri financiare minime.

În metoda Western blotting, în prima etapă, un amestec de proteine este separat prin electroforeză în prezența dodecil sulfatului de sodiu (SDS), apoi transferat pe o membrană de nitroceluloză prin electroblotting.

Esența acestei metode este că după electroforeză gelul este plasat pe o membrană de nitroceluloză între straturi de hârtie de filtru. „Sandvișul” asamblat în acest fel este plasat într-un câmp electric, astfel încât complexele proteină-SDS să se deplaseze pe placa de gel și să fie imobilizate (ca urmare a sorbției nespecifice) pe suprafața membranei de nitroceluloză.

Forțele de legare ale complexului proteină-SDS la membrana de nitroceluloză sunt în principal natura electrica, iar această interacțiune este multipunctivă și duce la „răspândirea” proteinelor pe suprafața membranei. Astfel, după electrotransfer, obținem o replică a unui gel pe nitroceluloză cu proteine situate la fel ca într-un gel de poliacrilamidă.

După electroforeza SDS, electrotransferul și sorbția proteinelor din gel pe o membrană de nitroceluloză, conformația terțiară a proteinei este mult schimbată, dacă în general este corect să vorbim despre existența unei structuri terțiare pentru proteină după un astfel de tratament dur. Prin urmare, pentru detectarea imunochimică a proteinei studiate, sunt utilizați de obicei numai anticorpi mono- sau policlonali specifici regiunilor liniare ale moleculei proteice.

51. Imunotest enzimatic, imunoblot. Mecanism, componente, aplicație.

Anticorpii specifici pentru epitopii conformaționali (sau regiunile care implică contacte între subunități) nu sunt, în general, adecvați pentru utilizare în Western blot.

După transferul proteinei, membrana este incubată secvenţial cu anticorpi specifici proteinei studiate, iar apoi cu anticorpi secundari specifici fragmentelor Fc ale anticorpilor primari, conjugaţi cu o etichetă enzimatică (sau un alt marcaj) (Fig.

1 A). În cazul în care anticorpii primari specifici antigenului studiat sunt conjugați direct la etichetă, anticorpii secundari nu sunt necesari (Fig. 1 B). Complexele imune formate la locul de localizare a proteinei studiate sunt „manifestate” folosind un substrat cromogen (în funcție de tipul etichetei).

Sensibilitatea și specificitatea metodei depind în mare măsură de ce anticorpi sunt utilizați în cercetare.

Anticorpii utilizați trebuie să fie specifici unei secvențe unice de aminoacizi, caracteristică numai proteinei studiate. În caz contrar, este posibilă interacțiunea (mai ales în cazul extractelor de proteine brute) a anticorpilor cu mai multe molecule de proteine, ceea ce la rândul său va duce la apariția mai multor benzi colorate pe membrană.

Identificarea proteinei studiate în acest caz este adesea dificilă sau chiar imposibilă.

Al doilea factor important de avut în vedere atunci când alegeți anticorpi este afinitatea. Cu cât afinitatea anticorpilor utilizați este mai mare, cu atât benzile proteice sunt mai strălucitoare și mai clare, cu atât sensibilitatea metodei este mai mare. Când se utilizează anticorpi cu afinitate mare, se poate obține o sensibilitate de 1 ng sau chiar mai mare.

Pentru a vizualiza rezultatul interacțiunii dintre un antigen legat de membrană și anticorpi, se folosesc anticorpi secundari, conjugați cu agenți capabili să producă un anumit semnal în anumite condiții.

De obicei, este utilizată o enzimă (peroxidază sau fosfatază) ca un astfel de agent, al cărei produs de reacție este colorat și precipită pe membrană sub formă de precipitat insolubil.

De asemenea, în aceasta metoda este posibil să se utilizeze etichete fluorescente.

Orez. 1. Schema de colorare imunochimică a proteinei studiate: A - folosind anticorpi secundari conjugați la o etichetă enzimatică; B - anticorpul primar este conjugat direct la o etichetă enzimatică.

Protocol:

I. Prepararea gelului și membranelor și electrotransferul proteinelor

După electroforeză, gelul de poliacrilamidă este plasat într-o baie cu tampon de blotting (25 mM Tris, pH 8,3, 192 mM glicină, 10% etanol).

Două coli de hârtie de filtru, tăiate după forma casetei de blotting și umezite cu tampon de blotting, sunt plasate pe partea casetei care va fi îndreptată spre anod. Apoi pe hârtia de filtru se pune o membrană de nitroceluloză pre-umezită cu același tampon, asigurându-se că între membrană și hârtie nu există bule de aer.

După aceasta, gelul trebuie așezat cu grijă pe membrană, întorcându-se din nou Atentie speciala pentru absența bulelor de aer între gel și membrană. Formarea sandvișului este completată de două straturi de hârtie de filtru umezită, care sunt așezate pe suprafața gelului (Fig. 2). Sandvișul rezultat este prins într-o casetă și plasat între electrozi, astfel încât membrana să fie orientată spre anod.

Orez. 2. Schema electrotransferului proteinelor către membrană.

II. Transfer electric

Electrotransferul proteinelor pe o membrană de nitroceluloză se efectuează într-un tampon care conține 25 mM Tris, pH 8,3, 192 mM glicină, 10% etanol timp de 30-50 min la o tensiune constantă de 100 V.

Timpul electrotransferului depinde de mărimea proteinelor transferate; cu cât proteina este mai mare, cu atât electrotransferul durează mai mult. Calitatea electrotransferului și localizarea benzilor de proteine sunt evaluate prin colorarea membranei de nitroceluloză cu o soluție 0,3% de Ponceau S în 1% acid acetic. Înainte de colorarea imunochimică, membrana trebuie spălată de mai multe ori cu slab alcalin soluție apoasă Tris pentru a elimina colorantul legat de proteine.

III. Colorarea imunochimică a proteinelor imobilizate pe o membrană de nitroceluloză

Pentru a bloca locurile de legare nespecifică a anticorpilor, membrana este incubată cu agitare constantă la temperatura camerei timp de 30 de minute în PBST (pentru mai bine blocare Se poate folosi o soluție PBST care conține 10% lapte praf degresat).

După blocare, membrana este incubată timp de o oră la temperatura camerei cu agitare constantă în PBST care conține 1-10 μg/ml de anticorpi specifici.

Concentrația optimă de anticorpi este selectată empiric și depinde de afinitatea interacțiunii anticorpilor cu antigenul.

La sfârșitul incubației, se spală membrana de 5 ori cu PBST și se transferă într-o soluție de anticorpi secundari conjugați cu peroxidază de hrean. Diluția conjugatului este de obicei indicată de producător pe ambalaj sau este selectată empiric de către cercetător. Se incubează membrana în soluția de anticorp secundar timp de 1 oră cu agitare constantă.

După spălare minuțioasă (schimbați tamponul de cel puțin 5-6 ori), membrana PBST este transferată într-o soluție de substrat cromogenă care conține 3 mg de diaminobenzidină (DAB) și 10 μl de peroxid de hidrogen 30% în 10 ml de Tris-HCl 0,1 M. , pH 7,6.

Incubarea se efectuează cu agitare timp de 5 - 10 minute. După terminarea incubării cu substratul, membrana trebuie spălată cu PBST, uscată prin tamponare cu hârtie de filtru și imediat copie electronică, scanare color. Dacă membrana se usucă complet, dungile proteice pictate se estompează, iar imaginea se dovedește a fi mai puțin strălucitoare și contrastantă.

Notă: DAB este toxic și un potențial cancerigen. Lucrați numai cu mănuși de cauciuc!