Ферментативная активность микроорганизмов богата и разнообразна. По ней можно установить не только видовую и типовую принадлежность микроба, но и определить его варианты (так называемые биовары). Рассмотрим основные ферментативные свойства и их качественное определение.
Расщепление углеводов (сахаролитическая активность), т. е. способность расщеплять сахара и многоатомные спирты с образованием кислоты или кислоты и газа, изучают на средах Гисса, которые содержат тот или иной углевод и индикатор. Под действием образующейся при расщеплении углевода кислоты индикатор изменяет окраску среды. Поэтому эти среды названы "пестрый ряд". Микробы, не ферментирующие данный углевод, растут на среде, не изменяя ее. Наличие газа устанавливают по образованию пузырьков в средах с агаром или по скоплению его в "поплавке" на жидких средах. "Поплавок" - узкая стеклянная трубочка с запаянным концом, обращенным вверх, которую до стерилизации помещают в пробирку со средой (рис. 18).
Рис. 18. Изучение сахаролитической активности микроорганизмов. I - "пестрый ряд": а - жидкая среда с углеводами и индикатором Андреде; б - полужидкая среда с индикатором ВР: 1 - микроорганизмы не ферментируют углевод; 2 - микроорганизмы ферментируют углевод с образованием кислоты; 3 - микроорганизмы ферментируют углевод с образованием кислоты и газа; II - колонии микроорганизмов, не разлагающих (бесцветные) и разлагающих лактозу (фиолетовые на среде ЭМС - слева, красные на среде Эндо - справа)
Кроме того, сахаролитическую активность изучают на средах Эндо, ЭМС, Плоскирева. Микроорганизмы, сбраживая до кислоты находящийся в этих средах молочный сахар (лактозу), образуют окрашенные колонии - кислота изменяет цвет имеющегося в среде индикатора. Колонии микробов, не ферментирующих лактозу, бесцветны (см. рис. 18).
Молоко при росте микробов, сбраживающих лактозу, свертывается.
При росте микроорганизмов, образующих амилазу, на средах с растворимым крахмалом происходит его расщепление. Об этом узнают, прибавив к культуре несколько капель раствора Люголя - цвет среды не изменяется. Нерасщепленный крахмал дает с этим раствором синее окрашивание.
Протеолитические свойства (т. е. способность расщеплять белки, полипептиды и т. п.) изучают на средах с желатином, молоком, сывороткой, пептоном. При росте на желатиновой среде микробов, ферментирующих желатин, среда разжижается. Характер разжижения, вызываемый разными микробами, различен (рис. 19). Микробы, расщепляющие казеин (молочный белок), вызывают пептонизацию молока - оно приобретает вид молочной сыворотки. При расщеплении пептонов могут выделяться индол, сероводород, аммиак. Их образование устанавливают с помощью индикаторных бумажек. Фильтровальную бумагу заранее пропитывают определенными растворами, высушивают, нарезают узенькими полосками длиной 5-6 см и после посева культуры на МПБ помещают под пробку между нею и стенкой пробирки. После инкубации в термостате учитывают результат. Аммиак вызывает посинение лакмусовой бумажки; при выделении сероводорода на бумажке, пропитанной 20% раствором свинца ацетата и натрия гидрокарбоната, происходит образование свинца сульфата - бумажка чернеет; индол вызывает покраснение бумажки, пропитанной раствором щавелевой кислоты (см. рис. 19).
Рис. 19. Протеолитические свойства микроорганизмов. 1 - формы разжижения желатина; II - определение сероводорода; III - определение индола: 1 - отрицательный результат; 2 - положительный результат
Помимо указанных сред, способность микроорганизмов расщеплять различные питательные субстраты определяют с помощью бумажных дисков, пропитанных определенными реактивами (системы индикаторные бумажные "СИБ"). Эти диски опускают в пробирки с исследуемой культурой и уже через 3 ч инкубации в термостате при 37° С по изменению цвета дисков судят о разложении углеводов, аминокислот, белков и т. д.
Гемолитические свойства (способность разрушать эритроциты) изучают на средах с кровью. Жидкие среды при этом становятся прозрачными, а на плотных средах вокруг колонии появляется прозрачная зона (рис. 20). При образовании метгемоглобина среда зеленеет.
Рис. 20. Гемолиз вокруг колоний, растущих на агаре с кровью
Сохранение культур
Выделенные и изученные культуры (штаммы), представляющие ценность для науки или производства, хранят в музеях живых культур. Общесоюзный музей находится в Государственном НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича (ГИСК).
Задача хранения - поддержать жизнеспособность микроорганизмов и предупредить их изменчивость. Для этого надо ослабить или прекратить обмен в микробной клетке.
Один из самых совершенных методов длительного сохранения культур - лиофилизация - высушивание в вакууме из замороженного состояния позволяет создать состояние анабиоза. Высушивание проводят в специальных аппаратах. Хранят культуры в запаянных ампулах при температуре 4° С, лучше при -30-70° С.
Восстановление высушенных культур. Сильно нагревают кончик ампулы в пламени горелки и прикасаются к нему ватным тампоном, слегка * смоченным холодной водой, чтобы на стекле образовались микротрещины, через которые воздух медленно просочится внутрь ампулы. При этом, проходя через разогретые края трещин, воздух стерилизуется.
* (При избытке воды на тампоне она может попасть в ампулу и нарушить стерильность культуры: ее засосет через образовавшиеся микротрещины, так как в ампуле вакуум. )
Внимание! Не забывайте, что в запаянной ампуле вакуум. Если воздух в нее попадает сразу через большое отверстие, может распылиться находящаяся в ампуле культура и произойти ее выброс.
Дав войти воздуху, быстро пинцетом надламывают и удаляют верхушку ампулы. Слегка обжигают отверстие и стерильной пастеровской пипеткой или шприцем вносят в ампулу растворитель (бульон или изотонический раствор). Перемешивают содержимое ампулы и засевают на среды. Рост восстановленных культур в первых посевах может быть замедлен.
Длительно сохранять культуры можно также в жидком азоте (-196° С) в специальных приборах.
Методы непродолжительного сохранения культур следующие: 1) субкультивирование (периодические пересевы на свежие среды) с интервалами, зависящими от свойств микроорганизма, среды и условий культивирования. Между пересевами культуры хранят при 4° С; 2) сохранение под слоем масла. Культуру выращивают в агаре столбиком высотой 5-6 см, заливают стерильным вазелиновым маслом (слой масла примерно 2 см) и хранят вертикально в холодильнике. Сроки хранения у разных микроорганизмов разные, поэтому из пробирок периодически высевают культуру, чтобы проверить ее жизнеспособность; 3) хранение при -20-70° С; 4) хранение в запаянных пробирках. По мере надобности сохраняемый материал высевают на свежую среду.
Контрольные вопросы
1. Что входит в понятие "бактериологическое исследование"?
2. Какой должна быть культура для такого исследования?
3. Что такое колония микробов, культура, штамм, клон?
4. Что входит в понятие "культуральные свойства микробов"?
Задание
1. Изучите и опишите несколько колоний. Пересейте их на скошенный агар и на сектор.
2. Изучите и опишите характер роста - культуры на скошенном агаре. Определите чистоту и морфологию культуры в окрашенном препарате.
3. Пересейте культуру со скошенного агара на бульон и на дифференциально-диагностические среды. Изучите и запишите в протокол характер роста культуры на этих средах и ее ферментативные свойства.
Ферментативная активность почв [от лат. Fermentum - закваска] -способность почвы проявлять каталитическое воздействие на процессы превращения экзогенных и собственных органических и минеральных соединений благодаря имеющимся в ней ферментам. Характеризуя ферментативную активность почв, имеют в виду суммарный показатель активности. Ферментативная активность различных почв неодинакова и связана с их генетическими особенностями и комплексом взаимодействующих экологических факторов. Уровень ферментативной активности почв определяется активностью различных ферментов (инвертазы, протеаз, уреазы, дегидрогеназ, каталазы, фосфатаз), выражаемой количеством разложенного субстрата за единицу времени на 1 г почвы.
Биокаталитическая активность почв зависит от степени обогащенности их микроорганизмами и от типа почв. Активность ферментов изменяется по генетическим горизонтам, которые отличаются по содержанию гумуса, типам реакций, окислительно-восстановительным потенциалом и другими показателями по профилю.
В целинных лесных почвах интенсивность ферментативных реакций в основном определяют горизонты лесной подстилки, а в пахотных - пахотные слои. Все биологически менее активные генетические горизонты, находящиеся под горизонтами А или Ап, имеют низкую активность ферментов. Активность их незначительно возрастает при окультуривании почв. После освоения лесных почв под пашню ферментативная активность образованного пахотного горизонта по сравнению с лесной подстилкой резко снижается, но по мере его окультуривания повышается и в сильно окультуренных почвах приближается или превышает показатели лесной подстилки.
Ферментативная активность отражает состояние плодородия почв и внутренние изменения, происходящие при сельскохозяйственном использовании и повышении уровня культуры земледелия. Эти изменения обнаруживаются как при вовлечении целинных и лесных почв в культуру, так и при различных приемах их использования .
По всей Беларуси в пахотных почвах ежегодно теряется до 0,9 т/га гумуса. В результате эрозии ежегодно безвозвратно уносится с полей 0,57 т/га гумуса. Причинами дегумификации почв являются усиление минерализации почвенного органического вещества, отставание процессов новообразования гумуса от минерализации в связи с недостаточным поступлением в почву органических удобрений и снижения ферментативной активности почвы .
Биохимические превращения органического вещества почвы происходят в результате микробиологической деятельности под влиянием ферментов. ферментативный активность почва микроорганизм
Особую роль играют ферменты в жизнедеятельности животных, растений и микроорганизмов. Почвенные ферменты участвуют при распаде растительных, животных и микробных остатков, а также синтезе гумуса. В результате питательные вещества из трудно усвояемых соединений переходят в легко доступные формы для растений и микроорганизмов. Ферменты отличаются высокой активностью, строгой специфичностью действия и большой зависимостью от различных условий внешней среды. Благодаря каталитической функции они обеспечивают быстрое протекание в организме или вне его огромного числа химических реакций .
Совместно с другими критериями ферментативная активность почв может служить надёжным диагностическим показателем для выяснения степени окультуренности почв. В результате исследований 4, с. 91 установлена зависимость между активностью микробиологических и ферментативных процессов и проведением мероприятий, повышающих плодородие почв. Обработка почв, внесение удобрений существенно изменяют экологическую обстановку развития микроорганизмов.
В настоящее время в биологических объектах обнаружено несколько тысяч индивидуальных ферментов, а несколько сотен из них выделено и изучено. Известно, что живая клетка может содержать до 1000 различных ферментов, каждый из которых ускоряет ту или иную химическую реакцию .
Интерес к применению ферментов вызван еще и тем, что постоянно возрастают требования по увеличению безопасности технологических процессов. Присутствуя во всех биологических системах, являясь одновременно продуктами и инструментами этих систем, ферменты синтезируются и функционируют при физиологических условиях (pH, температура, давление, присутствие неорганических ионов), после чего легко выводятся, подвергаясь разрушению до аминокислот. Как продукты, так и отходы большинства процессов, протекающих с участием ферментов, являются нетоксичными и легко разрушаемыми. Кроме того, во многих случаях, ферменты, используемые в промышленности, получают экологически безопасным путем. От небиологических катализаторов ферменты отличают не только безопасность и повышенная способность к биодеградации, но и специфичность действия, мягкие условия протекания реакций и высокая эффективность. Эффективность и специфичность действия ферментов позволяет получать целевые продукты с высоким выходом, что делает использование ферментов в промышленности экономически выгодным. Применение ферментов способствует сокращению расхода воды и энергии в технологических процессах, уменьшает выбросы в атмосферу CO2, снижает риск загрязнения окружающей среды побочными продуктами технологических циклов .
Применением передовой агротехники можно изменять в благоприятную сторону микробиологические процессы не только пахотного, но и подпахотного слоев почвы.
При непосредственном участии внеклеточных ферментов происходит разложение органических соединений почвы. Так, протеолитические ферменты расщепляют белковые вещества и до аминокислот.
Уреаза разлагает мочевину до СО2 и NH3. Образующийся аммиак и аммонийные соли служат источником азотного питания растений и микроорганизмов.
Инвертаза и амилаза участвуют в расщеплении углеводов. Ферменты группы фосфатов разлагают фосфорорганические соединения почвы и играют важную роль в фосфатном режиме последней.
Для характеристики общей ферментативной активности почвы обычно используют наиболее распространенные ферменты, свойственные подавляющему большинству почвенной микрофлоры - инвертазу, каталазу, протеазу и другие .
В условиях нашей республики проводилось немало исследований 16, с. 115 по изучению изменения уровня плодородия и ферментативной активности почв при антропогенном воздействии, однако полученные данные не дают исчерпывающий ответ на характер изменений из-за сложности сопоставления результатов в виду различия условий проведения опытов и методик исследований.
В связи с этим поиск оптимального решения проблемы улучшения гумусного состояния почвы и ее ферментативной активности в конкретных почвенно-климатических условиях на основе разработки ресурсосберегающих приемов основной обработки почвыё применения почвозащитных севооборотов, способствующих сохранению структуры, предотвращению переуплотнения почвы и улучшению их качественного состояния и восстановлению плодородия почв при минимальных затратах, весьма актуален.
Ферменты - это катализаторы химических реакций белковой природы, отличающиеся специфичностью действия в отношении катализа определенных химических реакций. Они являются продуктами биосинтеза всех живых почвенных организмов: древесных и травянистых растений, мхов, лишайников, водорослей, микроорганизмов, простейших, насекомых, беспозвоночных и позвоночных животных, представленных в природной обстановке определенными совокупностями - биоценозами.
Биосинтез ферментов в живых организмах осуществляется благодаря генетическим факторам, ответственным за наследственную передачу типа обмена веществ и его приспособительную изменчивость. Ферменты являются тем рабочим аппаратом, при помощи которого реализуется действие генов. Они катализируют в организмах тысячи химических реакций, из которых в итоге слагается клеточный обмен. Благодаря им химические реакции в организме осуществляются с большой скоростью.
В настоящее время известно более 900 ферментов. Их подразделяют на шесть главных классов.
1. Оксиредуктазы, катализирующие окислительно-восстановительные реакции.
2. Трансферазы, катализирующие реакции межмолекулярного переноса различных химических групп и остатков.
3. Гидролазы, катализирующие реакции гидролитического расщепления внутримолекулярных связей.
4. Лиазы, катализирующие реакции присоединения групп по двойным связям и обратные реакции отрыва таких групп.
5. Изомеразы, катализирующие реакции изомеризации.
6. Лигазы, катализирующие химические реакции с образованием связей за счет АТФ (аденозинтрифосфорной кислоты).
При отмирании и перегнивании живых организмов часть их ферментов разрушается, а часть, попадая в почву, сохраняет свою активность и катализирует многие почвенные химические реакции, участвуя в процессах почвообразования и в формировании качественного признака почв - плодородия. В разных типах почв под определенными биоценозами сформировались свои ферментативные комплексы, отличающиеся активностью биокаталитических реакций.
В. Ф. Купревич и Т. А. Щербакова (1966) отмечают, что важной чертой ферментативных комплексов почв является упорядоченность действия имеющихся групп ферментов, которая проявляется в том, что обеспечивается одновременное действие ряда ферментов, представляющих различные группы; исключаются образование и накопление соединений, имеющихся в почве в избытке; излишки накопившихся подвижных простых соединений (например, NH 3) тем или иным путем временно связываются и направляются в циклы, завершающиеся образованием более или менее сложных соединений. Ферментативные комплексы являются уравновешенными саморегулирующимися системами. В этом основную роль играют микроорганизмы и растения, постоянно пополняющие почвенные ферменты, так как многие из них являются короткоживущими. О количестве ферментов косвенно судят по их активности во времени, которая зависит от химической природы реагирующих веществ (субстрата, фермента) и от условий взаимодействия (концентрации компонентов, рН, температуры, состава среды, действия активаторов, ингибиторов и т.д.).
В данной главе рассматривается участие в некоторых химических почвенных процессах ферментов из класса гидролаз - активность инвертазы, уреазы, фосфатазы, протеазы и из класса оксиредуктаз - активность каталазы, пероксидазы и полифенолоксидазы, имеющих большое значение в превращении азот- и фосфорсодержащих органических веществ, веществ углеводного характера и в процессах образования гумуса. Активность этих ферментов - существенный показатель плодородия почв. Кроме того, будет охарактеризована активность этих ферментов в лесных и пахотных почвах разной степени окультуренности на примере дерново-подзолистых, серых лесных и дерново-карбонатных почв.
ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЧВЕННЫХ ФЕРМЕНТОВ
Инвертаза - катализирует реакции гидролитического расщепления сахарозы на эквимолярные количества глюкозы и фруктозы, воздействует также на другие углеводы с образованием молекул фруктозы - энергетического продукта для жизнедеятельности микроорганизмов, катализирует фруктозотрансферазные реакции. Исследования многих авторов показали, что активность инвертазы лучше других ферментов отражает уровень плодородия и биологической активности почв.
Уреаза- катализирует реакции гидролитического расщепления мочевины на аммиак и диоксид углерода. В связи с использованием мочевины в агрономической практике необходимо иметь в виду, что активность уреазы выше у более плодородных почв. Она повышается во всех почвах в периоды их наибольшей биологической активности - в июле - августе.
Фосфатаза (щелочная и кислая) - катализирует гидролиз ряда фосфорорганических соединений с образованием ортофосфата. Активность фосфатазы находится в обратной зависимости от обеспеченности растений подвижным фосфором, поэтому она может быть использована как дополнительный показатель при установлении потребности внесения в почвы фосфорных удобрений. Наиболее высокая фосфатазная активность в ризосфере растений.
Протеазы - это группа ферментов, при участии которых белки расщепляются до полипептидов и аминокислот, далее они подвергаются гидролизу до аммиака, диоксида углерода и воды. В связи с этим протеазы имеют важнейшее значение в жизни почвы, так как с ними связаны изменение состава органических компонентов и динамика усвояемых для растений форм азота.
Каталаза - в результате ее активирующего действия происходит расщепление перекиси водорода, токсичной для живых организмов, на воду и свободный кислород. Большое влияние на каталазную активность минеральных почв оказывает растительность. Как правило, почвы, находящиеся под растениями с мощной глубоко проникающей корневой системой, характеризуются высокой каталазной активностью. Особенность активности каталазы заключается в том, что вниз по профилю она мало изменяется, имеет обратную зависимость от влажности почв и прямую - от температуры.
Полифенолоксидаза и пероксидаза - им в почвах принадлежит важная роль в процессах гумусообразования. Полифенолоксидаза катализирует окисление полифенолов в хиноны в присутствии свободного кислорода воздуха. Пероксидаза же катализирует окисление полифенолов в присутствии перекиси водорода или органических перекисей. При этом ее роль состоит в активировании перекисей, поскольку они обладают слабым окисляющим действием на фенолы. Далее может происходить конденсация хинонов с аминокислотами и пептидами с образованием первичной молекулы гуминовой кислоты, которая в дальнейшем способна усложняться за счет повторных конденсаций (Кононова, 1963).
Замечено (Чундерова, 1970), что отношение активности полифенолоксидазы (S) к активности пероксидазы (D), выраженное в процентах (), имеет связь с накоплением в почвах гумуса, поэтому эта величина получила название условный коэффициент накопления гумуса (К). У пахотных слабоокультуренных почв Удмуртии за период с мая по сентябрь он составил: у дерново-подзолистой - 24 %, у серой лесной оподзоленной - 26 и у дерново-карбонатной почвы - 29 %.
ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ ПРОЦЕССЫ В ПОЧВАХ
Биокаталитическая активность почв находится в значительном соответствии со степенью обогащенности их микроорганизмами (табл. 11), зависит от типа почв и изменяется по генетическим горизонтам, что связано с особенностями изменения содержания гумуса, реакции, Red-Ox-потенциала и других показателей по профилю.
В целинных лесных почвах интенсивность ферментативных реакций в основном определяют горизонты лесной подстилки, а в пахотных - пахотные слои. Как в одних, так и в других почвах все биологически менее активные генетические горизонты, находящиеся под горизонтами А или А п, имеют низкую активность ферментов, незначительно изменяющуюся в положительную сторону при окультуривании почв. После освоения лесных почв под пашню ферментативная активность образованного пахотного горизонта по сравнению с лесной подстилкой оказывается резко сниженной, но по мере его окультуривания повышается и в сильно окультуренных видах приближается или превышает показатели лесной подстилки.
11. Сопоставление биогенносга и ферментативной активности почв Среднего Предуралья (Пухидская, Ковриго, 1974)
|
№ разреза, название почвы |
Горизонт, глубина взятия образца, см |
Общее количество микроорганизмов, тыс. на 1 г абс. сух. почвы (в среднем за 1962, 1964-1965 гг.) |
Показатели активности ферментов (в среднем за 1969-1971 гг.) |
|||||||
|
Инвертаза, мг глюкозы на 1 г почвы за I сут |
Фосфатаза, мг фенолфталеина на 100 г почвы за 1 ч |
Уреаза, мг NH, нa 1 г почвы за 1 сут |
Каталаза, мл 0 2 на 1 г почвы за 1 мин |
Полифенолоксидаза |
Пероксидаза |
|||||
|
мг пурпурогаллина на 100 г почвы |
||||||||||
|
3. Дерново-среднеподзолистая среднесуглинистая (под лесом) |
||||||||||
|
Не определяли |
||||||||||
|
1.Дерново-средне-подзолистая средне-суглинистая слабоокультуренная |
||||||||||
|
10.Сераялесная оподзоленная тяжел осуглинистая слабоокультуренная |
||||||||||
|
2. Дерново-карбонатная слабовыщело-ченная л егкосуглинистая слабоокультуренная |
||||||||||
Активность биокаталитических реакций почв изменяется. Наименьшая она весной и осенью, а наиболее высокая обычно в июле-августе, что соответствует динамике общего хода биологических процессов в почвах. Однако в зависимости от типа почв и их географического положения динамика ферментативных процессов весьма различна.
Контрольные вопросы и задания
1. Какие соединения называют ферментами? Каковы их продуцирование и значение для живых организмов? 2. Назовите источники почвенных ферментов. Какую роль играют отдельные ферменты в почвенных химических процессах? 3. Дайте понятие о ферментативном комплексе почв и его функционировании. 4. Дайте общую характеристику течения ферментативных процессов в целинных и пахотных почвах.
Активность ферментов. Под активностью фермента понимают такое его количество, которое катализирует превращение определенного количества субстрата в единицу времени. Для выражения активности препаратов ферментов используют две альтернативные единицы: международную (МЕ) и катал (кат). За международную единицу активности фермента принято такое его количество, которое катализирует превращение 1 мкмоля субстрата в продукт за 1 мин в стандартных условиях (обычно оптимальных). Один катал обозначает количество фермента, катализирующее превращение 1 моля субстрата за 1 с (1 кат = 6 ∙ 10 7 МЕ). При бимолекулярной реакции A + В = С + D за единицу активности фермента принимают такое его количество, которое катализирует превращение 1 мкмоля А или В, или 2 мкмолей А (если В = А), за 1 мин.
Часто ферментные препараты характеризуются удельной активностью, которая отражает степень очистки фермента. Удельная активность – это число единиц активности фермента, приходящихся на 1 мг белка.
Молекулярная активность (число оборотов фермента) – число молекул субстрата, подвергающееся превращению одной молекулой фермента за 1 мин при полном насыщении фермента субстратом. Она равна числу единиц активности фермента, деленному на количество фермента, выраженное в микромолях. Понятие молекулярной активности применимо только для чистых ферментов.
Когда известно количество активных центров в молекуле фермента, вводится понятие активности каталитического центра . Она характеризуется числом молекул субстрата, которое подвергается превращению за 1 мин в расчете на один активный центр.
Активность ферментов сильно зависит от внешних условий, среди которых первостепенное значение имеют температура и рН среды. Повышение температуры в интервале 0−50°С обычно приводит к плавному увеличению ферментативной активности, что связано с ускорением процессов формирования фермент-субстратного комплекса и всех последующих событий катализа. При повышении температуры на каждые 10°С скорость реакции увеличивается примерно вдвое (правило Вант-Гоффа). Однако дальнейшее возрастание температуры (>50°С) сопровождается повышением количества инактивированного фермента за счет денатурации его белковой части, что выражается в снижении активности. Каждый фермент характеризуется температурным оптимумом – значением температуры, при котором регистрируется наибольшая его активность.
Зависимость активности ферментов от значения рН среды имеет сложный характер. Для каждого фермента характерен оптимум рН среды , при котором он проявляет максимальную активность. При удалении от этого значения в ту или другую сторону ферментативная активность снижается. Это объясняется изменением состояния активного центра фермента (уменьшением или увеличением ионизации функциональных групп), а также третичной структуры всей белковой молекулы, которая зависит от соотношения в ней катионных и анионных центров. Большинство ферментов имеют оптимум рН в области нейтральных значений. Однако есть ферменты, проявляющие максимальную активность при рН 1,5 (пепсин) или 9,5 (аргиназа). При работе с ферментами необходимо поддерживать рН с помощью соответствующего буферного раствора.
Активность ферментов подвержена значительным колебаниям в зависимости от воздействия ингибиторов (веществ, частично или полностью снижающих активность) и активаторов (веществ, увеличивающих активность). Их роль выполняют катионы металлов, некоторые анионы, переносчики фосфатных групп, восстановительных эквивалентов, специфические белки, промежуточные и конечные продукты метаболизма и др.
Принципы ферментативной кинетики. Суть кинетических исследований состоит в определении максимальной скорости ферментативной реакции (V max) и константы Михаэлиса К М. Ферментативная кинетика изучает скорости количественных превращений одних веществ в другие под действием ферментов. Скорость ферментативной реакции измеряют по убыли субстрата или приросту образующегося продукта за единицу времени, либо по изменению концентрации одной из смежных форм кофермента.
Влияние концентрации фермента на скорость реакции выражается в следующем: если концентрация субстрата постоянна (при условии избытка субстрата), то скорость реакции пропорциональна концентрации фермента. Для кинетических исследований используют концентрацию фермента 10 8 М активных центров. Оптимальное значение концентрации фермента определяют из графика зависимости активности фермента от его концентрации. Оптимальным считается значение, лежащее на плато полученного графика в области значений активности фермента, мало зависящих от его концентрации (рис. 4.3).
Рис. 4.3. Зависимость скорости ферментативной реакции
от концентрации фермента
Для изучения влияния концентрации субстрата на скорость ферментативной реакции сначала строят кинетическую кривую, отражающую изменение концентрации субстрата (S 1) или продукта (Р 1) во времени (рис. 4.4) и измеряют начальную скорость (V 1) реакции как тангенс угла наклона касательной к кривой в нулевой точке.
Рис. 4.4. Кинетические кривые ферментативной реакции
Построив кинетические кривые для других значений концентрации данного субстрата (S 2 , S 3 , S 4 и т. д.) или продукта (Р 2 , Р 3 , Р 4 и т. д.) и определив начальные скорости (V 2, V 3 , V 4 и т. д.) реакции, строят график зависимости начальной скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата (при постоянной концентрации фермента), который имеет вид гиперболы (рис. 4.5).
Рис. 4.5. Зависимость начальной скорости ферментативной реакции
от концентрации субстрата
Кинетика многих ферментативных реакций описывается уравнением Михаэлиса Ментен. При постоянной концентрации фермента и малых значениях концентрации субстрата [S] начальная скорость реакции прямо пропорциональна [S] (рис. 4.5). В этом случае говорят о полунасыщении фермента субстратом, когда половина молекул фермента находится в форме фермент-субстратного комплекса и скорость реакции V = 1/2V max . В отношении субстрата реакция имеет 1-й порядок (скорость реакции прямо пропорциональна концентрации одного реагирующего вещества) или 2-й порядок (скорость реакции пропорциональна произведению концентраций двух реагирующих веществ).
При высоких значениях концентрации субстрата [S] скорость реакции почти не зависит от [S]: при дальнейшем увеличении [S] скорость реакции растет все медленнее и в итоге становится постоянной (максимальной) (рис. 4.5). При этом достигается полное насыщение фермента субстратом, когда все молекулы фермента находятся в форме фермент-субстратного комплекса и V = V max . В отношении субстрата реакция имеет 0-й порядок (скорость реакции не зависит от концентрации реагирующих веществ).
В 1913 г. Л. Михаэлис и М. Ментен предложили простую модель, объясняющую такую кинетику. Согласно этой модели, образование специфического фермент-субстратного комплекса является необходимым промежуточным этапом катализа.
k 1 k 3
Е + S ⇄ ЕS → Е + Р
Фермент Е соединяется с субстратом S, образуя ЕS-комплекс. Константа скорости этого процесса k 1 . Судьба ЕS-комплекса складывается двояко: он может либо диссоциировать на фермент Е и субстрат S с константой скорости k 2 , либо подвергнуться дальнейшему превращению, образуя продукт Р и свободный фермент Е, с константой скорости k 3 . При этом постулируется, что продукт реакции не превращается в исходный субстрат. Это условие соблюдается на начальной стадии реакции, пока концентрация продукта невелика.
Скорость катализа определяют в стационарных условиях , когда концентрация промежуточных продуктов остается постоянной, тогда как концентрация исходных веществ и конечных продуктов изменяется. Это имеет место в том случае, когда скорость образования ЕS-комплекса равна скорости его распада.
Можно ввести новую константу К М – константу Михаэлиса (моль/л), которая равна
Уравнение Михаэлиса – Ментен , выражающее количественное соотношение между скоростью ферментативной реакции и концентрацией субстрата, имеет вид
(4.2)
Это уравнение соответствует графику зависимости скорости реакции от концентрации субстрата. При низких концентрациях субстрата , когда [S] намного ниже К М, V = V max [S] / К М, т. е. скорость реакции прямо пропорциональна концентрации субстрата. При высоких концентрациях субстрата , когда [S] намного выше К М, V = V max , т. е. скорость реакции максимальна и не зависит от концентрации субстрата.
Если [S] = К М, то V = V max /2.
Таким образом, К М равна концентрации субстрата, при которой скорость реакции составляет половину максимальной .
Константа Михаэлиса (К М) и максимальная скорость реакции (V max) – важные характеристики скорости при разных концентрациях субстрата. V max – величина постоянная для каждого фермента позволяет оценить эффективность его действия.
Константа Михаэлиса показывает сродство субстрата к ферменту (в случае, когда k 2 >> k 3): чем меньше К М, тем больше сродство и выше скорость реакции, и наоборот. Каждый субстрат характеризуется своей величиной К М для данного фермента и по их значениям можно судить о субстратной специфичности фермента. Константа Михаэлиса зависит от природы субстрата, температуры, рН, ионной силы раствора и наличия ингибиторов.
В связи с тем, что определение V max и К М непосредственно из графической зависимости Михаэлиса – Ментен (рис.4.5) является неоднозначным, прибегают к линеаризации данного уравнения. Для этого его преобразуют в такую форму, чтобы графически оно выражалось прямой. Существует несколько методов линеаризации, среди которых наиболее часто применяют методы Лайнуивера – Бэрка и Эди – Хофсти.
Преобразование Лайнуивера – Бэрка имеет вид
(4.3)
Строят график зависимости 1/V = f (1/[S]) и получают прямую линию, пересечение которой с осью ординат дает величину 1/V max ; отрезок, отсекаемый прямой на оси абсцисс дает величину −1/К М, а тангенс угла наклона прямой к оси абсцисс равен К М /V max (рис. 4.6). Этот график позволяет более точно определять V max. Как мы увидим ниже, из этого графика можно также извлечь ценную информацию, касающуюся ингибирования активности фермента.
Рис. 4.6. Метод линеаризации уравнения Михаэлиса – Ментен
(по Лайнуиверу – Бэрку)
Метод Эди – Хофсти основан на преобразовании уравнения Михаэлиса – Ментен путем умножения обеих его частей наV max:
(4.4)
График в координатах V иV /[S] представляет собой прямую линию, пересечение которой с осью ординат дает величинуV max, а отрезок, отсекаемый прямой на оси абсцисс, – величинуV max /К М (рис. 4.7). Он позволяет очень просто определять К М иV max , а также выявлять возможные отклонения от линейности, не обнаруживаемые на предыдущем графике.
Рис. 4.7. Метод линеаризации уравнения Михаэлиса – Ментен
(по Эди – Хофсти)
Ингибирование активности ферментов. Действие ферментов можно полностью или частично подавить определенными химическими веществами – ингибиторами . По характеру своего действия ингибиторы подразделяются на обратимые и необратимые. В основе такого деления лежит прочность связывания ингибитора с ферментом.
Обратимые ингибиторы – это соединения, которые нековалентно взаимодействуют с ферментом и при их удалении активность фермента восстанавливается. Обратимое ингибирование может быть конкурентным, неконкурентным и бесконкурентным.
Примером конкурентного ингибирования является действие структурных аналогов субстрата, которые могут связываться с активным центром фермента похожим способом, как и субстрат, не превращаясь однако в продукт и препятствуя взаимодействию фермента с истинным субстратом, т. е. имеет место конкуренция между субстратом и ингбитором за связывание с активным центром фермента. В результате образования комплексов фермент-ингибитор (EI) концентрация ES-комплексов уменьшается и, как следствие, падает скорость реакции. Иными словами, конкурентный ингибитор уменьшает скорость катализа путем снижения доли молекул фермента, связавших субстрат.
Измерение скоростей реакций при разных концентрациях субстрата позволяет отличать конкурентное ингибирование от неконкурентного. При конкурентном ингибировании на графике зависимости 1/V =f (1/[S]) прямые пересекают ось ординат в одной точке 1/V max независимо от присутствия ингибитора, но в присутствии ингибитора увеличивается тангенс угла наклона прямой к оси абсцисс, т. е.V max не изменяется, а К М увеличивается, что свидетельствует об уменьшении сродства субстрата к ферменту в присутствии ингибитора (рис. 4.8). Следовательно, при достаточно высокой концентрации субстрата в условиях конкуренции за активный центр фермента, когда субстрат вытесняет ингибитор из активного центра, ингибирование может быть устранено, и скорость катализируемой реакции восстанавливается. При этом уравнение Михаэлиса − Ментен имеет вид
(4.5)
где [I] – концентрация ингибитора; K i – константа ингибирования.
Константа ингибирования характеризует сродство фермента к ингибитору и представляет собой константу диссоциации ЕI-комплекса:
(4.6)
В присутствии конкурентного ингибитора тангенс угла наклона прямой к оси абсцисс увеличивается на величину (1 + [I]/K i ).
Рис. 4.8. Конкурентное ингибирование:
а – схема; б – графическое выражение по Лайнуиверу − Бэрку
При неконкурентном ингибировании ингибитор отличается по структуре от субстрата и связывается не с активным, а с аллостерическим центром фермента. Это ведет к изменению конформации активного центра фермента, что сопровождается снижением каталитической активности фермента. Причем ингибитор может связываться не только со свободным ферментом (Е + I → EI), но и с фермент-субстратным комплексом (ES + I → ESI). Обе формы EI и ESI не активны. Субстрат и ингибитор могут быть одновременно связаны молекулой фермента, но участки их связывания не перекрываются. Действие неконкурентного ингибитора заключается в уменьшении числа оборотов фермента, а не в снижении доли связавших субстрат молекул фермента. Ингибитор не препятствует образованию ES-комплексов, но тормозит превращение субстрата в продукт. Вследствие этого V max уменьшается, т. е. в присутствии ингибитора пересечение прямой с осью ординат произойдет в более высокой точке (рис. 4.9). В той же мере возрастает и тангенс угла наклона прямой к оси абсцисс, равный К М /V max I . К М в отличие от V max не изменяется, поэтому неконкурентное ингибирование не может быть устранено увеличением концентрации субстрата.
Рис. 4.9. Неконкурентное ингибирование:
а – схема; б – графическое выражение по Лайнуиверу – Бэрку
Максимальная скорость реакции V max I в присутствии неконкурентного ингибитора описывается уравнением
(4.7)
В частном случае бесконкурентного ингибирования , когда ингибитор связывается только с ES-комплексом и не связывается со свободным ферментом, на графике зависимости 1/V = f (1/[S]) прямые параллельны друг другу и пересекают оси ординат и абсцисс в разных точках (рис. 4.10).
Рис. 4.10. Бесконкурентное ингибирование:
а – схема; б – графическое выражение по Лайнуиверу – Бэрку
Необратимые ингибиторы – это высокореакционноспособные соединения различной химической природы, которые могут взаимодействовать с функционально важными группами активного центра, образуя прочные ковалентные связи. Это приводит к безвозвратной потере активности фермента. В связи с этим теория Михаэлиса – Ментен, основанная на предположении, что присоединение ингибитора к ферменту носит обратимый характер, в данном случае неприменима.
Примером необратимого ингибирования служит взаимодействие ферментов с ионами тяжелых металлов, которые присоединяются к сульфгидрильным группам цистеиновных остатков фермента и образуют при этом меркаптиды – практически недиссоциирующие соединения, либо ковалентная модификация фермента под действием алкилирующих агентов.
Метаболизм - поддерживающая жизнь совокупность химических реакций организма. Вспомнив о миллиардах постоянно происходящих реакций, можно удивиться, как у нас остаются силы на что-то еще. А поскольку одна из главных целей метаболизма - обеспечение организма готовой к использованию энергией, очень важно, чтобы ее выработка превышала - и намного - затраты на производство. К счастью, в ходе эволюции мы получили молекулы, основной задачей которых стало уменьшение энергозатрат, необходимых для химических реакций в организме. Их называют ферментами.
Это крупные белковые молекулы, присутствующие во всех наших клетках и путем серии реакций превращающие одно (скажем, молекулу сахара), именуемое субстратом, в другое (например, связанное с глюкозой вещество, из которого организм синтезирует жиры) - продукт, или метаболит. Представьте себе ферменты как большие автоматизированные фабрики: с одной стороны огромного здания вы подаете бревно (субстрат), а на выходе получаете красивую салатницу (продукт). Конечно, можно сделать ее вручную, но на это уйдет намного больше сил и времени; фабрика сильно повышает эффективность.
Ферменты делают то же внутри клетки, быстро превращая субстраты в продукты и потребляя при этом очень мало энергии. Реакции, которые они вызывают (биологи используют слово «катализируют»), редко или вовсе не происходят без помощи ферментов. Если это случается, скорость реакции составляет крохотную долю возможной при участии фермента, а затраты энергии намного выше.
Относительные размеры ферментов очень велики. Их молекулы могут быть в 10–20 тыс. раз больше молекул субстрата, который они обрабатывают. И правда похоже на фабрику и полено. На рис. 7.4 показан субстрат А, превращающийся в продукт Б. Однако большинство реакций не происходит изолированно: они сопряжены с последующими, где Б (теперь уже субстрат) превращается в В (новый продукт). Фермент 1 превращает А в Б, а фермент 2 - Б в В.
Рис. 7.4. Простая ферментативная реакция
Ферменты могут работать с разной силой в зависимости от запасов (количества субстрата) и потребностей (количества имеющегося в клетке продукта). Как конвейер, который движется быстрее или медленнее в зависимости от поставки сырья и спроса на готовую продукцию, ферменты меняют скорость превращения субстратов (на профессиональном языке - «активность»). Они могут катализировать даже обратные реакции, превращая продукт в субстрат. В общем, от ферментов зависит, произойдет ли реакция, а если да, то как быстро и в каком направлении.
Ферментативная активность и форма фермента
Исходная форма ферментов напоминает цепочку аминокислот, расположенных в последовательности, которая закодирована в ДНК. Но, поскольку аминокислоты имеют химическое и физическое сродство, цепочка складывается и образует трехмерную форму, как очень длинная нить намагниченных бусин (рис. 7.5).
Рис. 7.5. Компьютерная модель фермента цАДФ-рибозы-гидролазы (CD38)
Один из способов корректировки ферментативной активности - изменение формы фермента . Это имеет серьезные последствия, потому что меняет его химические и физические свойства, а также способность модифицировать скорость реакции. Многие ученые-энзимологи поэтизируют быстроту, с которой ферменты меняют конфигурацию для выполнения своих задач. Вот показательная статья из New World Encyclopedia (http:// www. newworldencyclopedia. org):
Чтобы фермент был функционален, он должен принять трехмерную форму. Как происходит этот сложный процесс, остается загадкой. Небольшая цепочка из 150 аминокислот образует фермент, имеющий невероятное число возможных конфигураций: если проверять по 1012 разных конфигураций в секунду, потребуется 1026 лет, чтобы найти верную...
Но денатурировавший фермент может правильно сложиться за долю секунды, а затем участвовать в химических реакциях… Это показывает ошеломляющую сложность и гармонию Вселенной.
Пытаясь описать неописуемое, автор приводит пример сравнительно небольшой (для фермента) гипотетической молекулы. Скорость складывания фермента из линейной цепочки в готовую к работе сферу феноменальна. Не менее потрясает химическое разнообразие субстратов, которые может метаболизировать один активный фермент. И так же впечатляет огромное число факторов, способных модифицировать структуру ферментов, их число и активность.
Все это показывает глубокую связь между метаболизмом питательных веществ и миром ферментов . Катализируемые ими реакции, бесконечные числом и бесконечно переплетенные, контролируются нутриентами и связанными соединениями, число которых тоже бесконечно.
