O firmie
Nie jesteś zadowolony z jakości produktów dostarczonych do laboratorium? Spróbuj z nami współpracować. Wszystkie nasze produkty są produkowane według najwyższych międzynarodowych standardów i posiadają certyfikaty rejestracyjne Ministerstwa Zdrowia Ukrainy. Zobacz to na własne oczy. Złóż zamówienie próbne.
Badania bakteriologiczne
Badania bakteriologiczne- przeznaczone do izolacji bakterii i badania ich właściwości w celu postawienia diagnozy mikrobiologicznej.
Materiał do badań należy pobrać w warunkach aseptycznych do sterylnych pojemników i jak najszybciej dostarczyć do laboratorium. Jeśli to konieczne, próbki należy przechowywać w lodówce. Technika pobierania próbek zależy od obiektu, charakteru choroby i właściwości mikroorganizmu. Jedną z powszechnych metod badań bakteriologicznych jest bakterioskopia.
Do badania nieutrwalonych bakterii stosuje się dwie metody: zmiażdżoną kroplę (między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem nakrywkowym) i kroplę wiszącą. Należy pamiętać, że preparaty nieutrwalonych bakterii są zakaźne.
Do najważniejszych elementów badań bakteriologicznych zalicza się inokulację i subhodowlę kultur bakteryjnych wykonywaną za pomocą ezy bakteryjnej lub pipety Pasteura. Pętlę sterylizuje się poprzez wyżarzanie w płomieniu, następnie schładza poprzez dotknięcie powierzchni niezaszczepionego agaru lub przepłukanie w sterylnym płynie. Używając pipety Pasteura, należy odłamać końcówkę pęsetą, kilka razy przepuścić pipetę przez płomień palnika i poczekać, aż ostygnie. Podczas siewu stosuje się płynne i stałe pożywki. Po wysianiu na skośnym agarze kulturę bakteryjną pociera się pętelką po powierzchni agaru. Podczas wysiewu na grubość kolumny agarowej lub żelatynowej pożywkę wbija się w dno probówki za pomocą pętli lub specjalnej igły. Przy wysiewie w podłożu płynnym należy uważać, aby płyn nie rozlał się i nie zamoczył brzegów tub i zatyczek. Szczepienia i podhodowle należy wykonywać w pobliżu płomienia palnika gazowego, probówki nie powinny długo pozostawać otwarte, pętla lub pipeta Pasteura z kulturą nie powinny niczego dotykać; Przed zamknięciem probówki krawędzie należy wypalić. Zaszczepione probówki należy natychmiast oznaczyć.
Metody badań mikrobiologicznych dzielą się na metody bezpośredniego wykrywania patogenów w organizmie pacjenta – badania bakterioskopowe i bakteriologiczne; metody pośredniego potwierdzenia obecności patogenu w organizmie pacjenta – badania serologiczne mające na celu wykrycie określonych antygenów w zakażonym materiale lub przeciwciał w surowicy krwi i różnych wydzielinach organizmu pacjenta.
Badanie bakterioskopowe krwi, moczu, płynu mózgowo-rdzeniowego, śluzu z gardła i nosa, kału i różnych substratów patologicznych na obecność patogenu stosuje się w przypadku wielu chorób zakaźnych. Metoda ta ma dość ograniczone zastosowanie, chociaż jest bardzo ważna. Stosowany jest w szczególności do wykrywania we krwi patogenów malarii, gorączki nawracającej i leptospirozy. Płyn mózgowo-rdzeniowy bada się pod kątem ropnego i gruźliczego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych, śluzu z gardła i nosa - na błonicę, dławicę Vincenta, kał - na amebozę, balantidiozę, lambliozę; mocz - na leptospirozę. W punktowych pęcherzykach dżumy i odciskach pobranych z karbunkułu wąglika można dostrzec prątki dżumy i wąglika; mikroskopia punktowego rozmazu ze szpiku kostnego i śledziony, granulki z wrzodu mogą wykryć leiszmanię; w plwocinie - Mycobacterium tuberculosis. Zaletą metody bakterioskopowej jest jej szybkość. Wyniki analizy można uzyskać w ciągu kilku godzin. W przypadku niektórych chorób (malaria, epidemiczne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych itp.) Patogeny można wykryć w organizmie pacjenta już w pierwszym dniu choroby, co jest bardzo ważne dla terminowej diagnozy i leczenia. Możliwości diagnostyki bakterioskopowej znacznie się rozszerzyły dzięki traktowaniu preparatów specyficznymi surowicami zawierającymi przeciwciała przeciwko danemu patogenowi, znakowane fluorochromami (metoda immunofluorescencyjna) lub enzymami (metoda immunoenzymatyczna). W tym przypadku znakowane przeciwciała łączy się z antygenem, który wykrywa się metodą immunofluorescencyjną pod mikroskopem fluorescencyjnym oraz metodą immunoenzymatyczną – poprzez barwienie produktu reakcji enzymatycznej po wprowadzeniu mieszaniny substrat-wskaźnik.
Bakteriologiczna metoda diagnostyki polega na izolacji patogenu z krwi, płynu mózgowo-rdzeniowego, plwociny, śluzu gardła i nosa, kału, moczu, żółci pacjenta, a w przypadku śmierci – z zaszczepionych fragmentów narządów na specjalnych pożywkach. Diagnostyka bakteriologiczna jest szeroko stosowana do badania śluzu z gardła i nosa pod kątem bakterii błonicy, do izolowania patogenów infekcji jelitowych (na przykład cholery, czerwonki, salmonellozy, escherichiozy) z kału pacjenta, patogenów zapalenia płuc z plwociny i w innych przypadkach . W tym przypadku bierze się pod uwagę charakterystykę podejrzanej infekcji, miejsce selektywnej lokalizacji patogenu i drogi jego uwalniania do środowiska. Badanie daje pozytywne rezultaty już w pierwszych godzinach lub dniach choroby. Jednak laboratorium podaje ostateczną odpowiedź w przypadku większości chorób zakaźnych dopiero po 2-4 dniach, a w przypadku brucelozy i gruźlicy - po 3-4 tygodniach. Zależy to od czasu wymaganego do wzrostu mikroorganizmów i ich identyfikacji (biochemicznej i serologicznej). Każdy drobnoustrój potrzebuje do swojego wzrostu odpowiedniej pożywki. W zależności od tego, jaki drobnoustrój ma zostać wyizolowany (co ustala się podczas badania kliniczno-epidemiologicznego pacjenta), dobiera się odpowiednią pożywkę. Czasami siew odbywa się jednocześnie na kilku pożywkach. O wartości wyników badań bakteriologicznych w dużej mierze decyduje to, czy materiał zostanie prawidłowo pobrany od pacjenta i czy prawidłowo dostarczony do laboratorium. Materiał zakaźny pobiera się do sterylnych pojemników, zachowując zasady aseptyki.
Najważniejszym etapem badań bakteriologicznych jest identyfikacja- określenie gatunku lub rodzaju bakterii uzyskanych w postaci czystej kultury. Podczas identyfikacji bakterii bada się ich właściwości fizjologiczne i biochemiczne oraz powstawanie toksyn. Powszechnie stosowane są serologiczne metody identyfikacji bakterii. W wielu przypadkach skuteczna jest biologiczna metoda identyfikacji drobnoustrojów, polegająca na zakażaniu zwierząt laboratoryjnych badanym materiałem lub powstałą hodowlą bakteryjną i identyfikacji charakterystycznych zmian patologicznych u zwierząt.
Do izolacji czystych kultur stosuje się metody mechaniczne i biologiczne. Przykład metody mechanicznej: kroplę badanego materiału rozciera się tą samą sterylną szpatułką lub pętlą bakteryjną na powierzchni gęstej pożywki, kolejno na pierwszej, drugiej i trzeciej szalce Petriego. Izolacja czystej kultury przeprowadzana jest z wyhodowanych pojedynczych kolonii i polega na ich badaniu i przesiewaniu na świeżej pożywce. Biologiczne metody izolacji czystych kultur opierają się na uwzględnieniu tej lub innej właściwości izolowanego drobnoustroju, która odróżnia go od innych drobnoustrojów występujących w badanym materiale.
Metoda biologiczna wykorzystuje tego rodzaju pożywki, w których powstają warunki sprzyjające rozwojowi określonego rodzaju drobnoustroju. Do metod biologicznych zalicza się także infekcję zwierząt laboratoryjnych wrażliwych na izolowane gatunki bakterii.
Badania bakteriologiczne to zespół metod pozwalających na identyfikację drobnoustrojów chorobotwórczych u pacjenta, nosiciela lub na obiektach środowiska.
Izolacja czystej kultury;
Coraz częściej wprowadza się do praktyki metody badań bakteriologicznych w celu bardziej szczegółowego badania pacjentów, ustalenia czynnika etiologicznego procesu zapalnego, przepisania racjonalnej terapii i określenia jej skuteczności.
Różnorodność materiału klinicznego i specyfika mikroflory poszczególnych narządów determinują cechy metod badań bakteriologicznych, które wymagają stosowania specjalnych technik pobierania próbek, inokulacji na pożywkach i analiz.
Badanie bakteriologiczne materiału klinicznego składa się z kilku etapów:
Pobieranie próbek do celów badawczych;
Siew na pożywkach;
Izolacja czystej kultury;
Identyfikacja i różnicowanie izolowanych kultur drobnoustrojów;
Analiza wyników badań.
Podczas badania bakteriologicznego przeprowadza się tzw. Wysiew materiału pobranego od pacjenta na pożywkę, co sprzyja wzrostowi i reprodukcji czynnika chorobotwórczego. W trakcie badania możliwe jest stwierdzenie nie tylko faktu obecności, ale także stężenia mikroorganizmów chorobotwórczych w konkretnym biomateriale.
Metodą badania bakteriologicznego bada się plwocinę, płyn mózgowo-rdzeniowy, krew, a także wydzielinę z narządów płciowych, jamy ustnej, gardła i ran pacjenta. W ten sposób mikroorganizmy można wysiewać z niemal każdej części ludzkiego ciała.
Technika posiewów bakteriologicznych jest niezwykle wygodna i skuteczna w wykrywaniu i określaniu rodzaju bakterii i grzybów. Wykrywanie wirusów stwarza pewną trudność ze względu na specyfikę ich biologii.
Badanie bakteriologiczne (posiew) ma ogromne znaczenie nie tylko dla określenia konkretnego rodzaju drobnoustroju, ale także dla ustalenia stopnia wrażliwości konkretnego antybiotyku na niego. W ten sposób określa się maksymalną skuteczność danego rodzaju antybiotykoterapii.
Podczas przeprowadzania analizy należy pamiętać, że niektóre mikroorganizmy, np. pneumokoki, umierają dość szybko, ponieważ mają zwiększoną skłonność do samozniszczenia. Dlatego uprawy muszą zostać wykonane w krótkim czasie.
Główną metodą diagnostyki mikrobiologicznej i „złotym standardem” mikrobiologii jest metoda bakteriologiczna.
Cel metody bakteriologicznej polega na wyizolowaniu czystej kultury patogenu z materiału badawczego, zgromadzeniu czystej kultury i identyfikacji tej kultury po zespole właściwości: morfologicznych, nalewkowych, kulturowych, biochemicznych, antygenowych, po obecności czynników patogeniczności, toksyczności i określeniu jej wrażliwości na leki przeciwdrobnoustrojowe i bakteriofagi.
Metoda badań bakteriologicznych obejmuje:
1. inokulacja materiału badawczego w pożywce
2. izolacja czystej kultury
3. identyfikacja mikroorganizmów (określanie gatunku).
Izolacja i identyfikacja czystych kultur bakterii tlenowych i beztlenowych obejmuje następujące badania:
Etap I (praca z materiałem rodzimym)
Cel: zdobycie izolowanych kolonii
1. Wstępna mikroskopia daje przybliżone pojęcie o mikroflorze
2. Przygotowanie materiału do badań
3. Wysiew na stałe pożywki w celu uzyskania izolowanych rodzin
4. Inkubacja w optymalnej temperaturze, najczęściej 37°C, przez 18-24 godziny
Etap II
Cel: uzyskanie czystej kultury
1. Badanie makroskopowe kolonii w świetle przechodzącym i odbitym (charakterystyka wielkości, kształtu, koloru, przezroczystości, konsystencji, struktury, konturu, powierzchni kolonii).
2. Badanie mikroskopowe izolowanych kolonii
3. Badanie aerotolerancji (w celu potwierdzenia obecności ścisłych beztlenowców w badanym materiale).
4. Wysiew kolonii charakterystycznych dla danego gatunku na podłoża akumulacyjne czystej kultury lub podłoża selektywne i inkubacja w optymalnych warunkach.
Etap III
Cel: identyfikacja izolowanej czystej kultury
1. Aby zidentyfikować wybraną kulturę na podstawie zestawu właściwości biologicznych, bada się:
· Morfologia i właściwości barwiące
· właściwości kulturowe (charakter wzrostu na pożywkach)
· właściwości biochemiczne (aktywność enzymatyczna mikroorganizmów)
Właściwości serologiczne (antygenowe)
· właściwości zjadliwe (zdolność do wytwarzania czynników chorobotwórczych: toksyn, enzymów, czynników obronnych i agresywnych)
patogeniczność dla zwierząt
· fagolizowalność (wrażliwość na bakteriofagi diagnostyczne)
wrażliwość na antybiotyki
· inne indywidualne właściwości
Etap IV (Zakończenie)
Na podstawie zbadanych właściwości wyciąga się wniosek na temat wybranej kultury.
Pierwszy etap badań. Badanie materiału patologicznego rozpoczyna się od mikroskopii. Mikroskopia wybarwionego materiału rodzimego pozwala w przybliżeniu ustalić skład krajobrazu mikrobiologicznego badanego obiektu oraz niektóre cechy morfologiczne mikroorganizmów. Wyniki mikroskopii materiału natywnego w dużej mierze determinują przebieg dalszych badań i są następnie porównywane z danymi uzyskanymi w wyniku zaszczepienia na pożywkach.
Jeżeli w próbce znajduje się wystarczająca zawartość mikroorganizmów chorobotwórczych, inokulację przeprowadza się na pożywce stałej (w celu uzyskania izolowanych kolonii). Jeżeli w materiale testowym znajduje się niewiele bakterii, inokulację przeprowadza się na płynnej pożywce wzbogacającej. Pożywki dobierane są w zależności od potrzeb mikroorganizmów.
Hodowla mikroorganizmów jest możliwa tylko pod warunkiem stworzenia optymalnych warunków dla ich życia i przestrzegania zasad wykluczających zanieczyszczenie (przypadkowe skażenie obcymi drobnoustrojami) badanego materiału. W probówce, kolbie lub szalce Petriego można stworzyć sztuczne warunki, które zapobiegną zanieczyszczeniu hodowli innymi gatunkami. Wszystkie naczynia szklane i podłoża hodowlane muszą być sterylne i po zaszczepieniu materiału mikrobiologicznego zabezpieczone przed zanieczyszczeniem zewnętrznym, co osiąga się za pomocą korków lub metalowych nakrętek i pokrywek. Manipulacje z badanym materiałem należy przeprowadzać w strefie płomienia lampy alkoholowej, aby zapobiec zanieczyszczeniu materiału ze środowiska zewnętrznego, a także w celu zachowania zgodności z przepisami bezpieczeństwa.
Zaszczepianie materiału na pożywki należy wykonać nie później niż 2 godziny od momentu pobrania.
Drugi etap badań. Badanie kolonii i izolacja czystych kultur. Po dniu inkubacji na płytkach wyrastają kolonie, przy czym przy pierwszym pociągnięciu wzrost jest ciągły, a przy kolejnych - pojedyncze kolonie. Kolonia to zbiór drobnoustrojów tego samego gatunku wyrastających z jednej komórki. Ponieważ materiał jest najczęściej mieszaniną drobnoustrojów, rośnie kilka rodzajów kolonii. Różne kolonie zaznacza się ołówkiem, obrysowując je kółkiem od dołu i bada (Tabela 11). Przede wszystkim kolonie bada się gołym okiem: znaki makroskopowe. Kubek ogląda się (bez otwierania) od dołu w świetle przechodzącym, stwierdza się przezroczystość kolonii (przezroczystą, jeśli nie blokuje światła; półprzezroczystą, jeśli częściowo blokuje światło; nieprzezroczystą, jeśli światło nie przechodzi przez kolonii) i mierzy się wielkość kolonii (w mm). Następnie oglądają kolonie od strony wieczka, zwracają uwagę na ich kształt (regularny okrągły, nieregularny, płaski, wypukły), charakter powierzchni (gładka, błyszcząca, matowa, szorstka, pomarszczona, mokra, sucha, śluzowata), kolor (bezbarwny, kolorowy).
Tabela 11. Schemat badania kolonii
| № | Podpisać | Możliwe cechy kolonii |
| 1. | Formularz | Płaskie, wypukłe, kopulaste, wgłębione, okrągłe, rozetowe, gwiazdowe |
| 2. | Rozmiar, mm | Duży (4-5 mm), średni (2-4 mm), mały (1-2 mm), karzeł (< 1 мм) |
| 3. | Charakter powierzchni | Gładki (kształt S), szorstki (kształt R), śluzowaty (kształt M), prążkowany, nierówny, matowy, błyszczący |
| 4. | Kolor | Bezbarwny, kolorowy |
| 5. | Przezroczystość | Przezroczysty, nieprzezroczysty, półprzezroczysty |
| 6. | Charakter krawędzi | Gładkie, postrzępione, frędzlowe, włókniste, ząbkowane |
| 7. | Struktura wewnętrzna | Jednorodne, ziarniste, niejednorodne |
| 8. | Konsystencja | Lepki, śluzowaty, kruchy |
| 9. | Emulgacja w kropli wody | Dobry zły |
Uwaga: punkty 5-7 są badane przy małym powiększeniu mikroskopu.
Jeszcze lepiej widać różnice pomiędzy koloniami, oglądając je w powiększeniu. W tym celu należy ustawić zamkniętą miskę dnem do góry na stoliku, nieco obniżyć kondensor, zastosować niewielkie powiększenie soczewki (x8), przesuwając miskę, zbadać cechy mikroskopowe kolonii: charakter krawędzi ( gładka, falista, postrzępiona, ząbkowana), struktura (jednorodna, ziarnista, włóknista, jednorodna lub różna w środku i na obrzeżach).
Następnie badana jest morfologia komórek drobnoustrojów z kolonii. W tym celu z części każdej zaznaczonej kolonii wykonuje się rozmazy i barwi je metodą Grama. Przy pobieraniu rodzin należy zwrócić uwagę na ich konsystencję (sucha, jeśli kolonia kruszy się i trudno ją podnieść; miękka, jeśli można ją łatwo wyjąć za pomocą pętelki; śluzowata, jeśli kolonia jest ciągnięta za pętelkę; twarda, jeśli jest częścią kolonia nie jest pobierana za pomocą pętli, można jedynie usunąć całą kolonię).
Oglądając rozmazy, ustalono, że kolonia jest reprezentowana przez jeden rodzaj drobnoustroju, dlatego można wyizolować czyste kultury bakterii. W tym celu badane kolonie ponownie wysiewa się na skośny agar. Podczas ponownego wysiewania z rodzin należy zachować ostrożność, aby pobrać dokładnie te kolonie, które są przeznaczone, bez dotykania pętlą pobliskich kolonii. Probówki są oznakowane i inkubowane w termostacie w temperaturze 37°C przez 24 godziny.
Trzeci etap badań. Identyfikacja izolowanej kultury. Identyfikacja drobnoustrojów - określenie pozycji systematycznej kultury wyizolowanej z materiału na gatunek i odmianę. Pierwszym warunkiem wiarygodnej identyfikacji jest bezwarunkowa czystość kultury. Do identyfikacji drobnoustrojów wykorzystuje się zestaw cech: morfologicznych (kształt, wielkość, obecność wici, torebek, zarodników, względne położenie w rozmazie), barwiących (w odniesieniu do barwienia Grama lub innymi metodami), chemicznych (stosunek guanina + cytozyna W cząsteczka DNA), kulturowa (potrzeby żywieniowe, warunki uprawy, tempo i charakter wzrostu na różnych pożywkach), enzymatyczna (rozszczepienie różnych substancji z utworzeniem produktów pośrednich i końcowych), serologiczna (struktura antygenowa, specyficzność), biologiczna (zjadliwość dla zwierząt, toksyczność, alergenność, wpływ antybiotyków itp.).
W celu zróżnicowania biochemicznego zdolność bakterii do fermentacji węglowodanów z tworzeniem związków pośrednich i produkty końcowe, zdolność do degradacji białek i peptonów oraz badanie enzymów redoks.
W celu zbadania enzymów sacharylitycznych wyizolowane kultury zaszczepia się do probówek z półpłynnym podłożem zawierającym laktozę, glukozę i inne węglowodany oraz alkohole wielowodorotlenowe. W przypadku pożywek półpłynnych inokulację przeprowadza się poprzez wstrzyknięcie w głębokość pożywki. Podczas siewu metodą wtrysku probówkę z pożywką trzyma się pod kątem, korek usuwa się, a krawędź probówki wypala. Materiał pobiera się sterylną pętlą i przebija się nim kolumnę pożywki niemal do samego dna.
W celu oznaczenia enzymów proteolitycznych wyizolowaną hodowlę zaszczepia się wodą peptonową lub MPB. W tym celu należy wziąć do ręki probówkę z zaszczepieniem bliżej siebie, a probówkę z pożywką dalej od siebie. Obie probówki otwiera się jednocześnie, chwytając za korki małym palcem i krawędzią dłoni, przypalając krawędzie probówek, pobiera się trochę kultury za pomocą kalcynowanej, schłodzonej ezy i przenosi do drugiej probówki, rozetrzeć go w płynnym podłożu na ściankach probówki i zmyć pożywką.
Podczas siewu i dosiewu należy zwrócić uwagę na przestrzeganie zasad sterylności, aby nie skazić swoich upraw obcą mikroflorą, a także nie zanieczyszczać środowiska. Probówki etykietuje się i umieszcza w termostacie w celu inkubacji w temperaturze 37°C na 24 godziny.
Wniosek
Rozliczanie wyników. Podsumowanie badania. Wyniki identyfikacji są brane pod uwagę i na podstawie całości uzyskanych danych, w oparciu o klasyfikację i charakterystykę typowych szczepów opisanych w podręczniku (klucz Burgee'ego, 1994-1996), określa się rodzaj izolowanych upraw.
Do badania próbek na obecność określonych bakterii stosuje się różne metody diagnostyczne, w tym metodę bakterioskopową. Cechy tej metody, a także metoda badań bakteriologicznych zostaną omówione w tym artykule.
Istota bakterioskopowej metody diagnostycznej
Bakterioskopowa metoda badania próbki ma na celu identyfikację mikroorganizmów w badanej substancji, a także szczegółowe badanie właściwości tych mikroorganizmów, wyjaśnienie ich ilości i zachowania w rozpatrywanym środowisku. Zaletami tej metody badania analiz jest prostota, szybkość i dostępność. Można je przeprowadzić w niemal każdym laboratorium przy użyciu minimalnej liczby instrumentów i odczynników chemicznych. Do jego wad należy niemożność uzyskania pełnego obrazu zachowania drobnoustrojów.
Materiały potrzebne do badań
Do badania analiz metodą bakterioskopową wymagane są następujące narzędzia:
- Metalowa pętla.
- Slajd. Przedmiot ten musi być czysty, ponieważ wszelkie zanieczyszczenia mogą mieć wpływ na stan próbki.
- Pinceta.
- Papier filtracyjny.
Nowe szkiełka czyści się 1% roztworem sody. Po ugotowaniu w takim roztworze szkło przemywa się wodą destylowaną, słabym roztworem kwasu solnego, a następnie ponownie wodą destylowaną. Zużyte szkło czyści się w kilku etapach: najpierw umieszcza się je w roztworze kwasu siarkowego na 60-120 minut, następnie gotuje w roztworze sody, po czym szkło płucze się wodą. Następnie szkło zanurza się w alkoholu medycznym.
Szklanki do instrumentów należy przechowywać w alkoholu lub w szczelnie zamkniętych pojemnikach. Ponadto w tym drugim przypadku szkło musi być suche.
Do tego badania potrzebne będą również następujące odczynniki chemiczne:
- Alkohol;
- rozwiązanie Lugola;
- Barwniki.
Najczęściej stosowanymi barwnikami są fuksyna Ziehla, błękit metylenowy i fiolet karbolowy. Ostatnim barwnikiem jest roztwór zwykłej fuksyny w pięcioprocentowej wodzie karbolowej
Postęp badania
Można poznawać kulturę zarówno w jej oryginalnej, jak i kolorowej formie. W tym drugim przypadku martwe zostaną zarówno kolonie mikroorganizmów, jak i pojedyncze bakterie, co pozwala lepiej poznać budowę tych prostych organizmów. Z kolei badając lek w jego pierwotnej postaci, technik laboratoryjny otrzymuje więcej informacji na temat aktywności drobnoustrojów. W obu przypadkach preparat bada się pod mikroskopem.
Barwienie pożywki odbywa się dwuetapowo: w pierwszej kolejności przygotowuje się preparat do zabiegu, a dopiero potem poddaje się jego barwieniu. Przygotowanie próbki przebiega w następujący sposób:
- Próbkę przeznaczoną do badań rozprowadza się równomiernie na szkle przyrządu w kształcie koła lub owalu. Jeśli w materiale znajdują się obce zanieczyszczenia (na przykład ropa), przed dodaniem próbki testowej na szkło nanosi się 1-2 krople wody.
- Następnie powstały rozmaz należy wysuszyć.
- Po wyschnięciu rozmaz należy utrwalić płomieniem palnika.
Aby to naprawić, należy trzykrotnie przytrzymać szkiełko instrumentu nad płomieniem. Jeśli rozmaz zostanie wystarczająco mocno utrwalony, asystent laboratoryjny przeprowadzający doświadczenie odczuje pieczenie w palcach.
Na koniec tej procedury próbkę barwi się.
Metody barwienia próbek
Kolorowanie może być tak proste, jak użycie jednego barwnika. I złożony, w którym w celu dokładnego rozróżnienia komórek bakteryjnych według jednej lub drugiej z ich charakterystycznych cech, na próbkę nakłada się kolejno kilka różnych odczynników chemicznych barwiących. Przykładem złożonego barwienia są metody Grama i Ziehl-Neelsena.
Metoda Grama
Metoda Grama pozwala określić skład chemiczny błony komórkowej. Dzięki tej metodzie wprowadzono klasyfikację bakterii Gram-dodatnie (do których należą czynniki wywołujące wiele chorób) po wybarwieniu uzyskują ciemnofioletową barwę, a bakterie Gram-ujemne – charakterystyczny czerwony odcień. Metoda Grama składa się z następujących kroków:
- Najpierw lek traktuje się roztworem Lugola przez jedną minutę.
- Po obróbce Lugolem próbkę wybiela się alkoholem.
- Następnie preparat przemywa się wodą destylowaną i dodatkowo barwi fuksyną.
Metoda Ziehla-Neelsena
Metodę Ziehla-Neelsena stosuje się do oznaczania bakterii wrażliwych na kwasy, których błony komórkowe zawierają dużą ilość lipidów, na przykład czynników wywołujących gruźlicę. Praca tą metodą przebiega w pięciu etapach:
- Bibułę filtracyjną umieszcza się na szkiełku, na które następnie nakłada się niewielką ilość fuksyny Ziehl.
- Następnie szkiełko podgrzewa się do momentu pojawienia się charakterystycznej pary. Po pojawieniu się pary szkło pozostawia się do ostygnięcia. Procedurę tę powtarza się jeszcze dwa razy, po czym szkło ponownie pozostawia się do ostygnięcia.
- Następnie zmyć magentę ze szkła instrumentu wodą destylowaną, po usunięciu papieru.
- Następnie szkło umieszcza się w roztworze kwasu solnego lub siarkowego, aż próbka całkowicie straci kolor.
- Na koniec na wybielony preparat nanosi się roztwór błękitu metylenowego, szkło przemywa się wodą destylowaną i pozostawia do wyschnięcia w celu dalszego zbadania powstałego preparatu pod mikroskopem.
Metoda Lefflera
Do prostych metod barwienia należy metoda Lefflera. Dzięki niemu wszystkie bakterie zmieniają kolor na niebieski. Metoda ta przebiega w dwóch etapach:
- Na rozmaz nakłada się bibułę filtracyjną, na którą nanosi się roztwór błękitu metylenowego Loefflera. Lek pozostawia się w tym stanie przez 3-5 minut.
- Po tym czasie preparat przemywa się wodą i suszy, po czym można go obejrzeć pod mikroskopem.
Metodą bakterioskopową barwi się co najmniej dwa preparaty, jeden metodą prostą, a drugi metodą złożoną.
Metoda bakteriologiczna
Często podczas badania testów konieczne staje się określenie wrażliwości patogenu na konkretny lek. W tym przypadku próbkę bada się metodą bakteriologiczną. Metoda ta składa się z następujących kroków:
- Po pierwsze, konieczne jest oczyszczenie kultury w celu zidentyfikowania określonych typów drobnoustrojów. W tym celu próbkę należy umieścić w środowisku, w którym rozwój wykrywanych bakterii jest najbardziej prawdopodobny. Możliwe jest również mechaniczne oddzielenie biomateriału podczas wysiewu.
- Po uzyskaniu czystej kultury pobrane z niej próbki bada się metodą bakterioskopową.
Poniżej przedstawiono przykłady podłoży stosowanych do wykrywania mikroorganizmów:
- Pożywka Elschniga, składająca się z jednej trzeciej surowicy końskiej i dwóch trzecich bulionu.
- Surowica Loefflera, która służy do identyfikacji patogenów błonicy. Podłoże to składa się w trzech czwartych z surowicy końskiej lub bydlęcej i w jednej czwartej bulionu zawierającego 1% glukozy.
- Agar z krwią stosowany do identyfikacji paciorkowców i badania ich wrażliwości na leki przeciwbakteryjne. Podłoże to składa się z 5-10% surowicy krwi zwierzęcej i agaru.
Rodzaje badań bakterioskopowych
Bakterioskopia badania kału
Do badania bakterioskopowego analizy kału wymagana jest próbka pacjenta. W przypadku konieczności zbadania mikroflory jelitowej, której zaburzenia w składzie wskazują na obecność dysbakteriozy lub chorób zakaźnych układu pokarmowego, próbkę pobiera się za pomocą pętli, którą wprowadza się do odbytu na głębokość około 10 centymetrów.
Podczas badania próbki kału można wykryć następujące niebezpieczne mikroorganizmy:
- Gronkowce.
- Klebsiella, której obecność wskazuje na uszkodzenie jelita grubego.
- Pseudomonas aeruginosa, która wytwarza niezwykle niebezpieczne dla człowieka toksyny.
Obecność Pseudomonas aeruginosa w organizmie człowieka może prowadzić do zatrucia krwi i zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych – chorób, które mogą być śmiertelne.
Bakterioskopia badania moczu
Badanie moczu do badania bakterioskopowego wykonuje się w przypadku podejrzenia zapalenia układu moczowego i obecności chorób, takich jak odmiedniczkowe zapalenie nerek i zapalenie pęcherza moczowego, których czynnikiem sprawczym są odpowiednio E. coli i niektóre patogeny chorób przenoszonych drogą płciową. Do takiego badania potrzeba od 50 do 100 ml moczu, który należy przechowywać w sterylnym pojemniku. Przed przystąpieniem do testu należy się dobrze umyć, aby w moczu było mniej obcych zanieczyszczeń. Nie zaleca się oddawania moczu podczas menstruacji.
Bakterioskopowa analiza moczu jest niezbędna do wykrycia chorób układu moczowego u niemowląt. W tym przypadku mocz zbiera się przez cewnik do sterylnego pojemnika. Badanie próbki moczu należy przeprowadzić jak najszybciej, w przeciwnym razie wykrycie patogenów będzie utrudnione.
Bakterioskopia plwociny
Analizując plwocinę, bada się dwa rozmazy. Jeden z nich jest badany na obecność prątków Kocha, czynnika wywołującego gruźlicę. Na podstawie wyników drugiego badania wyciągnięto wnioski na temat obecności innych drobnoustrojów w plwocinie.
Aby zbadać plwocinę pod kątem gruźlicy, próbkę barwi się metodą Ziehla-Neelsena.
Aby sprawdzić obecność innych drobnoustrojów, próbkę poddaje się barwieniu metodą Grama. Stosując metodę bakterioskopową z wykorzystaniem barwienia metodą Grama, można zidentyfikować pneumokoki, czyli bakterię wywołującą zapalenie płuc. Ponadto, pracując z próbką zgodnie z tym schematem, można wykryć obecność paciorkowców w plwocinie - czynników wywołujących ból gardła, a także Staphylococcus aureus. Ten ostatni mikroorganizm stwarza szczególne zagrożenie dla zdrowia człowieka. Prowokuje procesy ropne i powstawanie ropni, w tym na narządach wewnętrznych.
Podsumujmy to
Bakterioskopowa metoda diagnostyczna jest jedną z głównych metod badawczych w mikrobiologii. Pomimo swoich wad metoda ta jest szeroko stosowana we współczesnej medycynie do diagnozowania wielu różnych chorób, z których niektóre, na przykład gruźlica, stanowią szczególne zagrożenie dla ludzi.
9971 0
Zastosowanie metody bakteriologicznej umożliwia izolację patogenu w czystej hodowli z materiału pobranego od pacjenta i identyfikację go na podstawie badania zespołu właściwości. Większość bakterii ma zdolność namnażania się na różnych sztucznych pożywkach (z wyjątkiem chlamydii i riketsii), dlatego metoda bakteriologiczna ma znaczenie w diagnostyce wielu chorób zakaźnych.
W przypadku uzyskania wyniku pozytywnego metoda bakteriologiczna pozwala określić wrażliwość wyizolowanego patogenu na leki przeciwdrobnoustrojowe. Jednak skuteczność tego badania zależy od wielu parametrów, w szczególności od warunki gromadzenia materiału i go transport do laboratorium.
DO podstawowe wymagania wymagania dotyczące doboru i transportu materiału do badań bakteriologicznych obejmują:
- pobranie materiału przed rozpoczęciem leczenia etiotropowego;
- przestrzeganie sterylnych warunków podczas pobierania materiału;
- poprawność techniczna gromadzenia materiału;
- wystarczająca ilość materiału;
- zapewnienie warunków temperaturowych przechowywania i transportu materiału;
- minimalizacja odstępu czasu pomiędzy zbiorem materiału a siewem na pożywkach stałych.
Transport materiału do laboratorium powinien nastąpić możliwie jak najszybciej, nie później jednak niż w ciągu 1-2 godzin od jego pobrania. Próbki materiałów należy przechowywać w określonej temperaturze; w szczególności materiały normalnie sterylne (krew, płyn mózgowo-rdzeniowy) są przechowywane i dostarczane do laboratorium w temperaturze 37 °C. Materiały niesterylne (mocz, wydzielina z dróg oddechowych itp.) przechowuje się w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 1-2 godziny lub nie dłużej niż jeden dzień w temperaturze 4°C (warunki w domowej lodówce). Jeżeli dostarczenie próbek do laboratorium w ustalonym terminie nie jest możliwe, zaleca się zastosowanie nośników transportowych zaprojektowanych tak, aby zachować żywotność patogenów w warunkach konserwacji.
Krew do badań należy pobrać od pacjenta w okresie podwyższonej temperatury ciała, na początku wystąpienia gorączki. Zaleca się badanie 3-4 próbek krwi pobieranych w odstępach 4-6 godzin, co jest uzasadnione z punktu widzenia zmniejszenia ryzyka „pominięcia” przejściowej bakteriemii i zwiększenia możliwości potwierdzenia etiologicznej roli wyizolowanej mikroflory oportunistycznej z krwi, jeżeli mikroflora ta zostanie wykryta w kilku próbkach krwi żylnej. Próbkę krwi w ilości 10 ml dla osoby dorosłej i 5 ml dla dziecka posiewa się do co najmniej dwóch butelek z pożywką dla drobnoustrojów tlenowych i beztlenowych w stosunku 1:10. Zalecane jest pojedyncze badanie krwi tętniczej.
Brać płyn mózgowo-rdzeniowy(CSF) pobierany jest przez lekarza podczas nakłucia lędźwiowego w ilości 1-2 ml do suchej, sterylnej rurki. Próbka natychmiast trafia do laboratorium, gdzie również od razu rozpoczyna się jej badanie. Jeżeli nie jest to możliwe, materiał przechowuje się w temperaturze 37°C przez kilka godzin. Znacząco zwiększa liczbę pozytywnych wyników badań bakteriologicznych poprzez zaszczepienie 1-2 kropli płynu mózgowo-rdzeniowego do probówki zawierającej podłoże półpłynne z glukozą i na szalkę Petriego z agarem „krwią”. Do wysyłki materiału należy używać pudeł izotermicznych, poduszek grzewczych, termosów lub innych opakowań, w których utrzymywana jest temperatura około 37°C.
Odchody do badań bakteriologicznych pobiera się 3-5 g sterylną drewnianą szpatułką do sterylnego naczynia z szczelnie przylegającą pokrywką. Badanie pobranego materiału należy rozpocząć nie później niż po 2 godzinach.Jeżeli nie ma możliwości rozpoczęcia badania w tym czasie, należy pobrać niewielką ilość materiału i umieścić go w odpowiednim nośniku transportowym. Podczas pobierania kału należy starać się przesłać do badania patologiczne zanieczyszczenia (śluz, ropa, cząsteczki nabłonka itp.), unikając wprowadzenia do materiału zanieczyszczeń krwi, które mają działanie bakteriobójcze.
Do pobrania materiału można użyć wymazów z odbytu (z bawełnianą końcówką). Wymazówkę należy zwilżyć sterylnym izotonicznym roztworem chlorku sodu lub podłożem transportowym (ale nie olejowym żelem). Wprowadza się go przez odbytnicę na głębokość 5-6 cm i obracając tampon, ostrożnie go wyjmujemy, monitorując pojawienie się koloru odchodów na tamponie. Wymaz umieszcza się w suchej probówce, jeśli badanie materiału rozpocznie się w ciągu 2 godzin, w przeciwnym razie - w podłożu transportowym.
sikam(średnia porcja swobodnie uwolnionego moczu) w ilości 3-5 ml pobierana jest do sterylnego pojemnika po dokładnej toalecie zewnętrznych narządów płciowych. Lepiej jest zbierać mocz rano.
Żółć pobierane podczas intubacji dwunastnicy w gabinecie zabiegowym oddzielnie w porcjach A, B i C do trzech sterylnych probówek, z zachowaniem zasad aseptyki.
Woda do płukania żołądka zebrane w sterylnych słoikach w ilościach 20-50 ml. Należy pamiętać, że w takich przypadkach płukanie żołądka przeprowadza się wyłącznie za pomocą obojętnych (nie mających działania bakteriostatycznego ani bakteriobójczego na mikroorganizmy) roztworów - najlepiej przegotowanej wody (bez dodatku sody, nadmanganianu potasu itp.).
Plwocina. Poranna plwocina uwolniona podczas ataku kaszlu zbiera się w sterylnym słoiku. Przed kaszlem pacjent myje zęby i płucze usta przegotowaną wodą w celu mechanicznego usunięcia resztek jedzenia, złuszczonego nabłonka i mikroflory jamy ustnej.
Woda z płukania oskrzeli. Podczas bronchoskopii wstrzykuje się nie więcej niż 5 ml izotonicznego roztworu chlorku sodu, a następnie zasysa do jałowej rurki.
Wydzielina z gardła, jamy ustnej i nosa. Materiał z jamy ustnej pobiera się na czczo lub 2 godziny po posiłku sterylnym wacikiem lub łyżką z błony śluzowej i jej dotkniętych obszarów przy wejściach do przewodów ślinianek, powierzchni języka i od wrzodów. Jeśli pozostał film, usuń go sterylną pęsetą. Materiał z jamy nosowej pobiera się suchym, sterylnym wacikiem, który wprowadza się głęboko do jamy nosowej. Materiał z nosogardzieli pobiera się jałowym wacikiem z tylnej części gardła, który ostrożnie wprowadza się przez otwór nosowy do nosogardzieli. Jeśli zacznie się kaszel, tamponu nie należy usuwać, dopóki kaszel nie ustąpi. Aby zbadać błonicę, bada się jednocześnie błonę i śluz z nosa i gardła, pobierając materiał różnymi wymazami.
Materiał testowy inokuluje się na stałe pożywki przy użyciu specjalnych technik, aby uzyskać wzrost pojedynczych kolonii mikroorganizmów, które następnie poddaje się przesiewowi w celu wyizolowania czystej kultury patogenu.
Określone rodzaje bakterii izoluje się przy użyciu pożywek selektywnych, które hamują rozwój obcych mikroorganizmów lub zawierają substancje stymulujące wzrost niektórych drobnoustrojów chorobotwórczych.
Mikroorganizmy izolowane na pożywkach zidentyfikować, tj. określić ich gatunek lub typ. Ostatnio do identyfikacji w praktyce lekarskiej zaczęto stosować systemy mikrotestowe, czyli panele z zestawem środowisk diagnostyki różnicowej, co przyspiesza prowadzenie badań. Systemy mikrotestów stosuje się również do określania wrażliwości mikroorganizmów na leki przeciwdrobnoustrojowe poprzez rozcieńczenie antybiotyku w płynnej pożywce.
Oceniając wyniki badania bakteriologicznego lekarz musi wziąć pod uwagę, że wynik negatywny nie zawsze oznacza brak patogenu i może wiązać się ze stosowaniem leków przeciwdrobnoustrojowych, dużą aktywnością mikrobójczą krwi oraz błędami technicznymi. Wykrycie drobnoustroju chorobotwórczego w materiale pobranym od pacjenta, niezależnie od obrazu klinicznego, możliwe jest w przypadku rekonwalescencji, zdrowego lub przejściowego nosicielstwa bakteryjnego.
Izolację z krwi, przy zachowaniu wszelkich zasad aseptyki, drobnoustrojów oportunistycznych (staphylococcus epidermidis, Escherichia coli), a nawet saprofitów należy uznać za przejaw bakteriemii, zwłaszcza jeśli drobnoustroje te zostaną znalezione w więcej niż jednej próbce materiału lub w różnych podłożach ( krew, mocz), ponieważ Zmniejszając immunoreaktywność organizmu, te i inne „niepatogenne” mikroorganizmy mogą być czynnikami sprawczymi procesów zakaźnych, w tym sepsy.
Jest pewna trudność interpretacja wyników badań bakteriologicznych pożywek niesterylnych, a mianowicie dowód na etiologiczną rolę mikroorganizmów oportunistycznych. W tym przypadku brane są pod uwagę takie wskaźniki, jak rodzaj izolowanych kultur, liczba komórek drobnoustrojów danego typu w materiale, ich wielokrotna izolacja w czasie choroby, obecność monokultury lub asocjacja drobnoustroju.
Yushchuk N.D., Vengerov Yu.Ya.
Metoda bakteriologiczna (kulturowa).
zestaw metod sztucznej hodowli mikroorganizmów na pożywkach w celu ich identyfikacji przy stwierdzeniu choroby zakaźnej lub innego procesu wywołanego przez drobnoustroje oraz określenia szeregu właściwości fizjologicznych do innych celów, na przykład przy wyborze leku do chemioterapii. Nowoczesne metody studiowania większości biol. właściwości bakterii są możliwe tylko wtedy, gdy istnieją czysta woda(cm.). Zanieczyszczenie zioła innymi rodzajami drobnoustrojów z reguły prowadzi do zniekształconych wyników i błędnych wniosków. Dlatego pierwszym zadaniem B.m. jest uzyskanie czystej trawy dowolnego rodzaju (var) ze związku drobnoustrojów i zapobieganie zanieczyszczeniu obcą mikroflorą materiału do badań i hodowli drobnoustrojów na wszystkich etapach badań. Jest to możliwe w przypadku gromadzenia materiału w sterylnych warunkach w sterylnych pojemnikach, zaszczepiania materiału do sterylnych pożywek za pomocą sterylnego instrumentu, zapobiegania przedostawaniu się drobnoustrojów z powietrza podczas dostarczania, przechowywania i inkubacji materiału oraz zaszczepionych pożywek. Drugie zadanie B.m. - identyfikacja drobnoustrojów(patrz) izolowane czyste zioła, trzeci to określenie dodatkowych właściwości, na przykład wrażliwości na antybiotyki, zjadliwości. Etapy B.M.: 1) zbieranie materiału (patrz. Materiały do badań) i jego dostarczanie do bakterii. laboratorium; 2) badania mikroskopowe. materiał (patrz Metoda bakterioskopowa). Często nie wykonuje się tego etapu, choć mimo mniejszej czułości w niektórych przypadkach przeprowadza się wstępną mikroskopię sprawy dostarcza przybliżonych informacji o patogenie i umożliwia dobór pożywek niezbędnych do zaszczepienia; 3) przetwarzanie badań. materiał fizyczny lub chemia. czynników w celu usunięcia lub ograniczenia obcej mikroflory. Środek ten stosuje się na przykład podczas badania plwociny, izolacji drobnoustrojów kwasoodpornych i przetrwalnikujących; 4) badania siewne. materiał (patrz Kultury bakteriologiczne) na pożywkach w celu uzyskania izolowanych kolonii; 5) inkubacja zaszczepionych pożywek. Czas i temperatura inkubacji zależą od oczekiwanego gatunku rośliny. Zazwyczaj rośliny trzyma się w termostacie w temperaturze 37°C przez 1-2 dni. W przypadku braku wzrostu okres inkubacji można przedłużyć o kolejne 2–3 dni. W przypadku dłuższej inkubacji należy zapobiec wysychaniu podłoża, w tym celu plony umieszcza się w eksykatorze z wodą lub zatyczki probówek wypełnia się parafiną; 6) badania kolonie(cm.). Do badań wybiera się jednorodne izolowane kolonie położone daleko od krawędzi naczynia i wzdłuż skoku pętli, otoczone linią i ponumerowane. Jeżeli badanie przeprowadza się w sposób nieukierunkowany (proces polietiologiczny itp.), to na podstawie wyników oględzin wybiera się 2-3 kolonie wszystkich typów obecnych na płytce i wykonuje się z nich rozmazy; 7) powtórny wysiew wybranych rodzin na pożywkę akumulacyjną. W tym celu z pozostałej części kolonii w rozmazie nacięcia identyfikowano bakterie o jednakowym kształcie i kolorze; za pomocą ezy, starając się nie dotykać sąsiednich kolonii, pobiera się część bakterii i zaszczepia ją na MPA fazowany w probówce lub specjalnym podłożu ze smugą; 8) inkubacja upraw w termostacie do momentu pojawienia się ciągłego wzrostu (zwykle 1-2 dni); 9) określenie czystości trawy uprawianej na podłożach skośnych poprzez badanie makroskopowe wzrostu i mikroskopię jej wymazu; 10) identyfikację wyizolowanej czystej trawy i w razie potrzeby (na wniosek lekarza, epidemiologa) oznaczenie różnych biolów. sv-v; 11) wnioski dotyczące tożsamości gatunkowej wybranego gatunku i jego cech charakterystycznych. Wniosek jest podany na oficjalnym formularzu z odniesieniem do numeru, pod Krymem roślina ta jest wpisana do dziennika laboratoryjnego. B.m. jest głównym składnikiem diety większości bakterii. infekcje. Z reguły ma wysoką czułość, co pozwala odróżnić go od badań. czysty materiał, nawet jeśli dawka nasienna materiału zawierała kilkadziesiąt osobników. Dla B.m. charakteryzuje się dużą swoistością. Izolacja jednego lub drugiego rodzaju bakterii z materiału patologicznego pod pewnymi warunkami (patrz. Czynnik sprawczy choroby) wiarygodnie ustala etiologię procesu patologicznego. Wyjątek stanowią bakterie oportunistyczne, autochtoniczne dla danego biotopu, w celu określenia etiolu. Rola tego wymaga specjalnych kryteriów, a także rozróżnienia między nosicielstwem a chorobą (na przykład nosicielstwem błonicy w paciorkowcowym bólu gardła). Wartość B.m. polega również na tym, że za jego pomocą można ustalić leki niezbędne do przepisania chemioterapii i seroterapii, ustalenia źródła zakażenia i mechanizmów przenoszenia patogenu oraz doboru środków przeciwepidemicznych. Wreszcie B.m. odnosi się do wczesnych metod d-ki. Wady B. m. - niebezpieczeństwo infekcji, złożoność, pracochłonność, czas trwania. Wiarygodne dane na temat składu mikroflory i jej właściwości można uzyskać jedynie badając próbkę 3-10 flory.
