Piața terapiei genice are potențialul de a deveni cea mai rapidă piață din lume în următorii 10 ani. Perspectivele pe care le deschide manipularea genetică îi motivează pe reprezentanții Big Pharma nu numai să-și desfășoare propriile cercetări, ci și să cumpere în mod activ cele mai promițătoare companii.
Gigantul farmaceutic Novartis, aparent, poate marca începutul introducerii pe scară largă a terapiei genice în practica clinică globală: FDA produse alimentare and Medicines (Food and Drug Administration, FDA) a aprobat utilizarea terapiei genice pentru pacienții cu vârsta cuprinsă între 3 și 25 de ani care suferă de leucemie limfoblastică acută.
Tratamentul ajută la obținerea remisiunii și, în unele cazuri, chiar la înfrângerea bolii. Mass-media a numit pe bună dreptate acest eveniment „noua eră a medicinei” - umanitatea, cu ajutorul manipulării genetice, face față treptat bolilor incurabile anterior.
Să ne uităm înapoi la ceea ce a condus la începutul „noii ere” și să vedem încotro se îndreaptă una dintre cele mai promițătoare piețe.
Cum a început totul
În urmă cu aproximativ 15 ani, oamenii de știință au reușit să „citească” genomul și, în sfârșit, să obțină acces la „codul sursă” al corpului uman, care stochează toate datele necesare despre acesta și, cel mai important, îi controlează viața și moartea. A fost nevoie de încă câțiva ani pentru a înțelege cunoștințele acumulate și a începe treptat să le transpunem în domeniu aplicare practică: mai întâi în diagnostic și apoi în practica clinică.
În ultimii 100 de ani, gestionarea agenților patogeni diverse boli, la fel ca virusurile și bacteriile, știința a învățat destul de bine - datorită vaccinurilor și antibioticelor - dar bolile cauzate de mutații ale genelor au fost mult timp considerate incurabile. Prin urmare, descifrarea a peste 3 miliarde de perechi de nucleotide a deschis perspective cu adevărat nelimitate pentru dezvoltarea „medicamentului viitorului” - în primul rând terapie genetică preventivă și, în mod ideal, medicină complet personalizată.
Experții de pe piață prevăd o creștere rapidă în aceste domenii: piața terapiei genetice pentru cancer este proiectată să ajungă la 4 miliarde de dolari până în 2024, piața de terapie genetică în ansamblu este estimată să atingă 11 miliarde de dolari până în 2025, iar previziunile pentru toate medicamentele personalizate sunt și mai optimiste: de la 149 de miliarde de dolari în 2020 la 2,5 trilioane de dolari până în 2022.
Primele roade ale descifrării genomului uman au fost îmbunătățirea diagnosticului bolilor congenitale sau predispoziție la acestea (mulți își vor aminti cazul cu gena BRCA1 și Angelina Jolie). În acest context, piața așa-numitei „genetici de consum” a început să se dezvolte rapid - până în 2020 va crește la 12 miliarde de dolari.
Testele genetice oferă pacientului posibilitatea de a efectua o analiză și de a găsi „gene rele” în corpul său sau, dimpotrivă, să se bucure de absența lor. Inițial destul plăcere scumpă(999–2500 USD) au devenit din ce în ce mai disponibile pe măsură ce costurile de secvențiere au scăzut. De exemplu, prețul unui studiu cuprinzător oferit astăzi de unul dintre liderii pieței mondiale, 23andMe, este de 199 USD. În Rusia, prețurile sunt puțin mai mari: de la 20.000 la 30.000 de ruble.
În plus, terapia țintită devine o realitate, ceea ce este deosebit de important nu numai pentru bolile ereditare, ci și pentru bolile cardiovasculare și infecțioase, precum și pentru oncologie - principalele cauze de deces în întreaga lume. Manipularea genetică face posibilă introducerea genelor „bune” într-un pacient pentru a compensa problemele cauzate de funcționarea proastă a genelor „rele” - de exemplu, ca în cazul hemofiliei, iar în viitor vor permite, de asemenea, „repararea”. ” sau elimina complet genele dăunătoare – de exemplu, cele care provoacă boala neurodegenerativă Huntington. În timp ce terapia genică ocupă un loc foarte modest pe piața farmaceutică, cota sa va crește cu siguranță.
Desigur, există încă multe probleme care trebuie rezolvate: acestea sunt riscul ridicat de reacții imune, costul ridicat al terapiei și, poate, chiar și problemele etice asociate cu efectuarea modificărilor organismului uman la nivel genetic. Cu toate acestea, astfel de manipulări reprezintă o șansă pentru pacienții ale căror boli sunt fie considerate incurabile, fie nu pot fi tratate eficient cu medicamentele existente, precum și o nouă armă în lupta împotriva îmbătrânirii, dând omenirii speranță pentru o longevitate sănătoasă la un nivel complet diferit și piață - altele noi, unde căi mai promițătoare pentru dezvoltare.
Primele victorii
Acest program începe să funcționeze din momentul pubertății și duce încet dar inexorabil la moarte. În plus, acesta este un proces destul de reglementat. Fiecare specie are o limită clară de viață care îi este alocată. La un șoarece, de exemplu, este în medie 2,5 ani, la o persoană este de aproximativ 80 de ani. În același timp, există și alte rozătoare care trăiesc de mai multe ori sau chiar cu un ordin de mărime mai mult decât șoarecii - de exemplu, veverițele sau celebrul șobolan aluniță gol.
Principala întrebare este dacă îmbătrânirea poate fi oprită sau măcar încetinită. Poate că o tehnologie revoluționară care inversează dezvoltarea celulară, descoperită de Shinya Yamanaka, profesor la Institutul de Științe Medicale Avansate de la Universitatea din Kyoto, va ajuta să răspundă la această întrebare: el a descoperit că inducerea coexpresiei a patru factori de transcripție (Oct4, Sox2, Klf4 și c-Myc și toate împreună - OSKM, sau factorii Yamanaka), care sunt strâns legați de principalele etape ale ciclului de viață celular, transformă celulele somatice înapoi în celule pluripotente. Pentru această descoperire cu adevărat revoluționară, Yamanaka a primit Premiul Nobel în 2012.
Folosind descoperirea lui Yamanaka, o echipă de oameni de știință a Institutului Salk condusă de Juan Carlos Izpisua Belmonte a încercat să exploateze acest mecanism natural de resetare. ceasul biologic pentru a prelungi viața animalelor adulte. Și nu m-am înșelat. Folosind factorii Yamanaka, ei au reușit să confirme ipoteza despre posibilitatea de a inversa „ceasul epigenetic”, adică întinerirea celulelor, și de a crește speranța medie de viață a șoarecilor cu îmbătrânire rapidă cu 33%-50% în comparație cu diferite grupuri de control. .
16886 0
Stabilirea locației și secvenței unei gene ale cărei mutații provoacă boli specifice, precum și mutația în sine și metode moderne testarea sa face posibilă diagnosticarea bolii în perioada neo- și chiar prenatală a dezvoltării organismului. Acest lucru face posibilă atenuarea manifestării unui defect genetic cu ajutorul tratament medicamentos, diete, transfuzii de sânge etc.
Cu toate acestea, această abordare nu duce la corectarea defectului în sine și, de regulă, bolile ereditare nu sunt vindecate. Situația este și mai complicată de faptul că o mutație într-o genă poate avea efecte foarte diferite asupra organismului. Dacă o mutație genică determină modificări ale activității enzimei pe care o codifică, aceasta poate duce la acumularea unui substrat toxic sau, dimpotrivă, la o deficiență a unui compus necesar pentru funcționarea normală a celulei.
Un exemplu binecunoscut al unei astfel de boli este fenilcetonuria. Este cauzată de o mutație a genei pentru enzima hepatică fenilalanin dehidroxilază, care catalizează conversia fenilalaninei în tirozină. Ca urmare, nivelul de fenilalanină endogene din sânge crește, ceea ce provoacă formarea necorespunzătoare a tecii de mielină din jurul axonilor. celulele nervoase sistemul nervos central și, în consecință, retard mintal sever.
Dacă o mutație afectează o genă structurală a proteinei, poate duce la tulburări grave la nivelul celulelor, țesuturilor sau organelor. Un exemplu de astfel de boală este fibroza chistică.
O deleție a genei care codifică o proteină numită transportor de fibroză chistică are ca rezultat sinteza proteică defectuoasă (lipsă de fenilalanină 508) și transportul afectat al ionilor de clorură prin membranele celulare. Unul dintre cele mai dăunătoare efecte ale acestui lucru este că mucusul care căptușește și protejează plămânii devine anormal de gros. Acest lucru face dificilă accesul la celulele pulmonare și promovează acumularea de microorganisme dăunătoare. Celulele care căptușesc căile respiratorii ale plămânilor mor și sunt înlocuite cu țesut cicatricial fibros (de unde și numele bolii). Ca urmare, pacientul moare din cauza insuficienței respiratorii.
Bolile ereditare sunt complexe manifestări clinice, iar tratamentul lor tradițional este în principal simptomatic: pentru tratamentul fenilcetonuriei este prescrisă o dietă fără alanină, proteinele defecte sunt înlocuite cu altele funcționale administrare intravenoasă Pentru a compensa funcțiile pierdute, se efectuează transplant de măduvă osoasă sau alt organ. Toate aceste măsuri sunt de obicei ineficiente, costisitoare, consumatoare de timp și doar câțiva pacienți trăiesc până la bătrânețe. Prin urmare, dezvoltarea unor tipuri fundamental noi de terapie este foarte importantă.
Terapia genică
Terapia genică este ingineria genetică a celulelor somatice umane menită să corecteze un defect genetic, provocând boala. Corectarea unei anumite boli se realizează prin introducerea de gene exprimate în mod normal în celulele somatice defecte. În anii 1980, când s-au dezvoltat metode de obținere a genelor individuale și au fost creați vectori de expresie eucarioți, experimentele de transfer de gene la șoareci au devenit de rutină, iar perspectivele de corecție a genelor au devenit reale.În 1990, în Statele Unite, Dr. W. French Andrson a făcut prima încercare de terapie genică pentru a trata imunodeficiența combinată severă (SCID) la o fetiță de trei ani, Ashanti da Silva. Această boală este cauzată de o mutație a genei care codifică adenosanadenilaza (ADA). Deficiența acestei enzime contribuie la acumularea de adenozină și deoxiadenozină în sânge, efect toxic ceea ce duce la moartea limfocitelor B și T din sângele periferic și, în consecință, la imunodeficiență.
Copiii cu această boală trebuie protejați de orice infecții (ținuți în camere sterile speciale), deoarece orice boală poate fi fatală. La patru ani de la începerea tratamentului, copilul a arătat expresia unui ADA care funcționează normal și ameliorarea simptomelor SCID, permițându-i să părăsească camera sterilă și să ducă o viață normală.
Astfel, a fost demonstrată posibilitatea fundamentală a terapiei genetice de succes a celulelor somatice. Din anii 90. O serie de terapii genetice sunt testate boli genetice, inclusiv cele severe precum hemofilia, SIDA, diferite tipuri neoplasme maligne, fibroza chistica etc în acest moment Aproximativ 10 boli umane pot fi deja vindecate folosind transgeneza.
Diversitatea bolilor genetice a condus la dezvoltarea multor abordări de terapie genetică. În acest caz, sunt rezolvate 2 probleme principale: un mijloc de eliberare a genei terapeutice; o metodă pentru asigurarea livrării țintite către celulele destinate corectării. Până în prezent, toate abordările de terapie genetică a celulelor somatice pot fi împărțite în două categorii: terapia ex vivo și terapia in vivo (Fig. 3.15).
Orez. 3.15. Schema terapiei genice ex vivo (a) și in vivo (a)
Terapia genică ex vivo implică corectarea genetică a celulelor defecte din afara corpului și apoi întoarcerea celulelor care funcționează normal înapoi în organism.
Terapia genică in vivo implică livrarea unei gene terapeutice direct în celulele unui țesut specific pacientului. Să ne uităm la aceste abordări mai detaliat.
Terapia genică ex vivo include următorii pași:
1) obținerea de celule defecte de la pacient și cultivarea acestora;
2) transferul genei dorite în celule izolate utilizând transfecţia unui construct de genă terapeutică;
3) selecția și extinderea celulelor corectate genetic;
4) transplantul sau transfuzia acestor celule la pacient.
Utilizarea celulelor proprii ale pacientului asigură că acestea nu vor dezvolta un răspuns imun atunci când sunt returnate. Procedura de transfer al constructului genic trebuie să fie eficientă, iar gena normală trebuie menținută stabil și exprimată continuu.
Mijloacele de transfer de gene create de natura însăși sunt viruși. Pentru a obține vectori eficienți pentru livrarea genelor, se folosesc în principal două grupe de viruși - adenovirusuri și retrovirusuri (Fig. 3.16). În terapia genică se folosesc variante de virusuri neutralizate genetic.
Orez. 3.16. Virușii utilizați pentru a crea vectori terapeutici
Să luăm în considerare proiectarea și utilizarea modelelor bazate pe retrovirusuri. Să reamintim că genomul unui retrovirus este reprezentat de două molecule de ARN monocatenar identice, fiecare dintre ele constând din șase secțiuni: două repetiții terminale lungi (LTR) la capetele de 5" și 3", secvența necodificatoare * P+, necesar pentru ambalarea ARN-ului în particula virală și trei regiuni care codifică proteina structurală a capsidei interne (gag), transcriptaza inversă (pol) și proteina învelișului (env) (Fig. 3.17a).
Orez. 3.17. Harta genetică a unui retrovirus tipic (a) și harta unui vector retroviral (a)
Să ne amintim că ciclul de viață al unui retrovirus include următoarele etape:
1. Infecția celulelor țintă.
2. Sinteza unei copii ADN a genomului folosind propria sa revers transcriptază.
3. Transportul ADN-ului viral în nucleu.
4. Încorporarea ADN-ului viral în cromozomul celulei gazdă.
5. Transcrierea ARNm din ADN viral sub controlul unui promotor puternic localizat în regiunea 5"-LTR.
6. Traducerea proteinelor Gag, Pol și Env.
7. Formarea capsidei virale și ambalarea a două lanțuri de ARN și molecule de revers transcriptază.
8. Eliberarea virionilor din celulă.
La obținerea unui vector retroviral, ADN-ul de lungime completă al retrovirusului este inserat într-o plasmidă, cea mai mare parte a genei gag și întreaga genă pol și env sunt îndepărtate, iar în locul lor, o genă T „terapeutică” și, dacă este necesar. , se inserează o genă marker selectivă Rg cu propriul său promotor (Fig. 3.17, b). Transcripția genei T va fi controlată de același promotor puternic localizat în regiunea 5"-LTR. Pe baza acestei scheme, au fost creați diverși vectori retrovirali și o dimensiune maximă a inserției ADN de aproximativ 8 mii bp.
Construcția obținută în acest mod poate fi folosit în sine pentru transformare, dar eficiența sa și integrarea ulterioară în genomul celulei gazdă sunt extrem de scăzute. Prin urmare, a fost dezvoltată o tehnică de ambalare a ARN-ului de lungime completă al unui vector retroviral în particule virale intacte, care pătrund în celulă cu frecvență înaltă și sunt garantate a fi integrate în genomul gazdei. În acest scop, a fost creată o așa-numită linie celulară de „ambalare”. În două secțiuni diferite ale cromozomilor acestor celule sunt încorporate genele retrovirale gag și pol-env, lipsite de capacitatea de a se împacheta din cauza lipsei secvenței + (84*+) (Fig. 3.18).
Orez. 3.18. Schemă pentru obținerea unui vector viral ambalat
Adică, ambele fragmente sunt transcrise, dar se formează capside goale lipsite de ARN. Când ARN-ul vector viral este transfectat în astfel de celule, acesta este integrat în ADN-ul cromozomial și transcris pentru a forma ARN retroviral de lungime completă, iar în astfel de condiții doar ARN-ul vector este împachetat în capside (doar acesta conține secvența +). Particulele virale intacte rezultate sunt utilizate pentru livrarea eficientă a vectorului retroviral către celulele țintă.
Retrovirusurile infectează în mod activ doar celulele cu diviziune rapidă. Pentru a transfera gene, acestea sunt tratate cu particule purificate ale vectorului retroviral ambalat sau co-cultivate cu linia celulară care le produce, și apoi selectate pentru a separa celulele țintă de celulele de ambalare.
Celulele transduse sunt verificate cu atenție pentru nivelul de sinteză a produsului genei terapeutice, absența retrovirusurilor competente de replicare și absența modificărilor în capacitatea celulelor de a crește sau de a funcționa.
Celulele măduvei osoase sunt cele mai potrivite pentru terapia genică. Acest lucru se datorează prezenței celulelor stem embrionare totipotente, care pot prolifera și se pot diferenția în diferite tipuri de celule - limfocite B și T, macrofage, eritrocite, trombocite și osteoclaste. Aceste celule sunt folosite pentru a trata o serie de boli ereditare, inclusiv deja menționată imunodeficiența combinată severă, boala Gaucher, anemia secerată, talasemia, osteoporoza etc.
Pe lângă celulele stem totipotente din măduva osoasă, care sunt greu de izolat și de cultivat, se folosesc celule stem din sângele din cordonul ombilical (utilizarea preferată pentru terapia genică la nou-născuți), precum și celule hepatice - hepatocite - pentru tratarea hipercolesterolemiei.
În terapia genică in vivo, este deosebit de important să se asigure livrarea genei terapeutice la celulele defecte. O astfel de livrare țintită poate fi asigurată de vectori modificați creați pe baza unor viruși capabili să infecteze tipuri specifice celule. Luați în considerare abordarea dezvoltată pentru tratamentul fibrozei chistice deja menționată mai sus. Deoarece plămânii sunt o cavitate deschisă, este relativ ușor să le livrezi gene terapeutice. Versiunea clonată a genei sănătoase a fost introdusă într-un adenovirus inactivat (Fig. 3.19). Specificul acestui tip de virus este că infectează mucoasa plămânilor, provocând o răceală.
Orez. 3.19. Schema de obtinere a unui vector bazat pe adenovirus
Virusul astfel construit a fost testat prin pulverizarea lui în nasul și plămânii animalelor de experiment și apoi pe pacienți umani. În unele cazuri, s-a observat introducerea și exprimarea unei gene sănătoase și restabilirea transportului normal de ioni de clorură. Este posibil ca această abordare (introducerea unei gene normale folosind spray-uri nazale) să fie utilizată pe scară largă în viitorul apropiat pentru a trata simptomele fibrozei chistice în plămâni.
Pe lângă retro- și adenovirusuri, în experimentele de terapie genetică sunt utilizate și alte tipuri de virusuri, de exemplu virusul Herpes simplex. O caracteristică specială a acestui virus ADN dublu catenar (152 kb) este capacitatea sa de a infecta în mod specific neuronii. Există multe boli genetice cunoscute care afectează central și periferic sistemul nervos- tumori, tulburari metabolice, boli neurodegenerative (boala Alzheimer, boala Parkinson).
Virusul herpes simplex tip I (HSV) este un vector foarte potrivit pentru tratamentul unor astfel de boli. Capsida acestui virus fuzionează cu membrana neuronului, iar ADN-ul acestuia este transportat către nucleu. Au fost propuse mai multe metode pentru transferul unei gene terapeutice folosind vectori HSV și au fost efectuate teste de succes pe animale de experiment.
Vectorii virali au mai multe dezavantaje: cost ridicat, capacitate de clonare limitată și posibil răspuns inflamator. Astfel, în 1999, ca urmare a dezvoltării unui răspuns imun neobișnuit de puternic la introducerea unui vector adenoviral, a murit un voluntar de 18 ani care a luat parte la studiile de medicamente. În 2002, doi copii din Franța au dezvoltat o afecțiune asemănătoare leucemiei în timp ce erau tratați pentru imunodeficiență (prin introducerea de gene terapeutice în celulele stem folosind retrovirusuri).
Prin urmare, sunt dezvoltate sisteme de livrare a genelor non-virale. Cel mai simplu și cel mai mult mod eficient- Aceasta este injectarea de ADN plasmidic în țesuturi. A doua abordare este bombardarea țesuturilor cu microparticule de aur (1-3 microni) conjugate la ADN. În acest caz, genele terapeutice sunt exprimate în țesuturile țintă și produsele lor - proteinele terapeutice - intră în sânge. Principalul dezavantaj al acestei abordări este inactivarea sau distrugerea prematură a acestor proteine de către componentele sanguine.
ADN-ul poate fi livrat prin ambalarea lui într-o înveliș lipidic artificial. Particulele de lipozom sferice obținute astfel pătrund ușor în membrana celulară. Au fost creați lipozomi cu o varietate de proprietăți, dar până acum eficiența unei astfel de livrări este scăzută, de atunci cele mai multe ADN-ul suferă distrugere lizozomală. De asemenea, pentru a furniza un construct genetic, conjugatele ADN sunt sintetizate cu diverse molecule care pot asigura siguranța acestuia, livrarea țintită și pătrunderea în celulă.
În ultimii ani, au fost efectuate experimente intensive pentru a crea un cromozom artificial 47, care ar permite includerea unei cantități mari de material genetic cu un set complet de elemente de reglare pentru una sau mai multe gene terapeutice. Acest lucru ar face posibilă utilizarea unei variante genomice a unei gene terapeutice și, prin urmare, ar asigura stabilitatea și expresia eficientă pe termen lung a acesteia. Experimentele au arătat că crearea unui cromozom uman artificial care conține gene terapeutice este destul de posibilă, dar încă nu este clar cum să se introducă o moleculă atât de uriașă în nucleul unei celule țintă.
Principalele provocări cu care se confruntă terapia genică, pe lângă riscul unei reacții imune severe, sunt dificultățile depozitare pe termen lungși funcționarea ADN-ului terapeutic în corpul pacientului, natura multigenică a multor boli, făcându-le ținte dificile pentru terapia genică, precum și riscul utilizării virusurilor ca vectori.
N / A. Voinov, T.G. Volova
De-a lungul istoriei sale relativ scurte, terapia genică a suferit suișuri și coborâșuri: uneori oamenii de știință și practicienii au văzut-o ca aproape un panaceu, iar apoi a urmat o perioadă de dezamăgire și scepticism...
Ideile despre posibilitatea introducerii genelor în organism în scop terapeutic au fost exprimate încă de la începutul anilor 60 ai secolului trecut, dar pași reali au fost făcuți abia la sfârșitul anilor 80 și au fost strâns legați de proiectul internațional de descifrare a genomului uman.
În 1990, s-a încercat terapia genică pentru imunodeficiența ereditară severă, adesea incompatibilă cu viața, cauzată de un defect al genei care codifică sinteza enzimei adenozin deaminazei. Autorii studiului au raportat un efect terapeutic clar. Și deși de-a lungul timpului au apărut o serie de îndoieli cu privire la durabilitatea efectului obținut și a mecanismelor sale specifice, această lucrare a fost cea care a servit ca un impuls puternic pentru dezvoltarea terapiei genice și a atras investiții de miliarde de dolari.
Terapia genică este o abordare medicală bazată pe introducerea de construcții genetice în celule pentru a trata diferite boli. Efectul dorit este atins fie ca urmare a exprimării genei introduse, fie prin suprimarea funcției genei defectuoase. Trebuie subliniat faptul că scopul terapiei genice nu este „tratarea” genelor ca atare, ci tratarea diferitelor boli cu ajutorul lor.
De regulă, un fragment de ADN care conține gena necesară este folosit ca „medicament”. Poate fi pur și simplu „ADN gol”, de obicei în combinație cu lipide, proteine etc. Dar mult mai des, ADN-ul este introdus ca parte a unor constructe genetice speciale (vectori) create pe baza unei varietăți de viruși umani și animale folosind o numărul de manipulări de inginerie genetică. De exemplu, genele necesare pentru reproducerea sa sunt eliminate din virus. Acest lucru, pe de o parte, face ca particulele virale să fie practic sigure, pe de altă parte, „eliberează spațiu” pentru genele destinate introducerii în organism.
Punctul fundamental al terapiei genice este pătrunderea constructului genic în celulă (transfecția), în marea majoritate a cazurilor - în nucleul acesteia. Este important ca constructul genei să ajungă exact la acele celule care trebuie „tratate”. Prin urmare, succesul terapiei genice depinde în mare măsură de alegerea metodei optime sau cel puțin satisfăcătoare de introducere a constructelor genice în organism.
Cu vectorii virali, situația este mai mult sau mai puțin previzibilă: aceștia se răspândesc în tot organismul și pătrund în celule precum virușii lor strămoși, oferind suficient nivel înalt specificitatea de organ și țesut. Astfel de constructe sunt de obicei administrate intravenos, intraperitoneal, subcutanat sau intramuscular.
O serie de vectori non-virali au fost dezvoltați pentru „livrare țintită” metode speciale. Cea mai simplă metodă livrarea genei dorite la celule in vivo - injectarea directă a materialului genetic în țesut. Utilizarea acestei metode este limitată: injecțiile pot fi făcute numai în piele, timus, mușchii striați și unele tumori solide.
O altă metodă de livrare a transgenelor este transfecția balistică. Se bazează pe „decojirea” organelor și țesuturilor cu microparticule de metale grele (aur, wolfram) acoperite cu fragmente de ADN. Pentru „bombaj” folosesc un „pistol genetic” special.
La tratarea bolilor pulmonare, este posibilă introducerea materialului genetic în tractului respirator sub formă de aerosol.
Transfecția celulară poate fi efectuată și ex vivo: celulele sunt izolate din organism, manipulate genetic și apoi reintroduse în corpul pacientului.
Tratăm: ereditare...
În stadiul inițial de dezvoltare a terapiei genice, obiectele sale principale au fost considerate a fi boli ereditare cauzate de absența sau funcția insuficientă a unei gene, adică cele monogenice. S-a presupus că introducerea unei gene care funcționează normal unui pacient ar duce la vindecarea bolii. Au fost făcute încercări repetate de a trata „boala regală” - hemofilie, distrofie musculară Duchenne, fibroză chistică.
Astăzi, metodele de terapie genetică sunt dezvoltate și testate pentru aproape 30 de boli umane monogenice. Între timp, rămân mai multe întrebări decât răspunsuri și, în majoritatea cazurilor, nu s-a obținut un efect terapeutic real. Motivele pentru aceasta, în primul rând, sunt reacția imună a organismului, „atenuarea” treptată a funcțiilor genei introduse, precum și incapacitatea de a realiza integrarea „țintită” a genei transferate în ADN-ul cromozomial.
Mai puțin de 10% din studiile de terapie genică sunt dedicate bolilor monogenice, în timp ce restul se referă la patologii neereditare.
...si dobandit
Bolile dobândite nu sunt asociate cu un defect congenital în structura și funcția genelor. Terapia lor genică se bazează pe principiul că o „genă terapeutică” introdusă în organism ar trebui să conducă la sinteza unei proteine care fie va avea un efect terapeutic, fie va contribui la creșterea sensibilității individuale la efectele medicamentelor.
Terapia genică poate fi utilizată pentru prevenirea cheagurilor de sânge, refacerea sistemului vascular al mușchiului inimii după infarct miocardic, prevenirea și tratarea aterosclerozei, precum și în lupta împotriva infecției cu HIV și a cancerului. De exemplu, o metodă de terapie genică pentru tumori, cum ar fi creșterea sensibilității celulelor tumorale la medicamentele pentru chimioterapie, este în curs de dezvoltare intensivă, se desfășoară studii clinice cu participarea pacienților cu mezoteliom pleural, cancer ovarian și glioblastom. În 1999, a fost aprobat un protocol pentru tratamentul cancerului de prostată, au fost selectate doze sigure de chimioterapie și s-a demonstrat un efect terapeutic pozitiv.
Siguranță și Etică
Efectuarea manipulărilor genetice cu corpul uman impune cerințe speciale de siguranță: la urma urmei, orice introducere de material genetic străin în celule poate avea consecințe negative. Integrarea necontrolată a genelor „noi” în anumite părți ale genomului pacientului poate duce la perturbarea funcției genelor „proprii”, care, la rândul lor, pot provoca modificări nedorite în organism, în special formarea de tumori canceroase.
În plus, pot apărea modificări genetice negative în celulele somatice și germinale. În primul caz, vorbim despre soarta unei persoane, unde riscul asociat corecției genetice este incomparabil mai mic decât riscul de deces din cauza unei boli existente. Când constructele genice sunt introduse în celulele germinale, modificările nedorite ale genomului pot fi transmise generațiilor viitoare. Prin urmare, pare complet firesc să se dorească interzicerea experimentelor privind modificarea genetică a celulelor germinale nu numai din motive medicale, ci și din motive etice.
O serie de probleme morale și etice sunt asociate cu dezvoltarea abordărilor pentru intervenția genelor în celulele unui embrion uman în curs de dezvoltare, adică cu terapia genică intrauterină (terapie in utero). În SUA, posibilitatea utilizării terapiei genice in uter este luată în considerare numai pentru două boli genetice severe: imunodeficiența combinată severă cauzată de un defect al genei enzimei adenozin deaminazei și beta-talasemia homozigotă - severă. boala ereditara, asociat cu absența tuturor celor patru gene globinei sau mutații în ele. O serie de construcții genetice au fost deja dezvoltate și sunt în curs de pregătire pentru testarea preliminară, a căror livrare către organism este de așteptat să conducă la compensarea defectelor genetice și la eliminarea simptomelor acestor boli. Cu toate acestea, riscul de consecințe genetice negative ale unor astfel de manipulări este destul de mare. Prin urmare, etica terapiei genice intrauterine rămâne, de asemenea, controversată.
În ianuarie a acestui an, experimentele privind terapia genică au fost din nou interzise temporar în Statele Unite. Motivul a fost complicații periculoase care a apărut la doi copii după terapia genică pentru imunodeficiența ereditară. În urmă cu câteva luni, în Franța, unul dintre copiii despre care se credea a fi vindecat prin terapie genică a fost diagnosticat cu un sindrom asemănător leucemiei. Experții nu exclud că utilizarea vectorilor bazați pe retrovirus în timpul terapiei poate fi cauza dezvoltării complicațiilor la copii. Acum reprezentanți ai Agenției pentru Controlul Alimentelor și medicamente(FDA) va lua în considerare continuarea experimentelor de terapie genică în individual, și numai dacă nu există alte metode de tratare a bolii.
Nu un panaceu, ci o perspectivă
Nu se poate nega faptul că succesul real al terapiei genice în tratarea anumitor pacienți este destul de modest, iar abordarea în sine este încă în stadiul acumulării de date și dezvoltării tehnologiei. Terapia genică nu a fost și, evident, nu va deveni niciodată un panaceu. Sistemele de reglare ale organismului sunt atât de complexe și atât de puțin studiate încât simpla introducere a unei gene în majoritatea cazurilor nu produce efectul terapeutic necesar.
Cu toate acestea, cu toate acestea, promisiunea terapiei genice poate fi cu greu supraestimată. Există toate motivele să sperăm că progresul în domeniul geneticii moleculare și al tehnologiilor de inginerie genetică va duce la un succes fără îndoială în tratamentul bolilor umane folosind gene. Și, în cele din urmă, terapia genică își va lua pe bună dreptate locul în medicina practică.
Se pare că terapia genică poate avea unele aplicații neașteptate. Potrivit oamenilor de știință, Jocurile Olimpice vor avea loc în 2012, unde vor evolua super-sportivi transgenici. „Dopajul ADN” va oferi avantaje incontestabile
în dezvoltarea forței, rezistenței și vitezei. Nu există nicio îndoială că în condițiile unei competiții acerbe în sport vor exista sportivi care sunt pregătiți pentru modificarea genetică, chiar și ținând cont de posibilele riscuri asociate cu utilizarea noii tehnologii.
Terapia genetică umană, într-un sens larg, implică introducerea unei gene activ(e) funcțional în celule pentru a corecta un defect genetic. Există două moduri posibile de a trata bolile ereditare. În primul caz, celulele somatice (altele decât celulele germinale) sunt supuse transformării genetice. În acest caz, corectarea unui defect genetic este limitată la un anumit organ sau țesut. În cel de-al doilea caz, genotipul celulelor germinale (sperma sau ovule) sau al ouălor fecundate (zigoți) este modificat astfel încât toate celulele individului care se dezvoltă din acestea au genele „corectate”. Prin terapia genică folosind celule germinale, modificările genetice sunt transmise din generație în generație.
Politica de terapie genetică cu celule somatice.
În 1980, reprezentanții comunităților catolice, protestante și evreiești din Statele Unite au scris o scrisoare deschisă către președinte în care își prezintă punctele de vedere cu privire la utilizarea ingineriei genetice în relație cu oamenii. Au fost create o comisie prezidențială și o comisie a Congresului pentru a evalua aspectele etice și sociale ale acestei probleme. Acestea au fost inițiative foarte importante, deoarece în Statele Unite punerea în aplicare a programelor care afectează interesul public se realizează adesea pe baza recomandărilor unor astfel de comisii. Concluziile finale ale ambelor comisii au făcut o distincție clară între terapia genică a celulelor somatice și terapia genică a celulelor germinale. Terapia genică a celulelor somatice a fost clasificată ca o metodă standard de intervenție medicală în organism, similară cu transplantul de organe. În schimb, terapia genică a celulelor germinale a fost considerată prea dificilă din punct de vedere tehnologic și prea dificilă din punct de vedere etic pentru a fi implementată imediat. S-a ajuns la concluzia că este nevoie de a dezvolta reguli clare care să guverneze cercetarea în domeniul terapiei genice a celulelor somatice; elaborarea unor documente similare în legătură cu terapia genică a celulelor germinale a fost considerată prematură. Pentru a opri toate activitățile ilegale, s-a decis oprirea tuturor experimentelor din domeniul terapiei genice a celulelor germinale.
Până în 1985, au elaborat un document intitulat „Regulamente privind pregătirea și depunerea cererilor pentru experimente în domeniul terapiei genice a celulelor somatice”. Acesta conținea toate informațiile despre ce date trebuie prezentate într-o cerere de permisiunea de a testa terapia genetică cu celule somatice la oameni. Baza a fost luată din regulile care guvernează teste de laborator cu ADN recombinat; au fost adaptate doar în scopuri biomedicale.
Legislația biomedicală a fost revizuită și extinsă în anii 1970. ca răspuns la publicarea în 1972 a rezultatelor unui experiment de 40 de ani efectuat de Serviciul Național de Sănătate din Alabama pe un grup de 400 de afro-americani analfabeti cu sifilis. Experimentul a fost realizat pentru a studia dezvoltarea naturală a acestei boli cu transmitere sexuală; Vestea unei astfel de experiențe îngrozitoare asupra oamenilor neinformați i-a șocat pe mulți în Statele Unite. Congresul a oprit imediat experimentul și a adoptat o lege care interzice să mai fie efectuate vreodată astfel de cercetări.
Printre întrebările adresate persoanelor care au solicitat permisiunea de a experimenta în domeniul terapiei genice a celulelor somatice au fost următoarele:
- 1. Care este boala care se presupune a fi tratată?
- 2. Cât de grav este?
- 3. Există tratamente alternative?
- 4. Cât de periculos este tratamentul propus pentru pacienți?
- 5. Care este probabilitatea de succes a tratamentului?
- 6. Cum vor fi selectați pacienții pentru studiile clinice?
- 7. Va fi această selecție imparțială și reprezentativă?
- 8. Cum vor fi informați pacienții despre teste?
- 9. Ce fel de informații ar trebui furnizate?
- 10. Cum va fi obținut consimțământul acestora?
- 11. Cum va fi garantată confidențialitatea informațiilor despre pacienți și cercetări?
Când au început experimentele de terapie genetică, cele mai multe cereri pentru studiile clinice au fost mai întâi revizuite de Comitetul de etică al instituției în care urma să fie efectuată cercetarea înainte de a fi transmise Subcomitetului pentru terapie genetică umană. Acesta din urmă a evaluat cererile din punct de vedere al semnificației lor științifice și medicale, al respectării regulilor actuale și al caracterului persuasiv al argumentelor. Dacă cererea a fost respinsă, aceasta a fost returnată cu comentariile necesare. Autorii propunerii ar putea revizui propunerea și o pot reelabora. Dacă o cerere a fost aprobată, Subcomitetul de terapie genetică a discutat-o în discuții publice folosind aceleași criterii. După aprobarea cererii la acest nivel, directorul Subcomisiei a aprobat-o și a semnat autorizația pentru studii clinice, fără de care acestea nu puteau începe. În acest ultim caz, s-a acordat o atenție deosebită metodei de obținere a produsului, metodelor de control calitativ al purității acestuia și ce teste preclinice au fost efectuate pentru a asigura siguranța produsului.
Dar, pe măsură ce numărul de cereri a crescut în timp, iar terapia genică a devenit, în cuvintele unui comentator, „biletul câștigător în medicină”, procesul inițial de aprobare a cererii a fost considerat inutil de consumator de timp și redundant. În consecință, după 1997, Subcomitetul de terapie genetică nu a mai fost una dintre agențiile care supravegheau cercetarea terapiei genetice umane. Dacă subcomitetul există, cel mai probabil va oferi forumuri pentru a discuta probleme etice legate de terapia genetică umană. Între timp, cerința ca toate aplicațiile de terapie genetică să fie discutate public a fost ridicată. Agenția responsabilă cu monitorizarea producției și utilizării produselor biologice efectuează toate evaluările necesare în mod confidențial pentru a se asigura că drepturile de proprietate ale dezvoltatorilor sunt respectate. Terapia genetică umană este considerată în prezent sigură procedura medicala, deși nu este deosebit de eficient. Preocupările exprimate anterior s-au disipat și a devenit una dintre principalele abordări noi pentru tratamentul bolilor umane.
Majoritatea experților consideră că procesul de aprobare pentru studiile de terapie genetică cu celule somatice umane din Statele Unite este destul de adecvat; garantează selecția imparțială a pacienților și conștientizarea acestora, precum și implementarea corectă a tuturor manipulărilor, fără a provoca prejudicii atât anumitor pacienți, cât și populației umane în ansamblu. Alte țări dezvoltă în prezent reglementări pentru studiile de terapie genetică. În SUA, acest lucru a fost realizat prin cântărirea atentă a fiecărei propuneri. Așa cum dr. Walters, unul dintre participanții la audierile subcomitetului pentru terapie genetică din ianuarie 1989, a spus: „Nu cunosc nicio altă știință sau tehnologie biomedicală care să fi fost supusă unui control atât de amplu precum terapia genică”.
Acumularea de gene defecte în generațiile viitoare.
Există o opinie că tratamentul bolilor genetice folosind terapia genică a celulelor somatice va duce inevitabil la o deteriorare a fondului genetic al populației umane. Se bazează pe ideea că frecvența unei gene defectuoase într-o populație va crește de la o generație la alta, deoarece terapia genică va promova transmiterea genelor mutante la generația următoare de la acele persoane care anterior nu erau în măsură să producă descendenți sau nu puteau. supraviețuiesc până la vârsta adultă. Cu toate acestea, această ipoteză s-a dovedit a fi incorectă. Conform geneticii populației, pentru o creștere semnificativă a frecvenței unei gene dăunătoare sau letale ca urmare tratament eficient durează mii de ani. Astfel, dacă o boală genetică rară apare la 1 din 100.000 de născuți vii, va dura aproximativ 2.000 de ani de la introducerea terapiei genetice eficace înainte ca incidența bolii să se dubleze la 1 din 50.000.
În plus față de faptul că frecvența genei letale aproape că nu crește de la o generație la alta, ca rezultat tratament pe termen lung oricine are nevoie de el, genotipul indivizilor indivizi rămâne, de asemenea, neschimbat. Acest punct poate fi ilustrat cu un exemplu din istoria evoluției. Primatele, inclusiv oamenii, nu sunt capabile să sintetizeze vitale vitamina importanta C, trebuie să-l obțină din surse externe. Astfel, putem spune că suntem cu toții deficienți genetic în gena pentru această substanță vitală. În schimb, amfibienii, reptilele, păsările și mamiferele non-primate sintetizează vitamina C. Cu toate acestea, defectul genetic care provoacă incapacitatea de a biosintetiza vitamina C nu a „prevenit” evoluția cu succes a primatelor timp de mai mult de milioane de ani. De asemenea, corectarea altor defecte genetice nu va duce la o acumulare semnificativă de gene „nesănătoase” în generațiile viitoare.
Terapia genică a celulelor germinale.
Experimentele în domeniul terapiei genice a celulelor germinale umane sunt acum strict interzise, dar trebuie recunoscut că unele boli genetice pot fi vindecate doar în acest fel. Metodologia pentru terapia genică a celulelor germinale umane nu a fost încă suficient dezvoltată. Cu toate acestea, nu există nicio îndoială că odată cu dezvoltarea metodelor de manipulare genetică la animale și testarea diagnostica embrionii de preimplantare vor umple acest gol. Mai mult, pe măsură ce terapia genetică cu celule somatice devine mai rutină, aceasta va afecta atitudinea oamenilor față de terapia genetică a liniei germinale umane și, în timp, va fi nevoie să o testăm. Se poate doar spera că până în acel moment toate problemele asociate cu consecințele utilizării practice a terapiei genice pentru celulele germinale umane, inclusiv cele sociale și biologice, vor fi rezolvate.
Se crede că terapia genetică umană ajută la tratare boli grave. Într-adevăr, poate oferi o corecție pentru o serie de tulburări fizice și mentale, deși rămâne neclar dacă societatea va considera acceptabilă o astfel de utilizare a terapiei genice. Ca orice alt nou direcție medicală, terapia genică a celulelor germinale umane ridică numeroase întrebări, și anume:
- 1. Care este costul dezvoltării și implementării metodelor de terapie genetică pentru celulele germinale umane?
- 2. Ar trebui guvernul să stabilească priorități de cercetare medicală?
- 3. Dezvoltarea prioritară a terapiei genice pentru celulele germinale va duce la reducerea eforturilor de a găsi alte metode de tratament?
- 4. Va fi posibil să ajungeți la toți pacienții care au nevoie?
- 5. Va putea o persoană sau o companie să obțină drepturi exclusive pentru a trata anumite boli folosind terapia genică?
Clonarea umană.
Interesul public pentru posibilitatea clonării umane a apărut în anii 1960, după ce au fost efectuate experimente corespunzătoare pe broaște și broaște râioase. Aceste studii au arătat că nucleul unui ovul fertilizat poate fi înlocuit cu nucleul unei celule nediferențiate, iar embrionul se va dezvolta normal. Astfel, în principiu, este posibil să izolați nucleele din celulele nediferențiate ale unui organism, să le introduceți în ouă fecundate ale aceluiași organism și să produceți descendenți cu același genotip ca și părintele. Cu alte cuvinte, fiecare dintre organismele descendente poate fi considerată o clonă genetică a organismului donator original. În anii 1960 se părea că, în ciuda lipsei de capacități tehnice, nu a fost dificil de extrapolat la om rezultatele clonării broaștelor. În presă au apărut multe articole pe această temă și chiar s-au scris lucrări științifico-fantastice. Una dintre povești a fost despre clonarea președintelui SUA, asasinat cu perfide, John F. Kennedy, dar un subiect mai popular a fost clonarea răufăcătorilor. Lucrările despre clonarea umană nu au fost doar neplauzibile, ci au promovat și ideea eronată și foarte periculoasă că trăsăturile de personalitate ale unei persoane, caracterul și alte calități sunt determinate exclusiv de genotipul său. De fapt, o persoană ca personalitate se formează sub influența atât a genelor sale, cât și a condițiilor de mediu, în special a tradițiilor culturale. De exemplu, rasismul rău intenționat pe care l-a predicat Hitler este o calitate comportamentală dobândită care nu este determinată de nicio genă sau de combinația lor. Într-un alt mediu cu caracteristici culturale diferite, „Hitlerul clonat” nu s-ar fi transformat neapărat într-o persoană similară cu adevăratul Hitler. La fel, o „clonă a Maicii Tereza” nu ar „face” neapărat o femeie care și-a dedicat viața pentru a-i ajuta pe cei săraci și bolnavi din Calcutta.
Pe măsură ce metodele de biologie reproductivă a mamiferelor s-au dezvoltat și crearea diferitelor animale transgenice, a devenit din ce în ce mai clar că clonarea umană era o chestiune de viitor nu prea îndepărtat. Speculațiile au devenit realitate în 1997, când a fost clonată o oaie pe nume Dolly. În acest scop, s-a folosit nucleul unei celule diferențiate de la o oaie donatoare. Abordarea metodologică care a fost folosită pentru a „crea” Dolly este, în principiu, potrivită pentru obținerea de clone ale oricăror mamifere, inclusiv ale oamenilor. Și chiar dacă nu funcționează bine la alte specii de mamifere, probabil că nu va fi nevoie de prea multă experimentare pentru a dezvolta o metodă potrivită. Ca urmare, clonarea umană va deveni imediat subiectul oricărei discuții care afectează problemele etice ale geneticii și medicinei biologice.
Fără îndoială, clonarea umană este o problemă complexă și controversată. Pentru unii, însăși ideea de a crea o copie a unui individ deja existent prin manipulare experimentală pare inacceptabilă. Alții cred că un individ clonat este același cu un geamăn identic, în ciuda diferenței de vârstă și, prin urmare, clonarea nu este în mod inerent rău intenționat, deși poate nu este în întregime necesară. Clonarea poate avea efecte medicale și sociale pozitive care justifică implementarea ei în cazuri excepționale. De exemplu, poate fi vital pentru părinții unui copil bolnav. Răspunderea pentru experimentele de clonare umană este reglementată de lege în multe țări și toate cercetările legate de clonarea umană sunt interzise. Astfel de restricții sunt suficiente pentru a exclude posibilitatea clonării umane. Cu toate acestea, cu siguranță se va pune problema inevitabilității clonării umane.
Distrofia musculară Duchenne este una dintre bolile genetice rare, dar încă relativ frecvente. Boala este diagnosticată la vârsta de trei până la cinci ani, de obicei la băieți, la început manifestându-se doar în mișcări dificile până la vârsta de zece ani, o persoană care suferă de o astfel de distrofie musculară nu mai poate merge și până la vârsta de 20 de ani; 22 viața lui se termină. Este cauzată de o mutație a genei distrofinei, care se află pe cromozomul X. Codifică o proteină care se întinde pe membrană celula musculara cu fibre contractile. Din punct de vedere funcțional, este un fel de arc care asigură contracția lină și integritatea membranei celulare. Mutațiile genei duc la distrofia țesutului muscular scheletic, a diafragmei și a inimii. Tratamentul bolii este paliativ și poate alina doar puțin suferința. Cu toate acestea, odată cu dezvoltarea ingineriei genetice, există lumină la capătul tunelului.
Despre război și pace
Terapia genică este livrarea de constructe pe bază de acid nucleic în celule pentru a trata bolile genetice. Cu ajutorul unei astfel de terapii, este posibilă corectarea unei probleme genetice la nivel de ADN și ARN, modificând procesul de exprimare a proteinei dorite. De exemplu, ADN-ul cu o secvență corectată poate fi livrat într-o celulă, cu care este sintetizată o proteină funcțională. Sau, dimpotrivă, este posibilă eliminarea anumitor secvențe genetice, care vor ajuta și la reducerea efectelor nocive ale mutației. În teorie, acest lucru este simplu, dar în practică, terapia genică se bazează pe cele mai complexe tehnologii de lucru cu obiecte microscopice și reprezintă un set de know-how avansat în domeniul biologiei moleculare.
Injectarea ADN-ului în pronucleul zigotului este una dintre cele mai vechi și mai tradiționale tehnologii pentru crearea transgenelor. Injectarea se efectuează manual folosind ace ultrafine la microscop cu mărire de 400x.
„Gena distrofinei, ale cărei mutații dau naștere distrofiei musculare Duchenne, este uriașă”, spune Vadim Zhernovkov, director de dezvoltare al companiei de biotehnologie Marlin Biotech, candidat la științe biologice. „Include 2,5 milioane de perechi de nucleotide, care ar putea fi comparate cu numărul de litere din romanul Război și pace.” Și să ne imaginăm că am rupt câteva pagini importante din epopee. Dacă aceste pagini descriu evenimente semnificative, atunci înțelegerea cărții ar fi deja dificilă. Dar cu gena totul este mai complicat. Nu ar fi greu să găsești un alt exemplar din Război și pace, iar apoi paginile lipsă ar putea fi citite. Dar gena distrofinei este localizată pe cromozomul X, iar la bărbați există doar una. Astfel, o singură copie a genei este stocată în cromozomii sexuali ai băieților la naștere. Nu există de unde să găsești altul.
În cele din urmă, atunci când sintetizează proteine din ARN, este importantă menținerea cadrului de citire. Cadrul de citire determină ce grup de trei nucleotide este citit ca un codon, corespunzător unui aminoacid dintr-o proteină. Dacă un fragment de ADN care nu este un multiplu de trei nucleotide este șters într-o genă, cadrul de citire se schimbă - codificarea se schimbă. Acest lucru ar putea fi comparat cu situația în care, după paginile rupte din întreaga carte rămasă, toate literele sunt înlocuite cu următoarele din alfabet. Rezultatul va fi abracadabra. Același lucru se întâmplă cu proteinele sintetizate incorect.”
Plasture biomolecular
Unul dintre metode eficiente terapia genică pentru restabilirea sintezei normale a proteinelor - omiterea exonilor folosind secvențe scurte de nucleotide. Marlin Biotech a dezvoltat deja tehnologia de lucru cu gena distrofinei folosind această metodă. După cum se știe, în procesul de transcripție (sinteza ARN), se formează mai întâi așa-numitul ARN pre-șablon, care conține atât regiuni care codifică proteine (exoni) cât și regiuni necodante (introni). În continuare, începe procesul de splicing, în timpul căruia intronii și exonii sunt separați și se formează un ARN „matur”, format doar din exoni. În acest moment, unii exoni pot fi blocați, „sigilați” cu ajutorul unor molecule speciale. Drept urmare, ARN-ul matur nu va conține acele regiuni codificatoare de care am prefera să scăpăm și astfel cadrul de citire va fi restabilit și proteina va fi sintetizată.
„Am depanat această tehnologie in vitro”, spune Vadim Zhernovkov, adică pe culturi de celule crescute din celulele pacienților cu distrofie musculară Duchenne. Dar celulele individuale nu sunt un organism. Prin invadarea proceselor celulare, trebuie să observăm consecințele în direct, dar nu este posibilă implicarea oamenilor în testare din cauza diverse motive- de la etic la organizatoric. Prin urmare, a fost nevoie de a obține un model animal de laborator al distrofiei musculare Duchenne cu anumite mutații.”
Cum se injectează un microcosmos
Animalele transgenice sunt animale obținute în laborator în care s-au făcut modificări în mod intenționat și deliberat genomului lor. În anii 70 ai secolului trecut, a devenit clar că crearea transgenelor este cea mai importantă metodă studii ale funcțiilor genelor și proteinelor. Una dintre cele mai timpurii metode de obținere a unui organism complet modificat genetic a fost injectarea de ADN în pronucleul („precursorul nucleului”) al zigoților de ouă fertilizate. Acest lucru este logic, deoarece este cel mai ușor să modificați genomul unui animal chiar la începutul dezvoltării sale.
Diagrama prezintă procesul CRISPR/Cas9, care implică un ARN subgenomic (sgRNA), o regiune a acestuia care acționează ca ARN ghid și o proteină nuclează Cas9 care taie ambele catene de ADN genomic în locația specificată de ARN-ul ghid.
Injectarea în nucleul unui zigot este o procedură foarte nebanală, deoarece vorbim despre o microscara. Oul de șoarece are un diametru de 100 de microni, iar pronucleul este de 20 de microni. Operația are loc la microscop cu mărire de 400x, dar injecția este cea mai mare lucrate manual. Desigur, pentru „injecție”, nu se folosește o seringă tradițională, ci un ac special de sticlă cu un canal gol în interior, în care este colectat materialul genetic. Un capăt al acestuia poate fi ținut în mână, iar celălalt - ultra-subțire și ascuțit - este practic invizibil cu ochiul liber. Desigur, o astfel de structură fragilă din sticlă borosilicată nu poate fi depozitată pentru o perioadă lungă de timp, așa că laboratorul are la dispoziție un set de semifabricate care sunt extrase pe o mașină specială imediat înainte de lucru. Se folosește un sistem special de vizualizare prin contrast a celulei fără colorare - intervenția în pronucleus este în sine traumatică și este un factor de risc pentru supraviețuirea celulei. Vopseaua ar fi un alt astfel de factor. Din fericire, ouăle sunt destul de tenace, dar numărul de zigoți care dau naștere la animale transgenice este doar câteva procente din total. număr total ouă în care a fost injectat ADN.
Următoarea etapă este chirurgicală. Se efectuează o operație de transplant de zigoți microinjectați în oviductul șoarecelui primitor, care va deveni o mamă surogat pentru viitoarele transgene. În continuare, animalul de laborator trece în mod natural printr-un ciclu de sarcină și se nasc puii. De obicei, un așternut conține aproximativ 20% șoareci transgenici, ceea ce indică și imperfecțiunea metodei, deoarece există un element mare de aleatorie în ea. Când este injectat, cercetătorul nu poate controla exact modul în care fragmentele de ADN introduse vor fi integrate în genomul viitorului organism. Există o mare probabilitate ca astfel de combinații să ducă la moartea animalului în stadiul embrionar. Cu toate acestea, metoda funcționează și este destul de potrivită pentru o serie de scopuri științifice.
Dezvoltarea tehnologiilor transgenice face posibilă producerea de proteine animale care sunt solicitate de industria farmaceutică. Aceste proteine sunt extrase din laptele de capre și vaci transgenice. Există și tehnologii pentru obținerea proteinelor specifice din ouăle de găină.
foarfece ADN
Dar există o modalitate mai eficientă bazată pe editarea țintită a genomului folosind tehnologia CRISPR/Cas9. „Astăzi, biologia moleculară este oarecum asemănătoare cu epoca expedițiilor maritime pe distanțe lungi”, spune Vadim Zhernovkov. — Aproape în fiecare an au loc descoperiri semnificative în această știință care ne pot schimba viața. De exemplu, în urmă cu câțiva ani, microbiologii au descoperit că o specie de bacterii care fusese studiată mult timp era imună la infecții virale. Ca urmare cercetări ulterioare S-a dovedit că ADN-ul bacterian conține loci speciali (CRISPR), din care sunt sintetizate fragmente de ARN care se pot lega complementar de acizii nucleici ai elementelor străine, de exemplu, virusurile ADN sau ARN. Proteina Cas9, care este o enzimă nuclează, se leagă de un astfel de ARN. ARN-ul servește drept ghid pentru Cas9, marcând o secțiune specifică a ADN-ului în care nucleaza face o tăietură. În urmă cu aproximativ trei până la cinci ani, au apărut primele lucrări științifice în care tehnologia CRISPR/Cas9 a fost dezvoltată pentru editarea genomului.”
Șoarecii transgenici permit crearea de modele vii ale bolilor genetice umane severe. Oamenii ar trebui să fie recunoscători acestor creaturi minuscule.
În comparație cu metoda de introducere a unui construct pentru inserarea aleatorie, noua metodă vă permite să selectați elemente ale sistemului CRISPR/Cas9 în așa fel încât să vizați cu precizie ghidurile ARN către regiunile dorite ale genomului și să obțineți ștergerea sau inserarea țintită a secvența ADN dorită. Această metodă este, de asemenea, supusă erorilor (ARN-ul ghid se leagă uneori de site-ul greșit unde este vizat), dar atunci când se utilizează CRISPR/Cas9, eficiența creării transgenelor este deja de aproximativ 80%. „Această metodă are perspective largi, nu numai pentru crearea transgenelor, ci și în alte domenii, în special în terapia genică”, spune Vadim Zhernovkov. „Cu toate acestea, tehnologia este abia la începutul călătoriei sale și este destul de dificil de imaginat că în viitorul apropiat codul genetic al oamenilor va fi corectat folosind CRISPR/Cas9. Deși există o posibilitate de eroare, există și pericolul ca o persoană să piardă o parte importantă de codificare a genomului.”
Medicamentul laptelui
Compania rusă Marlin Biotech a reușit să creeze un șoarece transgenic în care mutația care duce la distrofia musculară Duchenne este complet reprodusă, iar următoarea etapă va fi testarea tehnologiilor de terapie genetică. Cu toate acestea, crearea de modele de boli genetice umane bazate pe animale de laborator nu este singura utilizare posibilă a transgenelor. Astfel, în Rusia și laboratoarele occidentale, se lucrează în domeniul biotehnologiei, făcând posibilă obținerea de proteine medicinale de origine animală importante pentru industria farmaceutică. Vacile sau caprele pot acționa ca producători, în care aparatul celular de producere a proteinelor conținute în lapte poate fi schimbat. Este posibilă extragerea proteinelor medicinale din lapte, care nu se obține chimic, dar cu ajutorul unui mecanism natural, care va crește eficacitatea medicamentului. În prezent, au fost dezvoltate tehnologii pentru producerea de proteine medicinale precum lactoferina umană, prourokinaza, lizozima, atrina, antitrombina și altele.
